纤维素酶的制造方法及其装置制造方法

纤维素酶的制造方法及其装置制造方法
【专利摘要】包括以下的工序(1)～(3)的纤维素酶的制造方法，所得的纤维素酶可以在洗剂用途、淀粉的水解、和纤维素的水解等用途中有效地使用。工序(1)：使来源于丝状菌的纤维素酶水溶液通过截留分子量100,000～200,000的超滤膜进行过滤，得到透过液，同时作为非透过液得到浓缩酶液。工序(2)：使工序(1)所得的透过液进一步通过截留分子量5,000～50,000的第2超滤膜进行过滤，作为非透过液得到第2浓缩酶液。工序(3)：将工序(1)和(2)所得的浓缩酶液混合，得到来源于丝状菌的纤维素酶。
【专利说明】纤维素酶的制造方法及其装置
【技术领域】
[0001]本发明涉及通过将来源于丝状菌的纤维素酶成分进行膜分离?浓缩来制造纤维素酶的制造方法及其装置。
【背景技术】
[0002]作为生物质资源，存在淀粉、纤维素等多糖，已知通过将这样的多糖进行酶水解来制造葡萄糖、木糖等单糖的方法。通过这样的多糖的分解而得的糖液作为微生物培养的碳源而被广泛使用。特别是作为水解纤维素的酶已知纤维素酶。作为生产这样的纤维素酶的微生物已知丝状菌。丝状菌通过设定为诱导生产纤维素酶的培养条件，而作为细胞外酶产生大量的纤维素酶。作为这样的丝状菌，存在曲霉属、腐质霉属、毛霉属、木霉属和枝顶孢霉属等的丝状菌，在纤维素酶的生产中被广泛使用。[0003]来源于丝状菌的纤维素酶中存在显示各种底物特异性的酶成分。具体地，存在作用于纤维素的结晶区域的纤维二糖水解酶、从纤维素分子链内部开始作用而降低分子量的内切葡聚糖酶、作用于水溶性寡糖或者纤维二糖的葡糖苷酶、和作用于半纤维素的半纤维素酶等。已知通过这样的底物特异性不同的各酶成分协同作用于纤维素纤维，而进行有效的纤维素分解(参照非专利文献I)。另外，已知作为这样的来源于丝状菌的纤维素酶的各酶成分存在分子量大小不同的成分，其范围为20~lOOkDa。
[0004]对于来源于丝状菌的纤维素酶，与一般的酶同样地，使用超滤膜进行膜分离?浓缩的方法是公知的。例如，已知从丝状菌等的微生物培养物或者使用了纤维素酶的纤维素水解物中，使用超滤膜将纤维素酶进行膜分离?浓缩，并分离回收的方法(参照专利文献I~3)。作为这样的通过超滤膜而进行膜分离.浓缩的前工序的处理，提出了使用例如陶瓷自旋过滤器(参照专利文献2)、20~200 μ m孔径的无纺布(参照专利文献3)等，从微生物培养物或者纤维素水解物中预先除去纤维素酶水溶液所含的固体物质的方法。但是，为了将纤维素酶的各成分进行膜分离.浓缩，一般使用具有足以阻挡具有与应回收的纤维素酶成分相当的分子量的细孔径.截留分子量的超滤膜。
[0005]现有技术文献
[0006]专利文献
[0007]专利文献1:W02007/034999 号
[0008]专利文献2:日本特开2010-221136号公报
[0009]专利文献3:日本特开2009-240167号公报
[0010]非专利文献
[0011]非专利文献1:七^ 口一 7 Q辞典、第6章七^ 口一 7乃生分解(七^ 口一 7学会编集、2000年)。

【发明内容】

[0012]发明要解决的课题[0013]在现有的使用了超滤膜的丝状菌纤维素酶的膜分离.浓缩中，超滤膜的结垢和纤维素酶成分的失活或者凝集是课题。另外，该课题的结果是超滤膜的过滤处理速度变得非常慢，或者由超滤膜得到的纤维素酶活性降低。
[0014]于是，本发明的目的是鉴于上述现有技术的课题，提供使用超滤膜而将来源于木霉属菌的纤维素酶成分有效地进行膜分离.浓缩的方法、以及该方法的装置。
[0015]用于解决课题的方法
[0016]本
【发明者】为了实现上述目的而完成了以下的[I]~[7]的发明。
[0017][I]纤维素酶的制造方法，包括以下的工序⑴~(3)， [0018]工序(I):使来源于丝状菌的纤维素酶水溶液通过截留分子量100，000~200，000的超滤膜进行过滤，得到透过液，同时作为非透过液得到浓缩酶液，
[0019]工序(2):使工序(I)所得的透过液进一步通过截留分子量5，000~50，000的第2超滤膜进行过滤，作为非透过液得到第2浓缩酶液，
[0020]工序(3):将工序⑴和⑵所得的浓缩酶液混合，得到来源于丝状菌的纤维素酶。
[0021][2]根据[I]所述的纤维素酶的制造方法，丝状菌是木霉属菌。
[0022][3]根据[I]或[2]所述的纤维素酶的制造方法，在工序(I)中，将来源于丝状菌的纤维素酶水溶液调整为pH值2.6~5.4或pH值8.6~9.4。
[0023][4]根据[I]~[3]的任一项所述的纤维素酶的制造方法，来源于丝状菌的纤维素酶水溶液是丝状菌培养液或使用了来源于丝状菌的纤维素酶的含纤维素的生物质的水解物。
