一种获得高活力的里氏木霉融合纤维素酶的方法及重组菌株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体设及一种获得高活力的里氏木霉融合纤维素酶的 方法及重组菌株。
【背景技术】
[0002] 植物来源的生物质产量高、种类丰富、可再生，在农业、工业上早已广泛应用，也是 近年兴起并快速发展的生物炼制生产生物燃料和高值化学品的理想原材料。植物生物质中 的多糖-纤维素和半纤维素-需要先被降解形成简单的寡糖或单糖，方可被各种工程微生 物（如大肠杆菌、酿酒酵母和运动假单胞菌等）发酵、利用和转化成目标分子。常综合采用 物理（如高溫、高压）、化学（如离子液）和生物（酶解）等多种方法W处理植物生物质并 高效降解纤维素和半纤维素。生物降解纤维素和半纤维素需要纤维素酶和半纤维素酶的协 同作用。近年来，虽然已有许多降解纤维素的新酶得到发现，但现在饲料、纺织和生物炼制 等许多行业中所使用到的纤维素酶仍然主要来自于丝状真菌里氏木霉。
[0003] 里氏木霉的纤维素酶最适作用抑为5. 0,最适溫度为50度。里氏木霉纤维素酶的 结构域多W" 1个催化结构域+1个纤维素结合结构域"组织，采取单个、游离酶的策略来水 解纤维素。
[0004] 本发明对里氏木霉的纤维素酶系统进行工程改造，W期提高其降解纤维素的效 率，将里氏木霉的外切纤维素酶和内切纤维素酶行融合表达。
【发明内容】
阳〇化]本发明的目的是提供一种获得高活力的里氏木霉融合纤维素酶的方法。
[0006] 本发明的再一目的是提供表达高活力的里氏木霉融合纤维素酶的重组菌株。
[0007] 根据本发明的获得高活力的里氏木霉融合纤维素酶的方法包括在合适的宿主细 胞中融合表达来自里氏木霉的融合纤维素酶基因（cbhi-egl和cbhi-egll)的步骤。
[0008] 根据本发明的提高纤维素酶降解纤维素能力的方法，将CbhI基因片段和egl基因 片段、CbhI基因片段和egll基因片段串联拼接，构建过表达cbhi-egl和cbhi-egll融合 基因的重组质粒，并将其转入合适的微生物宿主细胞中进行表达。
[0009] 其中，CbhI基因片段的核巧酸序列如SEQIDNo. 1所示：
[0015] 根据本发明的【具体实施方式】，设计引物，从里氏木霉TU-6的cDNA中扩增Cbhl基 因片段、egl基因片段和egll基因片段，然后通过Over-lapPCR的方法将Cbhl基因片段与 egl基因片段、egll基因片段分别进行连接，获得cbhi-egl和cbhi-egll融合片段。同时 将融合片段和PPIC9 丫质粒载体分别进行SnaBI和NotI的双酶切，电泳回收运S个片段。 将回收片段pPIC9 丫分别与cbhi-egl和cbhi-egll回收片段在DNA连接酶的作用下进行 连接，然后转化大肠杆菌Transl感受态。挑取筛选平板上的转化子，通过PCR及质粒测序 的方法验证cbhi-egl和cbhi-egll分别成功重组到pPIC9 丫质粒上。将含有重组质粒的 转化子接种，提取重组质粒PPIC9 丫 -C化I-egl和PPIC9 丫 -C化I-egll，然后转化毕赤酵母 GS115菌株。通过测酶活的方法筛选到成功表达CBHI-EGI和CBHI-EGn融合蛋白的阳性转 化子。表达融合纤维素酶CBHI-EGI和CBHI-EGII的转化子在BMMY培养基中诱导培养2天 后，其纤维素酶的滤纸酶活分别为5583U/ymol和8405U/ymol;PASC酶活分别为：505抓/ ^111〇1和 142721]/^111〇1;〔1(：酶活分别为：119391]/^111〇1和 185941]/^111〇1;大麦葡聚糖的酶 活分别为：14023U/ymol和29783U/ymol;其活性均较单独两个酶的协同作用的酶活提高 了约1-3倍。
【附图说明】
[0016]图 1 显示pPIC9 丫 -cWiI-egl和pPIC9 丫 -cWiI-egll重组质粒构建；
[0017]图 2 显示pPIC9 丫 -cWiI-egl和pPIC9 丫 -cWiI-egll重组质粒酶切验证，M: DNA分子量；1，3, 5分别为：未酶切质粒pPIC9 丫，重组质粒pPIC9 丫 -ct)hl-egl，重组质 粒PPIC9 丫-cWiI-egll;2,4,6 分别为：被双酶切的质粒PPIC9 丫，PPIC9 丫-cWiI-egl， pPIC9y-cbhi-egll；
[0018] 图3显示转化子摇瓶发酵液的纤维素酶酶活测定，A:滤纸酶活；B:PASC酶活；C: CMC-Na酶活；D:大麦葡聚糖酶活。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1构建表达里氏木霉来源纤维素酶的重组质粒PPIC9丫-C化I-egl和 pPIC9丫-cbhl-egll
[0020] 构建pPIC9 丫 -cWiI-egl和pPIC9 丫 -cWiI-egll，经转入毕赤酵母GSl15 菌株中，在 AOXl启动子的驱动下，转录出mRNA，并翻译成CBHI-EGI和CBHI-EGII融合蛋白。
[0021] pPIC9 丫-C化I-egl的质粒构建示意图如图I所示。 阳0。] CbhI基闲片段的扩蜡
