专利名称：可与人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶结合的抗体以及其利用方法
技术领域：
本发明涉及与人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶结合的抗体，使用该抗体的人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶的检测或测定系统，使用抗体的诊断药剂，以及使用该抗体的治疗药剂。
背景技术：
近年来已在人类的慢性呼吸道炎症患者的痰中纯化(参考特开平7-067640号公报以及S.Yasuoka et al.，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，16p300-308，1997)人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶(HumahAirway Tryptase，以下亦称为HAT)，其氨基酸序列以及cDNA序列已明确(参考特开平8-89246号公报，US-5804410，EP-699763，以及Yamaoka K.et al.，J.Biol.Chem.，273(19)，11895-11901，1998)。这种酶的体外活性已得到研究。由于这种酶对支气管上皮细胞分泌IL-8或GM-CSF等细胞因子具有增强作用以及对粘液绒毛运动的作用(寺尾纪子，1998年度日本呼吸器学会)可想到与呼吸道炎症的病态的可能关系。由具有纤维蛋白原的分解活性以及血纤维蛋白溶酶原活性因子(原尿激酶)活化作用等酶活性(吉永纯子，1998年度对病态与治疗的蛋白酶与干扰素研究会(Conference onProteases and Inhibitors in Pathophysiology and Therapeutics)，可考虑通过形成呼吸道粘膜面的纤维蛋白而具有抗炎症作用，或者可改善慢性呼吸道疾病的病态，用对于癌细胞转移等可能有关。
发明内容
本发明的课题在于获得上述可检测出HAT的抗体，以及使用其抗体的测定系统的构建。由此可测定HAT的生物体内的浓度或可调查组织或细胞的HAT分布，即可诊断炎症性的疾病或癌症。本发明的课题为中和HAT活性的抗体，以及抑制HAT活化抗体的取得。中和HAT活性的抗体或抑制HAT活化的抗体，可使用于对HAT的凝聚、纤溶系统的作用、对呼吸道病态的作用、对呼吸道炎症的作用、有关癌细胞增殖或转移的作用、对粘液纤毛运动的作用、抑制或修饰抗病毒感染作用等生理作用的改善或治疗疾病。这些抗体可作为慢性呼吸道炎症(COPD，气喘)、凝聚、纤溶异常、癌症等疾病的新颖性治疗药剂、诊断药剂。
本发明者取得与HAT结合的单克隆抗体以及多克隆抗体，成功地用于生物体内HAT的检测。且发现所取得的抗体具有HAT中和活性，故完成本发明。
本发明是结合人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶的抗体。本发明包括可用于酶免疫测定法而测定生物体内的天然人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶的抗体，或含有可使用于western印迹而检测出生物体内的天然人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶的抗体。本发明的抗体的表位在人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶的氨基酸序列第187至第418号之间。
本发明中“人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶”为特开平8-89246号公报所揭示的含有人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶的cDNA序列的一部分或全部的蛋白质。人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶氨基酸序列号码则依据Yamaoka K.et al.，J.Biol.Chem.，273(19)，11895-11901，1998所描述的氨基酸序列号码。
另外本发明提供一种使用人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶结合的抗体，检测或者测定人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶的方法，以及使用此抗体的人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶的酶免疫测定法。