[0024][5]根据[I]~[4]的任一项所述的纤维素酶的制造方法，来源于丝状菌的纤维素酶水溶液包含选自纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和木聚糖酶中的I种以上酶成分。
[0025][6]根据[I]~[5]的任一项所述的纤维素酶的制造方法，来源于丝状菌的纤维素酶水溶液的温度为15~35°C的温度范围。
[0026][7]纤维素酶的制造装置，该装置包含:纤维素酶水溶液罐、与该纤维素酶水溶液罐连接的超滤膜泵、至少I个以上串联或并联地连接的截留分子量100，000~200，000的超滤膜、所述超滤膜的透过液保持罐、截留分子量5，000~50，000的第2超滤膜、和第2浓
缩酶液保持te。
[0027][8]根据[7]所述的纤维素酶的制造装置，纤维素酶水溶液罐具备pH值传感器，进而该纤维素酶水溶液罐连接有PH值调整剂罐。
[0028]发明的效果
[0029]根据本发明，可以从来源于丝状菌的纤维素酶水溶液中将纤维素酶成分有效地进行膜分离.浓缩。具体地，通过在工序(I)中分离回收来源于丝状菌的纤维素酶成分的一部分，进而将透过液所含的残余的来源于丝状菌的纤维素酶成分在工序(2)中回收，从而可以回收特别高的艾维素(Avicel)分解活性。
【专利附图】

【附图说明】
[0030]图1是显示本发明的纤维素酶的制造方法的工序流程的附图。
[0031]图2是显示将来源于木霉属菌的纤维素酶调整到各种pH值，通过截留分子量100, 000~200，000的第I超滤膜进行过滤，作为非透过液分离而得的浓缩酶液的利用Bioanalyzer (Agilent 社、Protein230kit)的分析结果的附图。
[0032]图3是显示得到第2浓缩酶液时的超滤膜的临界通量的附图。
[0033]图4是显示实施本发明的纤维素酶的制造方法的装置的一例的剖面图。
[0034]图5是显示实施本发明的纤维素酶的制造方法的装置的另外一例的剖面图。
【具体实施方式】
[0035] 本发明的纤维素酶的制造方法由包含以下的工序(I)~(3)的工序构成(图1)。
[0036]<工序(1) >
[0037]在工序(I)中，使来源于丝状菌的纤维素酶水溶液通过截留分子量100，000~200, 000的超滤膜进行过滤，得到透过液，同时作为非透过液得到浓缩酶液。此时，发现来源于丝状菌的纤维素酶水溶液所含的一部分酶成分作为截留分子量100，000~200，000的超滤膜的非透过液而被分离。另一方面，发现在透过侧也有残余的酶成分被分离到透过侧，因而在以下的工序(2)中回收残余的酶成分。
[0038]< 工序(2) >
[0039]在工序(2)中，使上述工序(I)所得的透过液进一步通过截留分子量5，000~50，000的第2超滤膜进行过滤，作为非透过液得到第2浓缩酶液。由此，可以不遗漏地回收工序(I)的透过液所含的酶成分。通过前述工序(I)的截留分子量100，000~200，000的超滤膜、和工序(2)的截留分子量5，000~50，000的超滤膜的2个阶段而分离?浓缩来源于丝状菌的纤维素酶，从而与现有的仅用截留分子量5，000~50，000的超滤膜进行分离.浓缩的方法相比，可以分离更高的酶活性。
[0040]< 工序(3) >
[0041]在工序(3)中，将工序(I)所得的第I浓缩酶液与工序(2)所得的第2浓缩酶液混合，从来源于丝状菌的纤维素酶水溶液得到具有高酶活性的纤维素酶。本工序(3)所得的纤维素酶可以直接使用，也可以调整到适宜纤维素酶浓度和/或PH值而使用。
[0042]进行，以下关于本发明的优选实施方式进行详细说明。
[0043]来源于丝状菌的纤维素酶是指由丝状菌(filamentaous fungi)产生的纤维素酶。作为产生纤维素酶的丝状菌，可列举木霉属菌(Trichoderma)、曲霉属菌(Aspergillus)、纤维单胞菌属菌(Cellulomonas)、梭菌属菌(Clostridium)、链霉菌属菌(Streptomyces)、腐质霉属菌(Humicola)、枝顶孢霉属菌(Acremonium)、祀齿菌属菌(Irpex)、毛霉属菌(Mucor)、篮状菌属菌(Talaromyces)等微生物。这些微生物在培养液中产生纤维素酶,因而可以直接将其培养液作为未纯化的丝状菌纤维素酶使用，另外也可以纯化培养液，将制剂化而得的产物作为丝状菌纤维素酶使用。
[0044]作为本发明中使用的来源于丝状菌的纤维素酶，优选为来源于木霉属菌的纤维素酶。木霉属菌是指分类于木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、和肉座菌属(Hypocrea)的丝状菌(filamentaous fungi)。另外,来源于木霉属菌的纤维素酶是指由上述木霉属菌在细胞内外产生的全部纤维素酶成分。另外，本发明中使用的纤维素酶是指具有纤维素的水解活性的酶和具有半纤维素的水解活性的酶两者。
