来自糖化生物质分离的纤维素酶再循环的制作方法
【专利说明】来自糖化生物质分离的纤维素酶再循环
[0001] 相关专利申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2013年3月15日提交的美国临时专利申请No. 61/798, 070的优先 权，W引用的方式将其整体并入本文。
【背景技术】
[0003] 酶水解是基于生物质生产生物燃料的重要步骤。酶水解省去了对大量酸和中和此 酸的需求，但目前商业化纤维素酶的成本较高，并且酶对纤维素和半纤维素聚合物的作用 可能较慢。另一方面，虽然水解机制W及各种纤维素酶的结构和功能之间的关系已被广泛 研究，酶活性的许多细节仍然知之甚少。
[0004] 木质纤维素底物的酶水解强烈受到终产物抑制和酶特性的影响。因此，生物质水 解与W下因素直接或间接相关：底物可用性、终产物积累和/或在生物质预处理期间或之 后产生的酶抑制剂（运阻碍纤维素酶对其各自底物的特异性活性）。对底物的低特异性催 化剂活性限制了水解效力。
【发明内容】
阳〇化]本方法设及改进纤维素生物质的糖化来生产可转化为有用的下游产物（如生物 燃料）的糖。在该方法中，在适于将生物质组分水解成糖的条件下，使生物质与催化剂接 触。在一些实施方式中，所述条件包括在高剪切揽拌化i曲-shearagitation)条件下，使 生物质与催化剂接触。在一些实施方式中，在使生物质与催化剂接触W将生物质组分水解 成糖之前，使用高剪切磨碎设备（hi曲shearmillingdevice)对生物质进行处理，W产 生相对均一的粒径。将得到的水解生物质混合物分离成包含糖的液体流和包含固体的固体 流，其中，两相都构成残留酶Cresi化曰1enzymes),在本文的实施方式中对其进行说明。在 一些实施方式中，在生物质部分水解之后进行分离步骤。在适于将固体组分水解成糖的条 件下，将固体进一步解育，从而生产额外的糖。在一些实施方式中，在约6小时至约24小时 内，该方法将生物质中至少80 %的葡聚糖转化成葡萄糖。
[0006] 因此，在一方面，描述了用于从生物质生产糖的方法，所述方法包含：
[0007] (a)在适于将生物质组分水解成糖的高剪切揽拌条件下，使所述生物质与催化剂 接触，从而产生包含糖的固液混合物；
[0008] 化）将所述混合物分离成包含糖的液体流和包含固体的固体流；
[0009] (C)在适于将固体组分水解成糖的条件下解育所述固体，从而生产额外的糖。
[0010] 在另一方面，描述了用于从生物质生产糖的方法，所述方法包含：
[0011] (a)使用包含转子和定子的高剪切/磨碎混合设备对所述生物质进行预处理，其 中，所述高剪切/磨碎混合设备在所述转子和所述定子之间具有约0.1毫米至2.2毫米的 间隙设置（gapsetting),从而减小所述生物质中生物质颗粒的粒径；
[0012] 化）使所述生物质与催化剂接触W将生物质组分水解成糖，从而产生包含糖的固 液混合物；
[0013] (C)将所述混合物分离成包含糖的液体流和包含固体的固体流；
[0014] (d)在适于将固体组分水解成糖的条件下解育所述固体流，从而生产额外的糖。
[0015]在上述方面的一些实施方式中，生物质包含葡聚糖，且生物质中至少80%的葡聚 糖在约6小时至约24小时内被水解成葡萄糖。在一些实施方式中，生物质是木质纤维素生 物质。在使生物质与催化剂接触之前，生物质可包含至少约lOw/w%的固体。在使生物质与 催化剂接触之前，也可对生物质进行预处理。催化剂可包括酶（如水解酶），或可为非酶催 化剂。
[0016]在一些实施方式中，高剪切揽拌条件产生如下生物质粒径：其中，至少约80%的 颗粒具有约1微米至约800微米、约2微米至约600微米、约2微米至约400微米或约2微 米至约200微米的粒径。
[0017]在一些实施方式中，使用机械设备、过滤器、膜或切向流过滤设备将混合物分离。 机械设备可为离屯、机、压力机（press)或筛（screen)。
[0018]在一些实施方式中，在将混合物分离成液体流和固体流之前，使生物质混合物部 分水解不同时间长度。例如，在一些实施方式中，在使生物质与催化剂接触约2小时至约4 小时、或约4小时至约6小时后，进行分离步骤。在一个实施方式中，当存在于生物质中的 约30%至约60%的葡聚糖转化成葡萄糖时，将生物质混合物分离成液体流和固体流。相较 于不包含将混合物分离成液体流和固体流、并在适于将固体组分水解成糖的条件下解育固 体流的步骤的方法，本文所述的方法提高了葡聚糖向葡萄糖的转化量。在一些实施方式中， 相较于不包含额外的分离和解育步骤的方法的葡聚糖转化量，该方法的葡聚糖转化量至少 提局10%。