本发明提供一种治疗药，其含有抑制人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶的活化的抗体，以及含有中和人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶活性的抗体的治疗药。
本发明还提供一种动物细胞，可产生与人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶结合的抗体。
附图简述
图1表示对本发明的抗HAT抗体的中和活性的评估结果。
图2表示对使用本发明抗HAT多株抗体的测定系统中重组HAT的标准曲线。
图3表示使用本发明抗HAT多株抗体的测定系统所测定的喀痰中HAT的结果。
图4表示调查对本发明抗HAT单克隆抗体与HAT多克隆抗体的重组HAT的液相抗原反应性的结果。
图5表示对使用本发明抗HAT单克隆抗体与抗HAT多克隆抗体的测定系统中重组HAT的标准曲线。
实施发明的最佳方式本发明的多克隆抗体，可由下述方法取得。即，制备抗原蛋白HAT时，可依据特开平7-067640号公报以及S.Yasuoka et al.，Am.J.Respir.Cell MOl.Biol.，16，p300-308，1997所描述的方法，由痰中等生物样品或产HAT的培养细胞中纯化取得，或依据特开平8-89246号公报、US-5804410、EP-699763、以及Yamaoka K.et al.，J.Biol.Chem.，273(19)，11895-11901，1998所描述的方法产生重组HAT，再通过纯化即可获得。
再将纯化HAT与佐剂同时对动物作重复的腹腔内注射或皮下注射，引起动物的免疫反应。作为所使用的动物，优选哺乳类，更优选兔子、山羊、绵羊、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠。其中以兔子为最优选的。
再从已免疫的动物中采血分离血清成份，依常法以蛋白质A柱纯化IgG，取得抗HAT多克隆抗体。
本发明的单克隆抗体可依据下述方法制备。即，基本上为Galfre以及Milstein，酶学方法，第73卷，Academic Press，New York(1981)；James W.Goding，单克隆抗体原理和方法，Academic Press，Orlando，Florida(1986)；Current Protocols in MolecularBiology，F.M.Ausubel等共编，Wiley Interscience，New York(1987)等所描述的方法。
制备单克隆抗体时以纯化抗原蛋白质为佳。此纯化蛋白质也可用于抗体效价的检定。制备本发明的单克隆抗体时所使用的重组HAT的表达方法以及纯化方法，如特开平8-89246号公报所详述。
再将纯化重组HAT与佐剂同时作重复动物的腹腔内注射或皮下注射，而引起动物的免疫反应。作为使用的动物以哺乳动物为优选的，大鼠以及小鼠为较优选的。最优选的为balb/c小鼠。
再从免疫的动物中取出B淋巴细胞，如上述文献所记载的方法，与具有无限增殖能力的动物细胞进行细胞融合。作为此融合的对象，较优选的细胞株为小鼠的骨髓瘤细胞，以P3-X63-Ag8-Ul骨髓瘤细胞(ATCC CRL1597)为最优选的。
细胞融合后，依常法在适当的选择性培养基中继续培养，在生存的细胞中以ELISA法等选出产生与重组HAT结合的抗体的细胞株。对所得的单克隆抗体产生细胞作数次的分选，可选出具有单克隆性以及抗体产生能力稳定的株。作为分选法可使用极限稀释法、软琼脂糖法以及使用细胞分分选器法等。
对所得的重组HAT的单克隆抗体，可由以下方法选出具有活性的抗体。即，以抗小鼠IgG(Fc)抗体结合抗HAT单克隆抗体的ELISA用于96孔板中，加入重组HAT，洗净后，与萤光底物反应后测定HAT活性，进而筛选可中和HAT活性的抗体。使用经添加酶标识后的抗HAT兔子多克隆抗体二抗，可筛选液相抗原反应性较高的抗体。
本发明的单克隆抗体用于人类治疗时，使用人类型的单克隆抗体是优选的。人类型的单克隆抗体中除人类的单克隆抗体外，还包括所谓的嵌合型抗体，即唯一的可变区域来自小鼠等动物的氨基酸序列，恒定区域中使用人类氨基酸序列的抗体。其他，根据所谓CDR图示技术的单克隆抗体，即仅互补性决定区域来自动物的氨基酸序列，其他序列皆来自人类，其包含于人类型的单克隆抗体中。