[0045]另外，来源于木霉属菌的纤维素酶中，更优选来源于里氏木霉(Trichodermareesei)的纤维素酶。作为来源于里氏木霉的纤维素酶，可列举来源于里氏木霉QM9414 (Trichoderma reesei QM9414)、里氏木霉 QM9123 (Trichoderma reesei QM9123)、里氏木霉 RutC-30(Trichoderma reesei Rut-30)> 里氏木霉 PC3-7(Trichodermareesei PC3-7)、里氏木霉 ATCC66589 (Trichoderma reesei ATCC66589)、里氏木霉CL-847 (Trichoderma reesei CL-847)、里氏木霉MCG77 (Trichoderma reesei MCG77)和里氏木霉MCG80 (Trichoderma reesei MCG80)的纤维素酶。另外，也可以是来源于前述的木霉属菌，将它们的菌株通过突变剂或者紫外线照射等实施突变处理，而纤维素酶生产性等提高了的突变株。
[0046]木霉属菌通过在适当培养基条件下培养而在培养液中分泌产生各种纤维素酶，因而可以从这样的培养液中获得来源于木霉属菌的纤维素酶。这样的培养液既可以未纯化而直接作为来源于木霉属菌的纤维素酶，另外也可以是将培养液通过公知方法纯化而得的产物，或者进一步制剂化而得的产物。作为从上述的培养液中将来源于木霉属菌的纤维素酶纯化、制剂化而得的产物使用时，也可以是添加了蛋白酶抑制剂、分散剂、溶解促进剂和稳定剂等除酶以外的物质而得的产物。
[0047]另外，本发明中使用的来源于木霉属菌的纤维素酶，也可以制备存在于木霉属菌的基因组上的编码纤维素酶成分的氨基酸序列的DNA，将其与表达载体连接，将该表达载体导入宿主，作为重组蛋白质生产，再分离和纯化而获得。
[0048]木霉属菌产生至少2种以上的内切葡聚糖酶(内切葡聚糖酶1、内切葡聚糖酶II)、至少2种以上 的纤维二糖水解酶(纤维二糖水解酶1、纤维二糖水解酶II)、至少2种以上的半纤维素酶(木聚糖酶、木糖苷酶)、和I种以上的β葡糖苷酶。
[0049]纤维二糖水解酶是以从纤维素的末端部分开始水解下去为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号:EC3.2.1.91记载了归属于纤维二糖水解酶的酶群。内切葡聚糖酶是以从纤维素分子链的中央部分开始水解为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号:EC3.2.1.4记载了归属于内切葡聚糖酶的酶群。外切葡聚糖酶是以从纤维素分子链的末端开始水解为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号:EC3.2.1.74记载了归属于外切葡聚糖酶的酶群。β葡糖苷酶是以作用于纤维寡糖或纤维二糖为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号:EC3.2.1.21记载了归属于β葡糖苷酶的酶群。
[0050]木聚糖酶是以作用于半纤维素或特别作用于木聚糖为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号:EC3.2.1.8记载了归属于木聚糖酶的酶群。木糖苷酶是以作用于木寡糖为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号:EC3.2.1.37记载了归属于木糖苷酶的酶群。
[0051]在本发明中使用的来源于丝状菌的纤维素酶中，也可以添加异种微生物的纤维素酶成分而强化特定的酶活性。例如，可以添加来源于作为丝状菌的曲霉属(Aspergillus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)、枝顶抱霉属(Acremonium)、祀齿菌属(Irpex)、毛霉属(Mucor)、篮状菌属(Talaromyces)等的纤维素酶。另外，作为嗜热菌，可以例示硫化叶菌属(Sulofolobus)、热原体属(Thermoplasma)、暖枝菌属(Caldivirgra)、热球形菌属(Thermosphaera)、火球菌属(Pyrococcus)、嗜苦菌属(Picrophilus)、暖枝菌属(Caldivirgra)、和闪烁杆菌属(Fervidobacterium)等微生物。
[0052]关于来源于丝状菌的纤维素酶所含的各酶成分，可以使用公知的分离方法特定其成分。例如，通过凝胶过滤、离子交换、和二维电泳等公知方法来分离，进行分离而得的成分的氨基酸序列分析(N末端分析、C末端分析、质量分析)，通过与数据库的比较来确定。