[0019]在一些实施方式中，使固体流在适于将固体组分水解成糖的条件下解育约8小时 至约20小时。还可在高剪切揽拌条件下对固体流进行解育。
[0020] 在一些实施方式中，在间歇化atch)、半间歇（semi-batch)或连续（continuous) 工艺中使固体流与额外的生物质接触。额外的生物质也可包含将生物质组分水解成糖的催 化剂。
[0021] 在一些实施方式中，该方法生产的糖被加工成乙醇、生物燃料、生化制品或其它化 学产品。在一些实施方式中，相较于未依据本方法进行处理的生物质，从所述生物质混合物 中分离出的液体流包含增加量的化合物，例如慷醒、低聚糖和酪类。在一些实施方式中，相 较于未在高剪切条件下处理的生物质，所述生物质的水解组分包含降低浓度的污染物。
[0022] 在一些实施方式中，在使用高剪切设备对生物质进行处理之后，使生物质与适于 将生物质组分水解成糖的催化剂接触。
[0023]在一些实施方式中，高剪切揽拌条件包含使用高剪切/磨碎混合设备对生物质进 行处理，所述高剪切/磨碎混合设备包含转子和定子。依据所用的生物质类型，所述转子和 所述定子之间的间隙设置可在约0.1毫米至约2.2毫米之间。
[0024]在一个实施方式中，所述方法进一步包含将液体流分离成包含糖的第二液体流和 包含固体的第二固体流；W及在适于将固体组分水解成糖的条件下解育第二固体，从而生 产额外的糖。
[00巧]在一些实施方式中，在预处理步骤之前或在使生物质与高剪切磨碎设备接触之 前，将生物质与水混合W提供生物质/水混合物。
[00%] 在此对本发明进一步的实施方式进行说明。 W27] 定义
[0028]除非另有定义，本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的 技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管基本上与本文所述的方法和材料类似的任何方 法和材料都可W用于本发明的实践或测试中，但是仅对示例性方法和材料进行了描述。为 了本发明的目的，下面对W下术语进行定义。
[0029] 除非上下文清楚地另外指明，术语"一种/ 一个"和"该/所述"包括复数所指物。
[0030] 术语"催化剂"指的是提高化学反应（如纤维素水解）的速率、或允许反应在较低 溫度下W基本相同的速率进行的化合物或物质。该术语包括将木质纤维素生物质转化成 多糖、低聚糖和/或简单的可发酵糖的水解和糖化酶。该术语还包括由基因工程化植物或 转基因植物生产的糖化酶，例如，如Ra化等人在美国专利公开2012/0258503中所描述的， W引用的方式将其整体并入本文。该术语还包括聚合物酸催化剂，例如，如在美国专利公开 2012/0220740、2012/0252957和2013/0042859中所描述的，W引用的方式将它们各自整体 并入本文。
[0031] 术语"生物质"指的是包含木质纤维素材料的任意材料。木质纤维素材料由=种 主要组分组成：纤维素、半纤维素和木质素。纤维素和半纤维素包含包括多糖和低聚糖在内 的碳水化合物，并且可W与诸如蛋白质和/或脂质等其它组分组合。生物质的实例包括农 产品，例如谷物，如玉米、小麦和大麦；甘薦；玉米賴杆、玉米棒、甘薦渣、高梁和食用植物的 其它不可食用的废物部分；食物废物；草类，如柳枝稷；W及林业生物质，如木材、纸、木板 (board)和废木材产品。
[0032] 术语"木质纤维素"指的是同时包含木质素和纤维素的材料，并且也可W包含半纤 维素。
[0033] 关于材料或组合物的术语"纤维素"指的是包含纤维素的材料。
[0034] 术语"葡聚糖"指的是所有的a -连接和0 -连接的1，4葡萄糖单元均聚物。
[0035] 术语"适于将生物质组分水解成糖的条件"指的是使固相生物质与一种或多种催 化剂（包括但不限于纤维素酶、半纤维素酶和辅助酶或蛋白质）接触，W由生物质中的多糖 生产可发酵糖和链较短的低聚糖。该条件可进一步包括最适合糖化酶活性的抑，例如，约 4. 0至约7. 0的抑范围。该条件可进一步包括最适合催化剂（包括糖化酶）活性的溫度， 例如，约20°C~100°C、约35°C~75°C或约40°C~60°C的溫度范围。