嵌合型抗体或经由CDR图示技术的单克隆抗体，根据本发明基因重组技术，亦可容易经由产生本发明的单克隆抗体的小鼠的融合瘤中取出对应的基因，与人类抗体基因作重组，导入动物细胞后使其表达而容易制得。例如Int.J.Cancer，44，424-433(1989)，Pro Natl AcadSci USA，87，8095-8099(1990)所记载。以未变化氨基酸序列，使单克隆抗体的产生效率提升为目的，由融合瘤中取出对应本发明抗体的基因可于其他动物细胞中表达。本发明的单克隆抗体亦含有经由这些基因重组技术所得的单克隆抗体以及产生单克隆抗体的动物细胞。
作为人类型单克隆抗体的制备方法，除上述方法之外，也有将人类的B淋巴细胞与人类或小鼠的骨髓瘤细胞或异型骨髓瘤(neteromyeloma)细胞进行细胞融合的方法。作为与人类的骨髓瘤细胞进行细胞融合的方法，已在J.Immunol Methods，61，17-32(1983)中描述，作为与小鼠的骨髓瘤细胞进行细胞融合的方法，已在ProcNatl Acad Sci USA，77，6841-6845(1980)描述，作为与异型骨髓瘤细胞进行细胞融合的方法，已在Pro Natl Acad Sci USA，81，3241(1984)等描述。实施这些方法时，于人类的B淋巴细胞进行细胞融合前，于体外接受刺激是优选的。刺激的方法，可按BiochemBiophys Res Commun，135，495(1986)所记载的方法实施。
其他作为人类单克隆抗体的制备方法，可举出经由EB病毒进行人类B淋巴细胞的转化作用的方法。
即，本发明的单克隆抗体以及多克隆抗体是可检测以及测定生物体内的以及存在于细胞中的HAT的抗体，或可中和HAT活性的抗体，或抑制HAT活性化的抗体，可为任一种，或可由任何方法所制得。该领域的技术人员，变化其种类或其制备方法而获得具有本发明单克隆抗体活性并非难事。
本发明的单克隆抗体以及多克隆抗体可使用于HAT的检测以及测定。即，经由如ELISA法或RIA法的免疫化学测定方法，即可测定出HAT浓度。例如使用于固相边(Solid phase side)固定抗HAT单克隆抗体的培养皿，可高感度地测定出HAT。可经由免疫组织染色、免疫细胞染色、流式细胞仪等可检测或测定HAT。
使用本发明的单克隆抗体以及多克隆抗体，可测定与膜结合的HAT。膜结合型HAT的活性可通过区分活性与非活性类型而得到测定。实施例以下以实施例详细说明本发明，但非可限定本发明。[实施例1]HAT的制备对痰中天然HAT的纯化，则依据特开平7-067640号公报以及S.Yasuoka et al.，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，16，p300-308，1997中描述的方法。对于纯化重组HAT，则依据特开平8-89246号公报，US-5804410、EP-699763以及Yamaoka K.et al.，J.Biol.Chem.，273(19)，11895-11901，1998所描述的方法进行。即，培养昆虫细胞(Tn-5细胞)至单层为5×106个/ml的密度，除去培养基后，每细胞按MOI＝0.2-0.5加入含有重组HAT表达杆状病毒(#1B3)的无血清培养基使其感染，经3天培养后，使HAT表达。欲确认已表达的蛋白质，使用SDS-PAGE以及抗HAT-N-19肽抗体的western印迹(Anal.Biochem.，112，195-203，1981)进行。经离心分离法(约500×g)将上清与细胞分开，上清液经极限过滤法(富士滤器，FiltronMiniset，分级分离分子量300kDa)将病毒除去后，以Tris盐酸-50mM氯化钠缓冲液(pH8.0)透析或稀释过液。细胞悬浮于50mM Tris盐酸-500mM氯化钠缓冲液(pH8.0)中，加入Triton使最终浓度成1％X-100，于0℃下放置60分钟，溶解细胞。细胞残渣经离心分离后，于50mM Tris盐酸-500mM氯化钠缓冲液(pH8.0)中透析或稀释过夜。将此溶液用50mM Tris盐酸-500mM氯化钠缓冲液(pH8.0)平衡后倒入苯甲脒亲和柱(pharmacia公司制)，以同缓冲液洗净后，以10mM盐酸-500mM氯化钠溶液(pH2.0)洗脱。对各部分如实施例5(1)所示方法进行胰蛋白酶类蛋白酶活性的测定以及检测。收集主要波峰，进行SDS-PAGE，检测出分子量约为28KaDa的蛋白质，使用抗胰蛋白酶类蛋白酶肽抗体的Wertern印迹确认胰蛋白酶类蛋白酶(参照特开平8-89246号公报，US-5804410、EP-699763、以及Yamaoka K.et al.