[0053]来源于丝状菌的纤维素酶的酶活性可以通过艾维素(Avicel)分解活性、羧甲基纤维素(CMC)分解活性、纤维二糖分解活性、木聚糖分解活性、和甘露聚糖分解活性等多糖的水解活性来评价。关于艾维素(Avicel)分解活性，具有从纤维素末端部分开始水解的特征的纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶是显示其活性的主要酶。另外，关于木聚糖分解活性，木聚糖酶、木糖苷酶是显示其活性的主要酶。关于纤维二糖分解活性，主要β葡糖苷酶是显示其活性的主要酶。CMC由全体纤维素酶发挥催化作用。这里所谓“主要”的含义是来自已知最与分解相关的表达，意味着除此以外的酶成分也参与该分解。
[0054]来源于丝状菌的纤维素酶水溶液，是包含I种以上的前述的来源于丝状菌的纤维素酶成分的水溶液。但是，在本发明中，优选为包含多种来源于丝状菌的纤维素酶成分的水溶液。另外，除了本来的来源于丝状菌的纤维素酶成分之外，还可以含有来源于异种微生物的酶或者纤维素酶。
[0055]作为本发明中使用的来源于丝状菌的纤维素酶水溶液不特别限定，优选为丝状菌的培养液或者在含纤维素的生物质中添加来源于丝状菌的纤维素酶进行水解而得的水解物。作为PH值调整中使用的酸， 可例示硫酸、盐酸、乙酸、磷酸、和硝酸等，作为碱，可例示氢氧化钠、氢氧化钾、和氢氧化钙等，但只要是能够经济地调整到规定的PH值、且不使来源于丝状菌的纤维素酶的酶成分失活或者凝集的酸或碱，就不特别限定。
[0056]来源于丝状菌的纤维素酶水溶液优选为进行选自离心分离、过滤器压滤、干滤器过滤、深层过滤器过滤、沉降分离、凝集处理、和砂滤的I种以上的固液分离操作，调整为浊度0.1~100NTU的范围的水溶液。浊度(Tubidity)在JIS Κ010‘工业用水试验方法”中定义为“浊度表示水混浊的程度，分为视觉浊度、透射光浊度、散射光浊度和积分球浊度而表示。与高岭土标准液比较而测定时，以‘度(高岭土)’为单位表示，与福尔马肼标准液比较而测定时，以‘度(福尔马肼)’为单位表示。”
[0057]在本发明中，使用与高岭土标准液相比再现性和稳定性优异的福尔马肼标准液，使用通过散射光测定法测定的浊度“NTU”。NTU是指“比浊法浊度单位(N印helometricTubidity Unit)”，当浊度大于100NTU时，在后段工序(2)的利用超滤膜的过滤中成为膜结垢的重要原因。因此，优选通过进行前述的I种以上的固液分离操作，将浊度调整为0.1~100NTU的范围。前述的固液分离方法可以通过公知的装置和步骤来实施。相反，为了使浊度小于0.1NTU,需要使用细孔径0.05~1.0 μ m的精密过滤膜。在使用这样的精密过滤膜时，来源于丝状菌的纤维素酶的酶成分可能作为精密过滤膜的非透过液而被阻挡，因而浊度优选为0.1NTU以上。
[0058]本发明中使用的超滤膜是指具有平均细孔径0.02~0.0001 μ m的分离膜，是能主要通过分子筛的效果而将酶和/或蛋白质等水溶性高分子化合物进行膜分离?浓缩的分离膜。
[0059]在本发明中，使用截留分子量为100，000~200，000的第I超滤膜、和截留分子量为5，000~50，000的第2超滤膜这2种超滤膜。截留分子量(MWCO)是指，如日本膜学会编膜学实验'> U 第III卷人工膜编编集委员:木村尚史、中尾真一、大矢晴彦、仲川勤(共立出版、1993年)92页有“以取溶质的分子量为横轴，以取阻挡率为纵轴将数据作图而得的曲线称为截留分子量曲线。并且将阻挡率成为90%的分子量称为膜的截留分子量。”的记载那样，通过测定能够作为膜的非透过级分分离的分子量而定义其膜性能。作为确定截留分子量的方法，可以使分子量明确的各种右旋糖苷标准样品和/或蛋白质标准样品通过超滤膜进行过滤，评价其阻挡率，描绘其分离曲线，从而确定截留分子量。具体地，截留分子量100，000的超滤膜，是指阻挡90%的分子量100，000的分子的超滤膜。
[0060]来源于丝状菌的纤维素酶包含在20~IOOkDa的范围大小不同的酶成分，预想将来源于丝状菌的纤维素酶水溶液用截留分子量100，000~200，000的第I超滤膜过滤后，不能从非透过液侧回收酶成分。然而，在本发明的工序(I)中，与预想相反地，来源于丝状菌的纤维素酶的20kDa~IOOkDa的范围的一部分酶成分可以通过截留分子量100，000~200, 000的第I超滤膜而从非透过液侧回收。如果第I超滤膜的截留分子量超过200，000,则作为非透过液被回收的酶成分量减少，因而不优选，如果截留分子量小于100，000,则被超滤膜回收的酶成分量过度增大，因而不优选。此外，第I超滤膜的优选截留分子量为100，000 ~150，000。[0061]然后，在工序(2)中将工序(I)的透过液用截留分子量5，000~50，000的超滤膜进行过滤，从而回收在工序(I)中没有完全被回收的来源于丝状菌的纤维素酶的酶成分。如果第2超滤膜的截留分子量小于5，000，则不仅膜的通量降低，而且回收的酶量.活性没有较大变化，因而不优选，如果截留分子量超过50，000，则由于工序(I)的透过液所含的来源于丝状菌的纤维素酶成分被过滤到透过液侧，因而回收的酶量.活性减少，因而不优选。此外，第2超滤膜的优选截留分子量为10，000~30，000。
