一种突变型Sus scrofa猪源胰蛋白酶及其编码基因及获取方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子酶学与生物技术，更具体设及一种高热稳定性高活性SusScro化 猪源膜蛋白酶的编码基因W及该酶的获取方法金和应用。
【背景技术】
[0002] 膜蛋白酶巧C. 3. 4. 21. 4)系一种223个氨基酸残基组成的单链丝氨酸蛋白酶，其 前体膜蛋白酶原包含一段15个氨基酸组成的的信号肤，其后还包含一段8个氨基酸的前导 肤，即酶原激活肤。膜蛋白酶原产生于脊柱类动物膜脏细胞中细胞粗面内质网上的核糖体， 经过高尔基体的运输，进入膜腺运输管，最终被释放到肠腔，在肠腔里利用十二指肠肠粘膜 细胞所分泌的肠激酶特异性识别膜蛋白酶原序列N端短肤链D孤DK，并切开D孤DK序列中赖 氨酸C端，切除其WLys-Ile为分割的前导肤，导致膜蛋白酶原=维结构改变，可特异性激 活膜蛋白酶原成为具有催化活性的膜蛋白酶。
[0003] 作为一种重要工具酶，膜蛋白酶作用溫和，且高效无污染，已被广泛应用于各个领 域。如在医学领域，膜岛素原转化为膜岛素的应用，用作口服药治疗肠胃素乱，用作消炎药 减轻炎症，用作清创剂，可清除创伤部位坏死的组织，也可用作血栓溶解剂治疗血栓素乱。 在食品应用领域，可水解一些食品工业里重要的动植物蛋白，如妈蚁蛋白，蚕蛹蛋白及植物 叶蛋白等等。另外，膜蛋白酶也广泛用于多种生物技术过程，例如表面附着细胞的分离，流 感病毒的生产，荷尔蒙的水解和用于产生其他蛋白。
[0004] Q-Ioop是蛋白质表面的一种非常规的二级结构形式，通常由6~16个氨基酸残 基构成，因结构类似希腊字母Q而得名。Q环盖子结构相比于a-螺旋，0 -折叠，reverse 化rn等结构含有更少的氨键，因此具有很高的灵活性。通常Q-Ioop与蛋白质功能及分 子的识别有关，当底物或者抑制物与其结合后Q-Ioop灵活性才会得到控制。运一结构在 诸多酶分子结构中发现，对于酶催化反应来说具有极其重要的意义。诸多文献酶活性区 Q-loop点突变结果表明，不同的突变选择对于蛋白质稳定性，如解折叠Tm值，会有不同程 度的影响。 W05] 毕赤酵母中N糖基化是蛋白质翻译后的常见修饰，潜在的糖基化位点 (Asn-Xaa-Ser/T虹，Xaa代表除脯氨酸外的任意氨基酸）的天冬酷胺约70 % -90 %是N糖基 化的，若Xaa位置为Pro脯氨酸，疏水氨基酸如色氨酸或苯丙氨酸，则糖基化作用是受抑制 的，带负电氨基酸如谷氨酸和天冬氨酸会部分抑制糖基化，然而正电荷氨基酸如赖氨酸，组 氨酸和精氨酸则会促进糖基化作用。N糖基化修饰的起始位置在内质网，由长醇焦憐酸盐 弓恃寡糖单位Glc3MangGlcNAc2(其中Glc=葡萄糖；GlcNAc=N-乙酷葡糖胺，Man=甘露 糖）连接于天冬酷胺的酷胺基上。随后寡糖连修整成为MansGlcNAcz。有文献报道，糖链的 连接对于蛋白质的区域稳定性具有重要作用。
[0006] 在膜酶酶切后未知蛋白短肤质谱分析中，未知蛋白质需经变性后才能有效被切 害d。变性蛋白通常是通过加入化学试剂，增加额外工序，运样就使得分析步骤复杂化。如果 在高溫条件下膜酶能保持活性，那么未知蛋白在高溫解折叠的同时进行酶切反应将会避免 变性剂的使用，运样则大大简化后续分析。同时，膜酶也是潜在的药用蛋白，糖基化蛋白可 能降低蛋白质的免疫原性，提高其药用价值。所W，总得来说，如果能通过糖基化的方法提 高膜蛋白酶热稳定性，那么将突破膜酶的应用瓶颈，提高膜酶的实用价值。因此有必要针对 膜酶热稳定性进行理性设计探索，W期提高其热稳定性。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一个要解决的技术问题是进一步提高膜蛋白酶的稳定性，对原有的野 生型SusScro化猪源膜蛋白酶酶进行突变，得到热稳定性显著提高的突变酶，提高其应用 价值。
[0008] 本发明的第二个要解决的技术问题是提供编码上述膜蛋白酶突变体的编码基因。
[0009] 本发明的第=个要解决技术问题是提供一种膜蛋白酶酵母工程菌的构建方法。
[0010] 本发明所要解决的技术问题是通过W下技术方案来实现的：
[0011] 一种具有SusScro化猪膜蛋白酶活性的蛋白质，其氨基酸序列为SEQIDNO. 1。 阳012] 本发明的技术方案概述如下：
[0013] 第一步热稳定性提高的膜蛋白酶重组质粒的构建
[0014] (1)在所构建的野生型重组SusScro化猪源膜酶原表达载体pPIC9K-巧T巧（由北 京金唯智有限公司全基因合成）的基础上，去除原基因N端前25个氨基酸酶原激活肤段中 的前20个氨基酸，N端激活肤剩余序列为肠激酶识别位点值D孤K)。缩短后的Susscro化 猪源膜蛋白酶原序列经EcoRI和NotI双酶切并插入PPIC9K相应的单克隆位点。