，J.Biol.Chem.，273(19)，11895-11901，1998)。[实施例2]抗HAT多克隆抗体的取得以抗肽抗体的取得以肽合成机(Applide Biosystems Model 431A)化学合成成熟HAT的1至19残基序列之N末端具有半胱氨酸的20残基肽(序列号1)，此合成肽溶解于10mM磷酸缓冲液(pH7.5)中(10mg/ml)，与10mg的马来酰亚胺活化血蓝蛋白(Boehringer MannheimBiochemica公司制)作25℃下2小时的恒温培养后，反应溶液以10mM磷酸缓冲液(pH7.5)作透析。将与血清蛋白结合的肽施药于家兔的皮下(0.5mg/1次)。隔2周进行6次重复施药。采全血制备成血清后，以蛋白质A Sepharose4B柱(Pharmacia公司制)纯化得到抗HAT多克隆抗体(抗-N19PAb)。(2)抗重组HAT抗体的取得由实施例1制备的重组HAT(40μg/1次)与弗氏完全佐剂(BACTO公司制，1∶1)同时于每2星期对家兔作皮内施药。此进行4次后，采全血得到抗血清。将此血清依常法以蛋白质A Spharose4B柱(Pharmacia公司制)纯化IgG，得到抗HAT多克隆抗体(anti-rHATPAb)。[实施例3]抗HAT单克隆抗体的制作(1)用重组HAT对小鼠进行免疫由实施例1制备出的重组HAT10-20μg/次/只与弗氏完全佐剂(BACTO公司制，1∶1)同时于每2星期对Balb/c鼠(7周，雄)作腹腔内施药。进行4次后，第5次将细胞融合的3天前作重组HAT溶液50μl的静脉内施药。由小鼠的尾静脉采血，于37℃下作30分钟的恒温培养后，以3000rpm 10分钟的离心回收血清，小鼠血清中的抗HAT抗体效价用ELISA测定。以下对此方法作详述。
于96孔ELISA的培养皿(Falcon3912，Becton Dickinso公司)中加入50μl以0.05M Na2CO3缓冲液(pH10.5)稀释1μg/ml的重组HAT，在4℃下恒温培养过夜。以含有0.05％Tween20的PBS洗净3次后，以含有3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS于室温下处理1小时。以含有0.05％Tween20的PBS洗涤3次后，加入50μl的抗体，于室温下反应1小时。以含有0.05％Tween 20的PBS洗净3次后，加入50μl含有3％BSA的PBS稀释至1000倍的碱性磷酸酶结合公山羊抗鼠IgG抗体(ZYMED公司)，于室温下反应1小时。含有0.05％Tween20的PBS洗净3次后，以PNPP(对硝基苯基磷酸盐，和光纯药)于室温下反应1小时，测定405nm的吸光度。(2)经细胞融合制作杂交瘤在细胞融合前将小鼠杀死，将其脾细胞于PBS中进行研磨，残渣以尼龙过滤器过滤后，离心后用PBS洗净。此脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(P3X63Ag8U.1)依常法(Kohler，Milstein；Nature，256，495-497(1975))进行细胞融合。
即，5×107个脾细胞与5×106个小鼠骨髓瘤细胞P3×63Ag8U.1(P3Ul)用RPMI1640培养基洗净后，以1500rpm作5分钟离心，得到细胞沉淀。2分钟内加入1ml的35％聚乙二醇液体(5.75ml的RPMI 1640培养基+3.5ml的聚乙二醇+0.75ml的二甲基亚砜)，将此细胞温和地悬浮其中。2分钟内加入1ml的RPMI 1640培养基后，再于2分钟内加入2ml。其次2分钟内加入4ml的GIT-HAT培养基(含有95μM的次黄嘌呤、0.4μM的氨基喋呤、1.6μM的胸腺嘧啶，以及5％FCS的GIT培养基)后，再于2分钟内加入8ml。于37℃下恒温培养30分钟后，于各孔中加入约104个小鼠腹腔侵出细胞于96孔平底培养皿，于5％CO2中37℃培养。
一周后以GIT-HT培养基(GIT-HAT培养基中除去氨基喋呤)替换一半的培养基，且于5％CO2存在下于37℃培养约1星期，各孔得到数个杂交瘤的菌落。(3)杂交瘤的筛选2星期后以包被重组HAT的平板进行筛选。每含有50μl的重组HAT的50mM Na2CO3缓冲液(pH 10.5)溶液(1μg/ml)注入96孔培养皿(Falcon公司，PVC制)的各孔中，4℃下放置过液。洗净后，200μl的3％BSA/PBS加入各孔中于37℃下作1小时的封闭。再度洗净后各孔中加入50μl的培养上清液，于室温下放置1小时，以0.05％Tween/PBS洗净3次。