[0062]超滤膜(高分子膜)的分离特性由被称为功能层的致密层的细孔径决定。作为工序(I)和工序(2)中使用的超滤膜的功能层的原材料，可以使用聚醚砜(PES)、聚砜(PS)、聚丙烯腈(PAN)、聚-1，1-二氟乙烯(PVDF)、再生纤维素、纤维素、纤维素酯、磺化聚砜、磺化聚醚砜、聚烯烃、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、和聚四氟乙烯等原材料，但由于再生纤维素、纤维素和纤维素酯受到来源于木霉属菌的纤维素酶的分解，因而优选使用以PES、PVDF等合成高分子化合物作为功能层的原材料的超滤膜。
[0063]通过超滤膜进行过滤时的pH值条件，优选在本发明的工序(I)中将来源于丝状菌的纤维素酶水溶液调整为pH值2.6~5.4或pH值8.6~9.4。此外，在本发明中，来源于丝状菌的纤维素酶水溶液已经处于pH值2.6~5.4或pH值8.6~9.4的范围时，看作调整至了该范围。作为工序(I)中调整PH值而通过超滤膜进行过滤的效果，具有可以增大能够作为非透过液回收的浓缩酶液所含的酶成分量这样的效果。
[0064]此外，由于pH值条件而酶或者蛋白质的超滤膜的透过性变化是公知的，可以说由于溶解于水溶液中的酶或者蛋白质的表面带电状态变化而水溶液中的表观分子量变化是其重要原因。然而，这样的表观分子量变化的条件和程度由于各酶成分所特有的氨基酸序列和立体结构、以及在溶解于水溶液中的各酶之间发生的相互作用等各种重要原因而变化也是公知的。在来源于丝状菌的纤维素酶的情况下，由于各酶成分在各pH值条件下的表观上的分子量的变化、或者溶解了多种来源于丝状菌的纤维素酶的各酶成分的水溶液中的各个酶成分的会合状态不明，因而关于由PH值变化造成的来源于丝状菌的纤维素酶的各酶成分的超滤膜的透过性的变化当然也不明。
[0065]工序⑴和工序⑵中通过超滤膜进行过滤时的温度条件，只要是酶不失活或者凝集的温度范围就不限定，优选15~35°C的范围。特别是如果温度超过35°C，则有时作为丝状菌纤维素酶的酶成分的一部分的分子量小于40kDa的酶成分的、具有木聚糖酶或者内切葡聚糖酶的任一酶活性的成分凝集。
[0066]工序(I)的利用超滤膜的过滤速度只要是能够将酶阻挡在非透过液侧的范围，就不特别限定，优选为0.5~Sm/天。如果小于0.5m/天，则成为降低来源于丝状菌的纤维素酶的阻挡率的重要原因。另一方面，如果过滤速度超过Sm/天，则有时引起超滤膜的膜间压差的显著增加和膜的急剧结垢。
[0067]另一方面，工序(2)中使用的超滤膜由于对应于来源于丝状菌的纤维素酶的分子量，因而由于过滤速度而对来源于丝状菌的纤维素酶的阻挡率的影响少，只要考虑膜的结垢而确定过滤速度即可，优选为0.1~4m/天。
[0068]此外，过滤速度(m/天)，可以通过对具有某特定的膜面积(m2)的超滤膜，将作为过滤对象的来源于丝状菌的纤维素酶水溶液进行过滤，测定所得的通量(m3/小时)，通过下式(式I)算出。
[0069]过滤速度( m/天)=通量(m3/小时)X 24+膜面积(m2)..?(式I)。
[0070]在工序(I)和工序(2)中，作为超滤膜的非透过液得到的浓缩酶液的浓度优选为I~100g/L的范围。如果浓度超过100g/L，则非透过侧的膜分离.浓缩酶液的粘度升高，有时引起过滤速度的急剧降低。另一方面，如果浓度小于lg/L，则作为膜分离?浓缩酶液过于稀薄，从浓缩酶液的使用上的原因考虑，不能说是充分的浓度。
[0071]工序(I)和工序2中使用的超滤膜，可以使用平膜型、螺旋型、管状型和中空丝型等适宜方式的超滤膜。
[0072]特别是工序(I)中使用的来源于丝状菌的纤维素酶水溶液也可能包含固体物质等，因而优选对膜结垢耐性强的分离膜。即，优选外压式中空丝超滤膜。中空丝膜是指内部形成空洞、在其内侧或者外侧具有功能层的分离膜。特别在本发明中，优选能够从中空丝膜的外侧使过滤原水透过，在中空丝膜的内侧得到滤液的外压式中空丝膜。外压式中空丝膜与内压式相比，具有对固体物质造成的膜结垢的耐性强，另外，清洗也容易这样的特征。
[0073]另一方面，工序(2)中使用的超滤膜也可以是任一方式。特别优选每单位体积具有高的膜面积的螺旋型。在本发明中，由于将工序(I)所得的透过液在工序(2)中使用，因而还具有工序(2)的过滤速度提高、另外能够抑制膜结垢这样的效果。