[0036] 术语"高剪切揽拌"、"高剪切混合"和"高剪切磨碎"或"高剪切磨碎/糖化"指的 是将生物质置于高剪切条件下，W降低生物质粒径和/或增强包含催化剂的生物质混合物 的混合。在一些实施方式中，所述条件产生约1微米至约800微米的生物质粒径分布。在 一些实施方式中，生物质粒径分布如下：至少约70 %、75 %、80 %、85 %、90 %或95 %的颗粒 具有约1微米至约800微米、约2微米至约600微米、约2微米至约400微米或约2微米至 约200微米的粒径。可W由本领域熟知的设备提供高剪切条件，例如，由ICS型孔口反应器 (orificereactor)度uchen-IndustrialCatalystService)、旋转胶体型磨机、Silverson 混合器、气蚀磨碎（cavitationmilling)设备、螺旋钻（auger)、磨碎螺旋钻或蒸汽辅助水 力喷射式化y化o-jet)磨机提供。在一些实施方式中，高剪切设备包括具有静止定子和旋 转转子定位的任何设备，W在运行期间保持转子和定子之间的物理间隙，使得在该间隙内 或沿着该间隙产生高剪切区。在一些实施方式中，高剪切设备包含螺旋钻磨碎设备，所述螺 旋钻磨碎设备的磨碎杆或磨碎棒插在螺旋钻叶片之间并包含在螺旋钻叶片插槽内，运允许 磨碎杆在螺旋钻直径的中屯、和壁区域之间行进。当螺旋钻旋转时，磨碎杆行进至螺旋钻组 件中屯、（处于被定义为零度位置的旋转顶部）。随着旋转进展超过90度并向180度旋转位 置行进，磨碎杆落向螺旋钻组件的外径或壁，从而，由于螺旋钻叶片的旋转，当磨碎杆沿螺 旋钻的较低区域行进时，上述运动产生由磨碎杆质量击打生物质而导致的磨碎作用。螺旋 钻杆可W配备有多种表面特征，W支持生物质的有效磨碎，并且可W配置在沿着螺旋钻叶 片的各种位置，W保持旋转中的平衡和生物质转化的最佳条件。可W在预处理和糖化工艺 步骤之前和/或期间，W任意组合使用运些高剪切磨碎设备，W提高生物质向糖的转化。
[0037] 术语"糖化"也称为"水解"，指的是从生物质或生物质原料或包含非纤维素类生物 质的原料生产糖和短链低聚糖。糖化可由催化剂实现，所述催化剂包括水解酶、纤维素酶、 a-淀粉酶、葡萄糖-淀粉酶、0-葡糖巧酶和/或辅助蛋白质，所述辅助蛋白质包括但不限 于过氧化物酶、虫漆酶、扩张素（expansins)和膨胀素（swollenins)。"水解"指的是打破 多糖中的糖巧键并引入水W产生简单的单体糖和/或低聚糖。例如，纤维素的水解产生6 碳（C6)糖（例如葡萄糖）和低聚葡萄糖，而半纤维素的水解产生5碳（C5)糖（例如木糖 和阿拉伯糖）和6碳（C6)糖（例如半乳糖和甘露糖）和各种低聚糖。可通过各种技术、工 艺和/或方法来实现从聚合的纤维素纤维和生物质生产短链纤维素类的糖。例如，可W用 水来水解纤维素W产生纤维素类的糖。可通过使用水解酶、化学品、机械剪切、热和压力环 境或上述技术的任意组合来辅助和/或加速水解。水解酶的实例包括P-葡糖巧酶、木聚 糖酶、纤维素酶和半纤维素酶。纤维素酶是多种酶的混合物（包括外切纤维二糖水解酶、内 切葡聚糖酶和P-葡糖巧酶）的通用术语，运些酶联合作用W将纤维素水解成纤维二糖和 葡萄糖。化学品的实例包括强酸、弱酸、弱碱、强碱、氨或其它化学品。机械剪切包括高剪切 孔口（hi曲shearorifice)、气蚀、胶体磨机和螺旋钻磨机。
[0038] 术语"可发酵糖"指的是在发酵过程中（例如，在由酵母进行的发酵过程中）可W 转化成乙醇或其它产物（例如但不限于甲醇、下醇、丙醇、班巧酸和异戊二締）的糖。例如， 葡萄糖是从纤维素的水解衍生而来的可发酵糖，而木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖是从半 纤维素的水解衍生而来的可发酵糖。
[0039] 术语"同步糖化和发酵（SS巧"指的是如下工艺：通过生物质的酶水解生成可发酵 糖，运些糖几乎马上就在发酵过程中被消耗，从而产生有价值的产物（如生物燃料）。运与 术语"分步水解和发酵（SH巧"相反，在SHF中，生物质的酶水解在糖的发酵转化之前发生。
[0040] 术语"预处理"指的是使用物理、热、化学或生物手段或上述手段的任意组合对生 物质进行处理，从而使生物质更