再将50μl含有3％BSA以及0.2％脱酯奶粉的PBS稀释至2000倍的羊抗鼠IgG-碱性磷酸酶缀合物(Tago公司)加入各孔中，于室温下放置1小时，再次洗净，每孔中加入100μl以1mg/ml浓度溶解于含有0.25mM氯化镁的1M二乙醇胺缓冲液(pH9.8)的对硝基苯基磷酸二钠(和光纯药)溶液，于室温下反应30分钟。使用96孔的ELISA leader测定器测定405nm的吸光度，(Molecular Davicea公司Vmax)，选择可分泌与重组HAT结合的单克隆抗体的杂交瘤。(4)杂交瘤的克隆对于如此选出的杂交瘤，进行2次的极限稀释法的克隆再进行建株。具体而言，将小鼠腹腔浸出细胞制备出于HT培养基中106个/ml的比例，分注于各孔中，各孔中以0.5个悬浊于HT培养基的程度埋入杂交瘤细胞。在5％CO2的恒温箱中，37℃条件下培养2星期，对该培养上清液以上述ELISA法进行筛选，取出单一菌落而进行建株。(5)杂交瘤的培养以及抗体的纯化由以上操作所得产生抗HAT抗体的融合瘤20克隆中的6克隆适应于含有胰岛素、转铁球蛋白、乙醇胺、亚硒酸盐的无血清培养基的eRDF培养基(Gibco BRL公司)中进行培养，回收培养上清液。将培养上清液中的抗体以蛋白质G柱依常法纯化。(6)HAT单克隆抗体的亚类分型上述(5)操作所得的纯化抗HAT单克隆抗体6克隆，使用Boehringer公司制的IsoStrip(小鼠单克隆抗体的Isotyping Kit)进行亚类分型。其结果断定#A3、#B3、#B5的3克隆为IgGI，#A6、#C2为IgM。对于#C3则不明。[实施例4]利用抗HAT抗体进行Western印迹重组HAT或天然HAT于还原条件下，以SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，硝酸纤维素膜(BIO-RAD公司)上进行Western印迹。以含有3％BSA的PBS于室温下处理过夜，以含有3％BSA的PBS稀释至10μg/ml[实施例2、3]而得到的抗HAT抗体于室温下与印迹产物反应1小时。将硝酸纤维素膜以含有1％BSA之PBS洗净6次后，与以含有3％BSA的PBS稀释至25μg/ml之碱性磷酸酶结合羊抗人IgG抗体(TAGO公司)于室温下反应1小时。将硝酸纤维素膜以含有1％BSA之PBS洗净6次后，与NBT(氯化氮蓝四唑)/BICP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸对甲苯胺盐，PIERCE公司)于室温下反应10分钟使其显色，显示各个抗HAT抗体与重组HAT的结合。Western印迹的反应性，对于单克隆抗体而言，#A3及#B5的反应性较高，#B3的反应性则极低。至于多克隆抗体，抗N-19抗体(anti-N19 PAb)的反应性较高，抗rHAT抗体(anti-rHAT PAb)的反应性较低。又，anti-rHAT PAb并未显示与来自肥大细胞类胰蛋白酶以及胰蛋白酶有交叉反应。且，使用正常兔子IgG作为阴性对照组。[实施例5]HAT中和活性的评估(1)HAT活性的测定方法对1.0ml的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.6)而言，其中含有100μM的胰蛋白酶合成底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA(MCA甲基香豆素酰胺)和0.01％BSA，加入50μl含有HAT的溶液，于37℃下恒温孵育1小时。然后加入1ml的30％醋酸，生成的7-胺基-4-甲基香豆素(AMC)的量以萤光测定定量(荧光460nm，激发380nm)，算出蛋白酶活性。1分钟内生成1pM的AMC定义为1活性单位(1单位＝1pM AMC/分钟)。(2)抗HAT抗体的HAT中和活性之评估对含有2ng/ml的重组HAT，和0.01％BSA的0.5ml 50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)而言，加入50μl的含有抗HAT抗体溶液，于37℃下恒温孵育30分钟。然后加入0.5ml含有200μM的胰蛋白酶合成底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA之50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)，于37℃下恒温孵育1小时。再加入1ml的30％醋酸，生成的7-胺基-4-甲基香豆素(AMC)的量以荧光测定定量(萤光460nm，激发光380nm)，计算抗HAT抗体的蛋白酶活性中和能力。结果如图1所示。实施例2所得重组HAT(昆虫细胞-杆状病毒系统)经免疫所得抗HAT多克隆抗体，确认抗HAT抗体于236μg/ml浓度下具有27％活性抑制效果。[实施例6]HAT测定系统构建1对多克隆抗体的夹心EIA(酶免疫测定)的构建使用由实施例2(B)所得的抗HAT多克隆抗体(anti-rHAT PAb)依照以下的操作进行，构建夹心EIA系统。