[0074]具体地，可列举DESAL社的G-5型、G-1O型、G-20型、G-50型、PW型和HWS UF型、KOCH 社的 HFM-180、HFM-183、HFM-251、HFM-300、HFM-116, HFM-183、HFM-300、HFK-131、HFK-328、MPT-U20、MPS-U20P 和 MPS-U20S、Synder 社的 SPEl、SPE3、SPE5、SPE10、SPE30、SPV5、SPV50和S0W30、旭化成株式会社制的“V ^，口一开'”(注册商标)UF系列、日东电工株式会社制的NTR7410、和NTR7450等。
[0075]工序⑴和工序⑵的超滤可以是死端过滤(正向过滤)或者错流过滤(切向流过滤)的任一种。死端过滤(正向过滤)是相对于超滤膜的膜面垂直地施加压力，从非透过侧向透过侧过滤的方法。另一方面，错流过滤(切向流过滤)是通过泵或者气泡等产生相对于作为过滤方向的膜面平行的流(错流或者切向流)，一边除去在超滤膜表面形成的堆积槽一边过滤的方法。通过该错流(或者切向流)，可以抑制超滤膜的膜结垢。特别是在工序(I)中使用外压式中空丝时，优选死端过滤。另外在工序(I)和工序(2)中使用螺旋型、平膜型时，优选错流过滤。
[0076]当工序(I)中使用的超滤膜是外压式中空丝超滤膜时，优选进行使透过液间歇地从透过侧通液到非透过侧的逆洗操作。通过该逆洗操作可以使在超滤膜的膜表面堆积的固体物质或者酶等的堆积物剥离。即，通过本操作，可以抑制超滤膜在过滤时堵塞，从而可以长时间稳定地实施过滤处理。本操作在通过超滤膜进行过滤时或者过滤结束时等进行即可。作为进行本操作的时间选择，可以在超滤膜的过滤压差增大是进行，或者与压差无关地以一定间隔进行等，优选后者。
[0077]工序(I)或者工序(2)的作为超滤膜的非透过液得到的浓缩酶液，优选通过曝气和/或溶液循环而以膜面线速度I~200cm/秒的范围发生错流，从而回收浓缩酶液。另外此时，还可以在使前述的逆洗操作连续或者间歇地进行的同时，使前述错流发生，从而得到浓缩酶液。
[0078]本发明所得的纤维素酶可以利用其保有的催化活性，而在食品用途、洗剂、清洗剂、环境净化剂、肥料用途、饲料用途、化妆品用途、药物用途等中使用。[0079]本发明所得的纤维素酶可以广泛地在含纤维素的生物质的水解中使用。含纤维素的生物质是至少包含纤维素或半纤维素的物质。具体是甘蔗渣、玉米秸、玉米棒、柳枝稷、稻秸、麦秸、树木、木材、废建材、报纸、旧纸、和纸浆等。这些含纤维素的生物质包含高分子芳香族化合物木质素和/或半纤维素等杂质，但可以作为前处理使用酸、碱和加压热水等将木质素和/或半纤维素部分分解，将所得的含纤维素的生物质作为纤维素利用。水解的条件设定为来源于丝状菌的纤维素酶的最适反应条件即可，优选处理温度40~60°C、处理pH值3~7、和含纤维素的生物质固体成分浓度0.1~30%。通过设定为上述的最适反应条件范围，可以最大限度地发挥生物质水解效率。该水解处理可以以分批式进行，也可以以连续式进行。通过这样的酶处理得到的水解物包含葡萄糖、木糖等单糖成分，因而可以作为乙醇、乳酸等的发酵原料糖使用。
[0080]使用本发明所得的纤维素酶时，还可以加入氧化酶、还原酶、水解酶、转移酶、异构酶等具有其他功能的酶成分支持酶剂。特别是作为这样的具有其他功能的酶成分，可以添加来源于不限于丝状菌的所有生物的酶成分、通过基因重组而生产的酶成分而使用。
[0081]关于用于实施本发明的装置，作为其实施方式使用图4和图5进行说明。图4和图5是显示实施本发明的装置的一例的剖面图。
[0082]在图4的装置中，涉及使用螺旋元件型的截留分子量100，000~200，000的超滤
膜的装置。来源于丝状菌的纤维素酶水溶液保持在纤维素酶水溶液罐I中。为了在本罐I内进行PH值调整，而在罐内设置pH值传感器2，检出的pH值信号被送达pH值调整泵3。pH值调整泵3与包含酸或碱的pH值调整剂罐4连接，将pH值调整剂送液至纤维素酶水溶液罐I。纤维素酶水溶液罐I介由超滤膜泵6而与截留分子量100，000~200，000的超滤膜8连接。
[0083]在图4的装置中，截留分子量100，000~200，000的超滤膜8连接成树状结构，但不特别限定。另外，截留分子量100，000~200，000的超滤膜8的透过液与透过液保持罐10连接。截留分子量100，000~200，000的超滤膜8的非透过液作为第I浓缩酶液而被回收。作为非透过液的浓缩酶液只要能够获得必要充分的分离.浓缩，则可以直接作为第I浓缩酶液回收，也可以为了获得更充分浓缩倍率而连接至纤维素酶水溶液罐I使其循环。[0084]关于截留分子量100，000~200，000的超滤膜的透过液，进一步用平均截留分子量5，000~50，000的第2超滤膜进行分离.浓缩。透过液保持罐10介由阀11和超滤膜泵12与截留分子量5，000~50，000的超滤膜13连接。截留分子量5，000~50，000的超滤膜13可以如图4所示连接成树状结构。截留分子量5，000~50，000的超滤膜13的非透过液作为浓缩酶液被回收。浓缩酶液被回收至第2浓缩酶液保持罐14，透过液被回收至第2透过液保持罐15。