[0023]W里氏木霉化-6 的cDNA为模板，WTrcbhl(SnaBI)F(5' -GGTACGTACAGTCGGCC TGCACTCTCCAATCGGAG-3'）和Trcbhl-eglR(5'-GGTACCCGGTTGCTGCAGGCACTGAGAGTAGTAAGG GT-3'）或Trcbhl-eg2R(5' -CCAGACAGTCTGCTGCAGGCACTGAGAGTAGTAAGGGT-3')为引物分别 对CbhI基因片段进行扩增。
[0024]PCR反应条件为：95°CX5min预变性；94°CX30s，55°CX30s，72°CXImin, 32 个 循环；72°CXlOmin;4°C保存。在1%琼脂糖胶上电泳，切下PCR产物中的目的条带，纯化 DNA。 阳做]egl基闲片段的扩蜡
[0026]W里氏木霉化-6 的cDNA为模板，WTreglF巧'-TACTCTCAGTGCCTGCAGCAACCGGGTA CCAGCACCCC-3'）和Tregl(NotI)RG'-GGGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAGGCATTGCGAG TAGTAGTCGTTGC-3'）为引物对egl基因片段进行扩增。
[0027]PCR反应条件为：95°CX5min;94°CX30s，55°CX30s，72°CXlmin，32 个循环； 72°CXlOmin;4°C保存。在1%琼脂糖胶上电泳，切下PCR产物中的目的条带，纯化DM。 阳0巧]egll基闲片段的扩蜡
[0029]W里氏木霉化-6 的cDNA为模板，WTreg2F保-TACTCTCAGTGCCTGCAGCAGACTGTCT GGGGCCAGTGT-3')和Treg2(NotI)RG'-GGGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTTCTTGCGAG ACACGAGCTGACC-3')为引物对egl基因片段进行扩增。
[0030]PCR反应条件为：95°CX5min;94°CX30s，55CX30s，72°CXlmin，32 个循环； 72°CXlOmin;4°C保存。在1%琼脂糖胶上电泳，切下PCR产物中的目的条带，纯化DM。
[0031] dPIC9Y-cMiI-egl巧dPIC9Y-cMiI-egll质粒的构律
[0032] 将从里氏木霉TU-6的cDNA中扩增所得到的Cbhl基因片段和egl基因片段或 egll基因片段通过Over-lapPCR的方法，将Cbhl基因片段与egl基因片段、egll基因片 段分别进行拼接，获得cbhi-egl和cbhi-egn融合片段。同时将融合片段和PPIC9 丫质粒 载体进行SnaBI和NotI的双酶切，电泳回收运S个片段。将回收片段PPIC9 丫分别与 cbhi-egl和cbhi-egll回收片段按3:1的摩尔比，在DNA连接酶的作用下进行连接，然后 转化大肠杆菌Transl感受态。挑取筛选平板上的转化子，通过PCR及质粒测序的方法验证 cbhi-egl和cbhi-egll分别重组到pPIC9 丫质粒上，成功获得重组质粒pPIC9 丫 -ct)hl-egl 和PPIC9 丫-C化I-egll(如图1所示）。将含有重组质粒的转化子接种于50ml含有氨节的 LB培养基中，并于37°C，180巧m培养16h。提取重组质粒，备用于转化。
[0033] 实施例2.重组质粒pPIC9 丫 -cWiI-egl和pPIC9 丫 -cWiI-egll双酶切验证
[0034]将PPIC9 丫 质粒，PPIC9 丫 -cWiI-egl重组质粒和PPIC9 丫 -cWiI-egll重组质粒分 别进行SnaBI和NotI双酶切；20y1的反应体系：1y1的SnaBI，1y1的NotI，2y1的 lOXbuffer，10y1的质粒和6y1的(1地2〇,在30°C水域中反应化。取3y1的酶切产物和 未酶切的质粒，在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，酶切质粒均出现和预期一致大小的DNA条带 (如图2所示）。
[0035] 实施例 3.将pPIC9 丫 -cWiI-egl和pPIC9 丫 -cWiI-egll质粒转化毕赤酵母GS115 菌株及阳性转化子的筛选
[0036] 毕赤酵母GSl 15荫株的转化
[0037]将pPIC9 丫 -cWiI-egl和pPIC9 丫 -cWiI-egll质粒转化毕赤酵母GS115 菌株。
[0038] 转化子的诱导培养
[0039]用灭菌的牙签挑取MD板上的转化子，按次序将带菌体的牙签内置3ml的BMGY培 养基的离屯、管中，在30°C、220rpm摇床中振荡培养4她；将离屯、管中培养的菌液W4, 50化pm 离屯、5min，轻柔弃上清，向菌体中加入Iml的BMMY培养基，在30°C、220rpm摇床中诱导培养 4她；将诱导的转化子的培养液转移至2血邱pendcxrf管中，12, 00化pm离屯、2min，收集上清 液（即发酵液），备用于纤维素酶的酶活检测，筛选出有酶活力的表达菌株。 W40] 所述MD培养基的成分包括：2%葡萄糖，20%琼脂糖，115°C灭菌30min，冷却后加 入相应体积滤灭的10XYNB(13. 4mg/ml)和1000 X生物素0). 4mg/ml);
[0041] 所述BMGY培养基的成分包括：2%蛋白腺，1%酵母粉，1%甘油，121°C灭菌20min， 冷却后加入相应体