(A)辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的制备(1)抗体(F(ab’)2)的制备1ml的含有2.0mg/ml抗体(IgG)的PBS溶液中，加入100μl的1M醋酸缓冲液(pH4.2)与40μg的胃蛋白酶溶解于20μl的同种缓冲液，于37℃下反应4小时。反应终了后，使用以PBS平衡过的交联葡聚糖G25柱(φ2cm×45cm)分离反应产物收集F(ab’)2。(2)抗体(F(ab’)2)的HRP标识2ml含有1mg/ml的抗体(F(ab’)2)之0.01M磷酸、0.15M NaCl(pH7.4)溶液中，加入50μl的N-(m-马来酰亚胺安息香酸)-N-琥珀酰亚胺酯(MBS)的10mg/ml的二甲基甲酰胺溶液，于25℃下反应30分钟。再使用填充交联葡聚糖G-25的柱，以0.1M磷酸缓冲液(pH6.0)进行胶体过滤，分离出马来酰亚胺化抗体及未反应的MBS。另一方面，于2ml的HRP的10mg/ml 1M磷酸缓冲液(pH6.5)溶液中加入120μl的S-乙酰硫氢基琥珀酸酐的60mg/ml二甲基甲酰胺溶液，于25℃下反应2小时。再加入800μl的0.1M Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)、160μl的0.1M EDTA、1.6ml的1M羟氨，于0℃下反应4分钟。其后将反应液放入火棉胶袋，使用含有5mM EDTA溶液的0.1M磷酸缓冲液(pH6.0)、于4℃下透析3天，得到硫醇化HRP。再将2mg的马来酰亚胺化抗体与4mg的硫醇化HRP混合，使用火棉胶袋于冰浴下浓缩至蛋白浓度为4至10mg/ml，于15至20℃下放置过夜。将此液体以Ultrogel AcA44(Pharmacia LKB公司制)填充柱作胶体过滤，得到抗HAT(F(ab’)2)HRP标记抗体。(B)抗体固定化平板的制备充分洗净96孔平板(住友培克来特公司制，MS-3796F/碳素平板)，4℃下放置于抗体的20μg/ml PBS溶液中一整天后，以PBS洗净，4℃下放置于1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液中一整天得到抗体固定化平板。(C)测定系统的构建往上述(B)所制备的抗HAT抗体IgG固定化平板中，添加100μl的纯化重组HAT(标准物质)之以0至1600ng/ml范围含于1％BSA-0.1％脱脂奶粉的10mM PBS(pH 7.2)溶液(样品稀释液)，25℃下恒温孵育4小时。其后，以含有0.05％Tween20的10mM PBS(pH7.2)洗净，将上述(A)所制备的抗HAT(F(ab’)2)HRP标记抗体(500μg/ml)于含1％BSA的10mM PBS(pH7.2)中稀释100倍取100μl稀释液加入每孔中，25℃下恒温孵育2小时。吸除各孔中的溶液后，用含有0.05％Tween20的10mM PBS(pH7.2)洗净，各孔中加入100μl的含有3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和0.02％H2O22.5mM的0.1M磷酸/柠檬酸缓冲液(pH4.3)，于25℃下反应30分钟后，作为反应停止剂于各孔中加入100ul的0.5M硫酸水溶液停止酶反应。然后使用分光光度计测定溶液于波长450nm处的吸光强度，此与标准物质浓度0至1600ng/ml对应制图。结果如图2表示。(D)生物体内成份中HAT检测(1)唾液中HAT的检测使用上述(C)的测定系统检测人唾液中的HAT。将人的唾液以15000rpm离心15分钟，取上清作为测定样品。测定全部6种原液及用含有1％BSA-0.1％脱酯奶粉的10mM PBS(pH7.2)溶液(样品稀释液)稀释至16倍的溶液。因其中3样品的测定值较低故采用原液值，其他3检体则采用16倍稀释的值作为唾液中HAT浓度。测定结果与样品中HAT活性(胰蛋白酶)同时列于表1中。
表1
*重组HAT表示胰蛋白酶类蛋白酶活性(2)咳痰中HAT的检测痰由慢性呼吸道疾病患者中取得，以9倍的生理盐水稀释后，经匀浆处理，于10,000×g下离心10分钟，其上清液作为测定样品。将稀释20倍进行测定，结果如图3所示。其中粘液性-粘液脓性痰从以下病患中采样。