[0085]图5的装置是作为截留分子量100，000~200，000的超滤膜8使用外压式中空丝超滤膜时的实施方式。使用外压式中空丝超滤膜时，具备产生用于清洗中空丝膜表面的气泡的压缩机7和用于使用截留分子量100，000~200，000的超滤膜8的透过液进行膜的逆清洗的逆洗泵9。此外与图4的装置相同。
[0086]实施例
[0087]以下列举实施例具体说明本发明。但本发明不限于这些实施例。
[0088](参考例I)木霉属菌的培养液的调制方法
[0089]木霉属菌的培养液通过以下的方法调制。
[0090][前培养]
[0091]以玉米浸溃液5% (w/vol)、葡萄糖2% (w/vol)、酒石酸铵0.37% (w/vol)、硫酸铵0.14(w/vol)、磷酸二氢钾0.2% (w/vol)、氯化钙二水合物0.03% (w/vol)、硫酸镁七水合物 0.03% (w/vol)、氯化锌 0.02% (w/vol)、氯化铁(III)六水合物 0.01% (w/vol)、硫酸铜(II)五水合物0.004 % (w/vol)、氯化锰四水合物0.0008% (w/vol)、硼酸0.0006 %(w/vol)、和七钥酸六铵四水合物0.0026% (w/vol)的方式添加至蒸懼水中，将IOOmL加入500mL带挡板的三角烧瓶中，在121 °C的温度下高压釜灭菌15分钟。放冷后，添加与其分别在121 °C的温度下高压釜灭菌15分钟的PE-M和Tween80各0.01% (w/vol)。在该前培养培养基中接菌里氏木霉ATCC66589使其为I X IO5个/mL，以28°C的温度、72小时、180转/分钟振荡培养，作为前培养(振荡装置=TAITEC社制BIO-SHAKER BR-40LF)。
[0092][主培养]
[0093]以玉米浸溃液5% (w/vol)、葡萄糖2% (w/vol)、纤维素(艾维素)10% (w/vol)、酒石酸铵0.37% (w/vol)、硫酸铵0.14% (w/vol)、磷酸二氢钾0.2% (w/vol)、氯化钙二水合物0.03% (w/vol)、硫酸镁七水合物0.03% (w/vol)、氯化锌0.02% (w/vol)、氯化铁
(III)六水合物0.01% (w/vol)、硫酸铜(II)五水合物0.004% (w/vol)、氯化猛四水合物0.0008% (w/vol)、硼酸 0.0006% (w/vol)、和七钥酸六铵四水合物 0.0026% (w/vol)的方式添加至蒸馏水中，将2.5L加入5L容量的搅拌广口瓶(ABLE社制DPC-2A)容器中，在121°C的温度下高压釜灭菌15分钟。放冷后，添加与其分别在121°C的温度下高压釜灭菌15分钟的PE-M和TWeen80各0.1 %，接种250mL预先通过上述的方法在液体培养基中进行了前培养的里氏木霉ATCC66589。然后，在28°C的温度、87小时、300转/分钟、通气量Ivvm的条件下进行振荡培养，离心分离后，将上清进行膜过滤($ ') 社制的f 'J力y 7°”_GV、材质:PVDF)。将该前述条件下调整的培养液作为来源于木霉属菌的纤维素酶水溶液，在以下的实施例中使用。
[0094](参考例2)糖浓度的测定
[0095]糖液所含的葡萄糖和木糖浓度，在下述所示的HPLC条件下通过与标准品的比较来定量。
[0096]柱:LunaNH2 (Phenomenex 社制)
[0097]移动相乙腈=25:75(流速0.6mL/分钟)
[0098]反应液:无
[0099]检出方法:RI (差示折射率)
[0100]温度:30°C。
[0101](参考例3)纤维素酶的活性测定方法
[0102]纤维素酶活性分为(I)艾维素(Avicel)分解活性、(2)纤维二糖分解活性和(3)木聚糖分解活性的3种分解活性，通过以下步骤对活性进行测定评价。
[0103](I)艾维素(Avicel)分解活性
[0104]相对于酶液(在规定条件下调制)，添加艾维素(Avicel) ^ 社制)lg/L和乙酸钠缓冲液(pH值5.0) IOOmM,在50°C的温度下一边旋转混合24小时一边进行反应。反应后，将管离心分离，测定其上清成分的葡萄糖浓度。葡萄糖浓度依照参考例2所记载的方法测定。艾维素(Avic el)分解活性将生成的葡萄糖浓度(g/L)直接作为活性值。
[0105](2)纤维二糖分解活性
[0106]相对于酶液添加纤维二糖(和光纯药)500mg/L和乙酸钠缓冲液(pH值5.0) IOOmM,在50°C的温度下一边旋转混合0.5小时一边进行反应。反应后，将管离心分离，测定其上清成分的葡萄糖浓度。葡萄糖浓度依照参考例2所记载的方法测定。纤维二糖分解活性将生成的葡萄糖浓度(g/L)直接作为活性值。
[0107](3)木聚糖分解活性
