专利名称：以三酶电化学生物传感器测定纤维素酶活力的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测水解酶催化活力的方法。具体是涉及采用溶液中的纤维素酶、葡萄糖氧化酶(GOx)和固定的辣根过氧化物酶(HRP)的三酶生物传感器对纤维素酶的催化活力进行连续监测的工艺方法。
背景技术：
纤维素是储量丰富，占植物碳含量的50%以上。现已广泛运用到了纺织、造纸、食品、建筑、聚合物材料合成等领域。在能源紧缺和要求降低碳排放的今天，将纤维素这种可再生资源转化为新的能源又重新受到了人们的瞩目[李燕红，赵辅昆.生命科学2005，17:392-397]。
水解纤维素需要纤维素酶的参与。纤维素酶广泛存在于生物体中，一般使用的纤维素酶来自真菌，较为典型的真菌是曲霉属、木酶属和青霉属。纤维素酶是一种多组分的酶系，底物也相对复杂。纤维素酶含有内切葡聚糖酶、夕卜切葡聚糖酶和葡聚糖苷酶。内切葡聚糖酶水解纤维素多糖链中的不规整区域，生成长短不一的寡聚糖；外切葡聚糖酶作用于纤维素多糖链的末端，生成葡萄糖或二糖；而葡萄糖苷酶则进一步水解二糖，产生葡萄糖。总体效果是将纤维素多糖链被水解成葡萄糖。内切葡聚糖酶首先进攻纤维素的非结晶区，形成新的自由末端，然后由外切葡聚糖酶从多糖链的还原端或非还原端切下纤维二糖单位，最后由β-葡聚糖苷酶将二糖水解葡萄糖。目前，测定纤维素酶活力的方法是采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)的比色测定[颜秋生，蒋传葵.遗传，1979，3 :33-34]，原理是利用纤维素酶催化水解纤维素，所产生的还原糖与DNS显色反应，由此推出还原糖的浓度，并由还原糖的浓度变化的速率求出酶的活力。该方法难以应用到有色的底液溶液中，而且灵敏度不够高。以往，电化学传感器基本上是用于微量底物浓度的测定[Wang J. Chem. Rev. 2008，108 :814-825]。利用纤维素酶催化纤维素的水解可产生葡萄糖这一特点，人们尝试将葡萄糖电极用于纤维素酶活力的测定[Hilden L, et al. Anal. Biochem. 2001,290 =245-250 ；干宁等·纤维素科学与技术，2007,15 30~35 ；Cruys-Bagger N, et al. Biotechnol.Bioeng. 2012，doi :10. 1002/bit. 24593]，得到了一种较为灵敏的纤维素酶活力实时检测方法。例如干宁等人的方法是用TiO2凝胶膜将GOx酶固定于电极表面上，用二茂铁六氟磷酸盐作为电子媒介体。通过测量电极表面的葡萄糖浓度来确定纤维素的活力。为了进一步提高测量的灵敏度，本发明将GOx酶溶解在溶液中，而不是固定在电极表面上。在电极表面的固定酶选用了活力较高的HRP酶。这样，溶液游离的纤维素酶和GOx酶，以及固定化的HRP酶构成了一种三酶电化学传感器。由于HPR酶和GOx酶的活力高于纤维素酶，所以酶传感器能够灵敏地测量纤维素酶活力的变化
发明内容
本发明的目的之一是设计一种三酶电化学传感器。本发明的目的之二是为不间断检测水解酶的活力提供一种实验方法。本发明将纤维素酶和葡萄糖氧化酶溶于电解液中，HRP酶则固定在电极表面，在固液两相中存在着三种酶。所检测的纤维素酶是在溶液中处于游离状态的。其中的化学原理可简述为，在传感器体系中，纤维素大分子在纤维素酶的催化下被水解为小分子葡萄糖。葡萄糖进一步被溶液中的GOx酶氧化成葡萄糖酸，同时释放H2O2。H2O2将固定在电极上的HRP酶氧化成HRP中间体I和II。这两个HRP酶氧化中间体将氢醌分子氧化成苯醌。苯醌分子在电极上得到电子重新还原，从而在电极产生电流(附图I)。这一反应序列是化学计量的，电流能够敏感地反映出H2O2、葡萄糖和纤维素的即时浓度，并且与纤维素酶、GOx酶和HRP酶的活力有关。在GOx酶和HRP酶的催化能力高于纤维素酶时，电流反映了纤维素酶的相对活力。具体工艺如下
电化学传感器采用三电极系统玻碳电极为工作电极，钼丝为对电极，甘汞电极(SCE)为参比电极。将HRP酶与牛血清白蛋白(BSA)混合，继而将其附着在玻碳电极上，以戊二醛使BSA交联成膜。将酶修饰后的工作电极浸入到电解液中，同时浸入对电极和参比电极。加入微量的纤维素，使电化学工作站在-O. 4 O. 2V的电压范围内进行循环伏安扫描，以确定传感器的还原峰值电压。在溶液中加入纤维素酶和GOx酶，搅拌使其溶解。待输出电流平稳后，加入微量的羧甲基纤维素钠，电流随即呈上升趋势。由于纤维素酶催化羧甲基纤维素钠水解为葡萄糖。葡萄糖被葡萄糖氧化酶氧化生成H2O2。HRP电极能够敏感地测量H2O2生成的速率，而H2O2的生成速率与纤维素的水解速率成比例。传感器电流上升的斜率反映了纤维素酶的活力。加入纤维素后电流平稳上升。搅拌或旋转圆盘电极能够改善的体系的传质，使电极表面的H2O2浓度更加接近本体浓度，从而使电流-时间曲线的截距增高。