CB；慢性支气管炎SecCB；继发性支气管炎BA；支气管哮喘BE；支气管扩张症DPB；弥漫性泛细支气管炎又，脓性痰则如以下的病患中取样BE；支气管扩张症DPB；弥漫性汽细支气管炎在图3中，M表示粘液性痰，P表示粘液脓性痰。
脓性痰表现出比粘液性痰较低的测定值。2.单克隆抗体以及多克隆抗体的夹心EIA的构建(1)各抗HAT单克隆抗体的液相抗原反应性的评估经亚类分型为IgG1型的#A3、#B3、#B5等三种抗HAT单克隆抗体，在液相中进行对重组HAT的结合性的评估。
评估方法则依据实施例6的1.(B)(C)进行。即，在96孔平板中加入50μl/孔的各抗HAT单克隆抗体的1或5μg/ml PBS溶液，4℃下放置过液，以固定平板上的抗体。
在已制备的抗HAT单克隆抗体IgG固定化平板中，加入100μl的纯化重组HAT(标准物质)以0至1600ng/ml范围含于1％BSA-0.1％脱脂奶粉的10mM PBS(pH 7.2)溶液(样品稀释液)，25℃下孵育4小时，其后，用含有0.05％Tween20的10mM PBS(pH 7.2)洗净，添加100μl上述(A)已制备的抗HAT(F(ab’)2)HRP标记抗体(500μg/ml)于每孔中，该抗体已用含1％BSA的10mM PBS(pH7.2)稀释100倍，25℃下恒温孵育2小时。吸除各孔中的溶液后，用含有0.05％Tween20的10mM PBS(pH7.2)洗净。各孔中添加100μl的含有0.02％3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐、2.5mM H2O2的0.1M磷酸/柠檬酸缓冲液(pH4.3)，于25℃下反应30分钟后，作为反应停止剂于各孔中添加100μl的0.5M硫酸水溶液停止酶反应。然后使用分光光度计测定波长450nm处的溶液吸光强度，引与标准物质浓度0至300ng/ml对应制图。其结果显示液相抗原反应性有#B3＞#B5＞#A3的顺序。结果如图4所示。(2)测定系统的构建(A)生物素化抗体的制备使用上述(1)液相抗原反应性的测定结果最高的#B3抗HAT单克隆抗体，以及实施例2(B)所得的抗HAT多克隆抗体(anti-rHATPAb)，如以下进行IgG的生物素化将1ml的1-3mg/ml的IgG溶液(PBS(-))，与等渗的0.2M的NaHCO3(pH8.0)混合，然后加入100倍摩尔浓度的10mM生物素化试剂，于37#下恒温孵育1小时。生物素化试剂通过将NHS-LC-Biotin(PIERCE公司制#21335分子量556)溶解二甲基甲酰胺为10mM制备得到。其后加入十分之一量的1M单乙醇胺，于37℃下进一步恒温孵育1小时。将此反应液用PBS(-)缓慢调至2.5ml，施用于G-25胶体过滤柱中，使PBS(-)流出而回收生物素化IgG。此外，加入BSA使其终浓度为3％，加入NaN3使其终浓度为0.1％，保存最终混合物。(B)抗体固定化平板的制备充分洗净96孔平板(住友培克来特公司制，MS-3796F/碳素平板)，每100μl的抗体的20μg/ml PBS溶液加入各孔中，4℃下放置一整天后，用PBS-0.05％Tween20洗净，加入380μl之1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液于各洞穴中，4℃下放置一整天后得到抗体固定化平板。(C)测定系统的构建如上述(B)所制备的抗HAT抗体IgG固定化平板中，添加50μl该溶液含有1％BSA-0.1％脱脂奶粉的10mM PBS(pH7.2)溶液(检体稀释液)，该溶液含有的纯化重组HAT(标准物质)范围是0至400ng/ml以及50μl上述(A)所制备的含有10μg/ml生物素化IgG的10mM PBS(pH 7.2)溶液，该溶液中含有1％ BSA-0.1％脱脂奶粉最终混合物4℃下放置过夜。再将平板洗净后，以100μl/孔的量加入含有稀释至1万倍的链霉亲合素标记的过氧化酶(TAGO公司制，#SNN1004)的10mM PBS(pH7.2)溶液，该溶液含有1％BSA-0.1％脱脂奶粉25℃下恒温孵育1小时。吸除各洞穴中的溶液后，以含有0.05％Tween20的10mM PBS(pH7.2)洗净，各孔中添加100μl的含有0.02％ 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和2.5mM H2O2的0.1M磷酸/柠檬酸缓冲液(pH4.3)，于25℃下反应15分钟后，作为反应停止剂于各洞穴中添加100μl的0.5M硫酸水溶液停止酶反应。再使用分光光度计测定溶液于波长450nm处的吸光强度，此与标准物质浓度0至200ng/ml对应制图。结果如图5表示。