[0108]相对于酶液,添加木聚糖(Birch wood xylan、和光纯药)10g/L和乙酸钠缓冲液(pH值5.0) IOOmM,在50°C—边旋转混合4小时一边进行反应。反应后，将管离心分离，测定其上清成分的木糖浓度。木糖浓度依照参考例2所记载的方法测定。木糖分解活性将生成的木糖浓度(g/L)直接作为活性值。
[0109](参考例4)蛋白质浓度的测定
[0110]蛋白质浓度的测定使用Pierce BCA Protein Assay Kit,依照该Kit的规程进行。将白蛋白标准(Albumin standard) (2mg/mL)进行连续稀释并同样地测定而制作蛋白质浓度的标准曲线，通过将标准曲线与目的样品进行比色来定量。
[0111](参考例5)利用截留分子量100，000的超滤膜的来源于木霉属菌的纤维素酶水溶液的膜分尚.浓缩
[0112]将上述参考例I所调制的来源于木霉属菌的纤维素酶稀释至3.5g/L，对其使用稀盐酸或稀氢氧化钠调制pH值2、pH值3、pH值4、pH值5、pH值6、pH值7、pH值8、pH值9、pH值10、pH值11、和pH值12 (pH值2~12)的水溶液。pH值调整后，再测定蛋白质浓度，结果为3.5g/L左右，因而将这些pH值调整后的纤维素酶水溶液的蛋白质浓度视为3.5g/L，实施以下评价。
[0113]将所述pH值调整后的来源于木霉属菌的纤维素酶水溶液(pH值2~12)各20mL，使用截留分子量 100，000 的超滤膜(Sartorius 社制 “VIVASPIN” 20、100，000MWC0、PES、有效膜面积6cm2)，通过死端过滤进行浓缩直至非透过液的液量为0.5mL (温度25°C、离心力6000g)。为了测定浓缩液的蛋白质的量和纤维素酶活性，一边测定回收的浓缩液的质量，一边加RO水并定容至作为初始质量的20g(20mL)。将此作为非透过液，在以下分析中使用。另外关于透过液，不将超滤膜的透过液进行特别的稀释等处理，直接作为透过液进行以下分析。
[0114]非透过液和透过液的蛋白质浓度的测定通过上述参考例4记载的方法进行。另外，对于前述的非透过液和透过液，使用Bioanalyzer (Agilent社、Protein230kit)进行电泳。将所得的电泳结果示于图2。在图2中,在pH值2~10的任一 pH值下,均能确认由来源于木霉属菌的纤维素酶纤维二糖水解酶产生的带，但判明了依赖于木霉属纤维素酶水溶液的PH值而各带有浓淡。特别是判明了在pH值3、pH值4和pH值5下，纤维二糖水解酶(CBH)的带浓度浓(图2)，在超过pH值6的情况或者pH值2的情况下，各个纤维二糖水解酶的带浓度倾向于变薄。另外可以确认该结果与用Bioanalyzer算出的纤维二糖水解酶浓度相比倾向完全一致。结果示于表1。
[0115]表1
【权利要求】
1.纤维素酶的制造方法，包括以下的工序(I)~(3)， 工序(I):使来源于丝状菌的纤维素酶水溶液通过截留分子量100，000~200，000的超滤膜进行过滤，得到透过液，同时作为非透过液得到浓缩酶液， 工序(2):使工序(1)所得的透过液进一步通过截留分子量5，000~50，000的第2超滤膜进行过滤，作为非透过液得到第2浓缩酶液， 工序⑶:将工序⑴和⑵所得的浓缩酶液混合，得到来源于丝状菌的纤维素酶。
2.根据权利要求1所述的纤维素酶的制造方法，丝状菌是木霉属菌。
3.根据权利要求1或2所述的纤维素酶的制造方法，在工序(I)中，将来源于丝状菌的纤维素酶水溶液调整为pH值2.6~5.4或pH值8.6~9.4。
4.根据权利要求1~3的任一项所述的纤维素酶的制造方法，来源于丝状菌的纤维素酶水溶液是丝状菌培养液或使用了来源于丝状菌的纤维素酶的含纤维素的生物质的水解物。
5.根据权利要求1~4的任一项所述的纤维素酶的制造方法，来源于丝状菌的纤维素酶水溶液包含选自纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和木聚糖酶中的I种以上酶成分。
6.根据权利要求1~5的任一项所述的纤维素酶的制造方法，来源于丝状菌的纤维素酶水溶液的温度为15~35°C的温度范围。
7.纤维素酶的制造装置,该装置包含:纤维素酶水溶液罐、与该纤维素酶水溶液罐连接的超滤膜泵、至少1个以上串联或并联地连接的截留分子量100，000~200，000的超滤膜、所述超滤膜的透过液保持罐、截留分子量5，000~50，000的第2超滤膜、和第2浓缩酶液保持te。
8.根据权利要求7所述的纤维素酶的制造装置，纤维素酶水溶液罐具备pH值传感器，进而该纤维素酶水溶液罐连接有pH值调整剂罐。
【文档编号】C12N9/42GK103958678SQ201280057111
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年11月21日 优先权日:2011年11月21日
【发明者】栗原宏征, 山田胜成 申请人:东丽株式会社