由于HRP传感器的电流与H2O2的浓度线性相关，H2O2的浓度与葡萄糖的浓度相关，而葡萄糖的浓度又与纤维素的浓度线性相关，因此，电流上升的斜率反映了纤维素浓度下降的速率。在给定纤维素的初始浓度后，其下降的速率则依赖于纤维素酶的活力。由此，通过电流上升的斜率就可计算出纤维素酶的相对活力。如果确定纤维素的浓度与输出电流的关系，就能够通过标准校正曲线得到纤维素酶的活力。传感器电流上升斜率的变化与纤维素水解速率有关。将电流值的倒数和纤维素浓度的倒数代入Lineweaver-Burk方程就可估算出Michaelis常数Km和最大电流imax。本发明所构建的传感器可用于对纤维素酶活力变化进行连续监测，适用于对水解酶动力学和机理的分析研究。本发明的优点在于I.本发明所述的方法可用于酶活力检测，而电化学传感器一般多用于测量底物的浓度。2.本发明所述的方法可用于水解酶的分析。电化学分析多涉及氧化还原酶分析测试，而本发明将研究的对象拓展到水解酶。3.本发明所述的方法的特征是可以进行连续测量。
4.本发明所述的方法能对酶动力学和催化机理的研究提供一种实验技术。特别适合原位、实时分析外界物理刺激对酶活力的影响。
图I是三酶电化学传感器结构示意图。GOx为葡萄糖氧化酶，HRP为辣根过氧化物酶。
具体实施例方式实施例I :在电极修饰前，用砂布上覆盖O. 05mm的Al2O3糊浆对玻碳电极的表面进行打磨抛
光，随后分别用丙酮、50% NaOH溶液、50%硝酸、双蒸水对玻碳电极进行超声清洗。将2. 5mg300U/mL HRP 和 4mg BSA 溶于 O. 2mL 的 KH2PO4-Na2HPO4 缓冲液(O. 05mol/L，pH值7. O)。将20 μ L的混合液滴加到玻碳电极表面。再将电极置于一个含有25%戊二醛蒸汽的封闭的容器内进行交联4h，室温干燥lh，在4°C下储藏待用。实施例2 用电化学工作站和三电极系统进行循环伏安实验。其中，以修饰过的玻碳电极作为工作电极；钼丝作为对电极；饱和甘汞电极作为参比电极；PBS(0. 05mol/L, pH值7. O)作为支持电解液。循环伏安实验的电势扫描范围(相对于SCE)为-0.4 O. 2V，扫描速率100mV/s。实验在室温下进行。实施例3 考察底物影响的实验在盛有20mL支持电解液的反应池中进行。在搅拌下，加入O. lg/L 纤维素酶(30U/mg)、0· 2g/L 的黑曲霉 GOx 酶(ECI. I. 3. 4，35U/mg)和 lmmol/L 氢醌。在-O. 25V电压下记录初始电流的基线。待基线平稳后(约50s后)，加入0.5mmol/L羧甲基纤维素钠溶液，测量电流随时间的变化。实施例4 求出在给定羧甲基纤维素钠浓度下反应初期电流-时间曲线上升的斜率。将不同纤维素浓度下的斜率代入Lineweaver-Burk双倒数方程,求出Michaelis常数Kn^P imax。如果标定了在实际葡萄糖浓度下的传感器电流，即可将电流值换算成葡萄糖浓度，从而求出酶最大速率(Vmax)或转换数(kMt)。
权利要求
1.一种检测纤维素酶活力的工艺方法，其特征在于所述的工艺方法是采用电化学生物传感器通过连续测量纤维素的水解反应速率来测量纤维素酶活力的。
2.根据权利要求I所述的一种检测纤维素酶活力的工艺方法，其特征在于电化学生物传感器是由纤维素酶、葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶三种酶所构成。
3.根据权利要求I所述的一种检测纤维素酶活力的工艺方法，其特征在于纤维素酶和葡萄糖氧化酶以游离的形式溶解在溶液中。
4.根据权利要求I所述的一种检测纤维素酶活力的工艺方法，其特征在于辣根过氧化物酶是通过牛血清白蛋白与戊二醛的交联固定在电极表面上；溶液中含有作为电子媒介体的氢醌。
5.根据权利要求I所述的一种检测纤维素酶活力的工艺方法，其特征在于溶液中含有作为底物的羧甲基纤维素钠。
全文摘要
本发明公开了一种电化学测量纤维素酶催化水解反应活力的工艺方法。所述的工艺方法是通过一种三酶电化学传感器对纤维素浓度变化的连续测量米实现的。将纤维素酶和葡萄糖氧化酶溶解于溶液中，并将辣根过氧化物酶固定在电极上。溶液中的纤维素酶催化羧甲基纤维素钠水解产生葡萄糖，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的氧化同时生成H2O2。固定在电极上的辣根过氧化物酶催化H2O2氧化氢醌为苯醌，苯醌在电极表面上获得电子而产生电流。在一系列的反应中，电流与纤维素和H2O2的浓度变化具有相关性，能够反映出纤维素酶的活力。此方法可作为检测水解酶催化活力的电化学新手段具有灵敏度高、设备成本低和可连续监测的特点。
文档编号G01N27/327GK102879443SQ20121040753
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者黄积涛, 宫泽, 李敏, 黄薇 申请人:南开大学