产业上可利用性本发明的单克隆抗体以及多克隆抗体作为治疗药可抑制或缓和许多生理活动如HAT对凝聚纤溶系统的作用、对呼吸道病态的作用、对呼吸道炎症的作用、对癌细胞增殖或转移的作用、对粘液纤毛运动或抗病毒感染作用等还可用于改善或治疗其它不健康的生理状态。
又，使用本发明的单克隆抗体以及多克隆抗体作为诊断药，例如可测定唾液中、咳痰中以及血中的HAT浓度。
权利要求
1.一种抗体，该抗体可与人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶结合。
2.权利要求1中所述的抗体，该抗体为单克隆抗体。
3.权利要求2中所述的抗体，该抗体为鼠单克隆抗体。
4.权利要求3中所述的抗体，该抗体为鼠IgG单克隆抗体。
5.权利要求3中所述的抗体，该抗体为鼠IgM单克隆抗体。
6.权利要求1中所述的抗体，该抗体为多克隆抗体。
7.权利要求6中所述的抗体、该抗体为兔子多克隆抗体。
8.一种抗体，通过免疫人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶的部分肽段获得。
9.一种抗体，通过免疫部分肽段获得，该部分肽段包含人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶成熟部分N末端1至19残基的一部分或全部。
10.权利要求8或9中所述的抗体，该抗体为多克隆抗体。
11.权利要求10中所述的抗体，该抗体为兔子多克隆抗体。
12.权利要求1至11中任一项所述的抗体，使用该抗体进行酶免疫测定可测定生物体内天然的人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶。
13.权利要求1至11中任一项所述的抗体，使用该抗体进行Western印迹可检测生物体内天然的人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶。
14.权利要求1至11中任一项所述的抗体，可抑制其中的人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶的活性。
15.权利要求1至11中任一项所述的抗体，可中和其中的人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶的活性。
16.权利要求3至5中任一项所述的抗体，该抗体的表位位于人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶氨基酸序列的第187至418位之间。
17.权利要求1至11中任一项所述的抗体，其中的免疫原为重组人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶。
18.一种检测或测定人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶的方法，该方法使用权利要求1至11中任一项所述的抗体。
19.一种人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶的免疫测定法，该方法使用权利要求1至11中任一项所述的抗体。
20.一种包含权利要求14所述抗体的治疗药。
21.一种包含权利要求15所述抗体的治疗药。
22.一种动物细胞，该细胞可产生权利要求2至5中任一项所述的抗体。
23.一种可产生权利要求2至5中任一项所述抗体的杂交瘤细胞或源于杂交瘤细胞的动物细胞。
全文摘要
本发明提供一种以测定生物样品中人类气管胰蛋白类酶蛋白酶为基础的病态诊断方法和与人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶有关的疾病治疗药。本发明涉及与人类气管胰蛋白酶蛋白酶结合的抗体,蛋白酶免疫测定法,含有阻碍人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶活化的抗体的治疗药,以及含有中和人类呼吸道胰蛋白酶类蛋白酶活性的抗体的治疗药。
文档编号G01N33/573GK1339064SQ00803389
公开日2002年3月6日 申请日期2000年12月4日 优先权日1999年12月6日
发明者江口广志, 山冈一良, 小川弘子, 安冈劭 申请人:帝人株式会社