[0015] (2)围绕Susscro化猪源膜蛋白酶活性区氨基酸Asp89所在Q环化is78~ Met91)及侧翼链，W糖基化识别序列Asn-Xaa-Ser/T虹为模板，故选取距离活性位点氨基 酸Asp89较近的82位Asn作为拟糖基化位点。
[0016] (3)为了突出糖基化的作用，尽量减少突变所造成的蛋白质原始结构破坏，在依据 糖基化识别序列Asn-Xaa-Ser/T虹对原始序列进行改造中，Ser在Q环中的出现频率比 T虹出现频率高UW，故最终确定的拟突变位点为N84S。
[0017] 编码中所述蛋白质的基因，DNA序列为SEQIDNO. 2。
[0018] 重组载体获取方法步骤如下：
[0019] 1)含有野生型Susscro化猪膜蛋白酶基因的重组载体的构建：
[0020] (1)化含有Susscro化猪膜蛋白酶基因的质粒PPIC9K-巧T巧的核巧酸序列，结合 质粒PPIC9K(实验室自备）的多克隆位点与Susscro化猪源膜蛋白酶基因的限制性内切 酶位点设计引物；
[0021] (2)W含有Susscro化猪源膜蛋白酶基因的质粒PPIC9K载体为模板，进行PCR扩 增；含有Susscro化猪源膜蛋白酶基因的PCR扩增产物纯化后，用限制性内切酶EcoRI和 NotI(购自Thermo公司）进行双酶切，酶切产物与用同样酶切的载体PPIC9K用T4连接酶 (购自Thermo公司）进行连接；连接产物转化进入大肠杆菌TOPlO(购自康为世纪有限公 司）；
[0022] (3)在固体培养基上随机挑取几个单菌落接种至含卡那霉素（购自鼎国昌盛有限 公司）的LB液体培养基中，37°C震荡培养12h，提取质粒；利用EcoRI和NotI进行双酶切 验证；验证成功的克隆子进行测序验证；
[0023] 2)快速定点突变方法引入突变位点：
[0024] (1)设计引物，引物中包含使猪膜蛋白酶基因中84位天冬氨酸密码子改变为丝氨 酸密码子的突变点；
[00巧](2)W上述步骤1)获取的含有野生型Susscro化猪源膜蛋白酶基因的表达载体 为模板，进行PCR扩增，扩增产物为突变型重组表达载体PPIC9K-巧T巧-N84S;该突变型重 组表达载体内含有SEQIDNO. 2所示DNA序列。
[00%] 第二步热稳定性提高的膜蛋白酶工程菌的构建
[0027] 将突变后的重组质粒PPIC9K-巧T巧-N84S经Sail酶切线性化电击转入GS115毕 赤酵母（实验室自备），构建高效表达类膜蛋白酶的组成型毕赤酵母突变菌株。
[0028] 毕赤酵母转化常采用的是电转方法
[0029] 酵母感受态细胞的制备
[0030] 接种50ul保存酵母GS115菌液于SmlYPD培养基，30°C，300;rpm，摇2比，至ODgoo至 1. 0 ;取IOOul活化菌液，分别接种于2瓶盛有100mLYTO液体培养基的500mlS角瓶，30°C， 过夜至ODe。。= 1. 0~1. 3 (1化左右）（测量OD时，需用无菌Yro稀释菌液值OD值在0. 2~ 0. 8之间，再乘相应稀释倍数，一般按菌液：无菌YPD= 1:5稀释）；4°C，1500g/500化pm，离 屯、5min，弃上清；100mL冰预冷无菌水重悬菌体；4°C，1500g/5000巧m，离屯、5min，弃上清； IOml冰预冷IM山梨醇重悬菌体；4°C，1500g/5000巧m，离屯、5min，弃上清；50ml冰预冷无 菌水重悬菌体；4°C，1500g/500化pm,离屯、5min，弃上清；IOml冰预冷IM山梨醇重悬菌体； 4°C，1500g/5000巧m，5min，离心弃上清（用移液枪吸除上清）；200y1冰预冷IM山梨醇重 悬菌体，无菌预冷的1. 5ml化管，按每管80y1分装，W备转化（加上菌体体积，预计100mL 培养液得到400y1感受态，能转化5杯）。
[0031] 注：感受态细胞尽量现用现做，尽量不放置于-80°C保存。
[0032] 线性化重组载体电转化酵母GSl15感受态 阳03引实验前一天，用75 %酒精浸泡电转杯3~地，超声震荡处理3~4min，用去离子 水冲洗干净，将点转杯及杯帽放置于超净台上，紫外照射过夜。同时提前将MD平板做好，封 口膜封板，放于4°C，保存备用，使用时事先将平板取出，放置于超净台上，升溫至室溫；将 80Ji1酵母感受态细胞与5~10Jig线性化质粒混合，放入冰预冷的0.2cm电转杯中；将上 述电转杯在冰上解育15min，迅速进行电转。电转条件：电压1. 5kV，电阻400Q，电容25yF， 电击持续5.Omsec;迅速加入Iml冰预冷的IM山