一种真菌来源的耐热酸性纤维素酶及其基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及一种来源于真菌的耐热酸性纤维 素酶及其基因和应用。
【背景技术】
[0002] 植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素及木质素等物质构成。纤维素是一种重要的 多糖，它是植物细胞支撑物质的材料，是自然界最丰富的生物质资源，纤维素的结构确定 为β-D-葡萄糖单元经β -（1 - 4)糖苷键连接而成的直链多聚体，结构中没有分支，其 能够被纤维素酶降解为葡萄糖。
[0003] 纤维素酶是指能够水解葡萄糖苷键，将纤维素分解成纤维二糖和葡萄糖的一组酶 的总称。其对纤维素的水解过程主要包括三步：第一步是内切型纤维素酶作用于纤维素内 部的无定形区，随即水解β -（1 - 4)糖苷键将纤维素分子截短，随后外切型纤维素酶，作 用于纤维素线状分子末端，水解β -（1 - 4)糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，最后， 葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。
[0004] 近年来，随着绿色饲料的兴起以及人们环保意识的增强，能源的再生利用研究，人 们对纤维素酶的研究和利用已进入了一个新的阶段。纤维素酶已被广泛应用于食品、医药、 饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶， 具有很大的潜在应用价值。
[0005] 纤维素酶广泛存在于细菌、放线菌、真菌、植物、动物等生物中。不同的微生物产生 的纤维素酶，其结构和功能差异较大，纤维素酶按作用的最适PH不同可分为：酸性纤维素 酶（最适PH约为4. 8)，它是目前研究较多和应用最广泛的纤维素酶，主要由康氏木霉，里氏 木霉，绿色木霉，黑曲霉，青霉等产生；中性纤维素酶（最适PH6-8，），主要由长梗木霉，腐殖 菌，芽孢杆菌等产生；碱性纤维素酶（最适PH8-11)，主要由嗜热芽孢杆菌，腐殖菌等产生。 自然界中存在的纤维素资源来源复杂，其结构和功能差异较大，不同来源的纤维素酶对它 们的降解效果也不尽相同，针对不同来源的纤维素寻找降解效果较高的纤维素酶，是当前 纤维素酶领域的热点之一。目前国内外，虽然许多纤维素酶被克隆分离及性质测定，但这些 酶的性质特征，均存在一些缺陷，例如，PH作用范围不合适，热稳定性差，表达量低等，均不 能满足实际应用的需要。因此人们希望能够找到新的能够满足实际应用需求的纤维素酶， 从而能够进一步推广纤维素酶在饲料、食品、医药等行业中应用。
[0006] 本发明从Bispora sp. MEY-I菌株中得到了一个新的纤维素酶基因，其编码的纤维 素酶具有以下几个优点：耐热、酸性、广泛的底物特异性、容易发酵生产。所有这些优点都意 味着新发明的纤维素酶在饲料、食品、医药等行业中，更有应用价值。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种耐热、酸性、底物特异性比较广泛的纤维素酶。
[0008] 本发明的再一目的是提供上述纤维素酶的基因。
[0009] 本发明的再一目的是提供包含上述纤维素酶的重组载体。
[0010] 本发明的再一目的是提供包含上述纤维素酶基因的重组菌株。
[0011] 本发明的再一目的是提供一种制备纤维素酶的方法。
[0012] 本发明的再一目的是提供上述纤维素酶的应用。
[0013] 本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、 适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的纤维素酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 :
[0014]
[0015] 其中，该酶全长428个氨基酸，N端17个氨基酸为信号肽序列 " MKAVLFTITAAAGSAYA '
[0016] 因此，成熟的纤维素酶Cel5的理论分子量为43. 3kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 ：
[0017]
[0018] 该纤维素酶的最适pH为3. 5,在pH2. 5_pH4. 5范围内，该酶能够维持其60%以上 的酶活力；最适温度70°C，在80°C时依然具有30%的酶活力，在60°C下处理60min，酶活基 本不损失，在70°C下处理lOmin，依然能够保持40%的酶活力，具有良好的稳定性。
[0019] 本发明还提供了编码上述纤维素酶的基因。该酶的全基因序列如SEQ ID NO. 3所 示：
[0020]
[0022] 本发明通过PCR的方法分离克隆了这个纤维素酶基因 Cel5, DNA全序列分析结果 表明，纤维素酶Cel5结构基因全长1435bp，含有3个内含子，+74~120bp，+617~665， +844~895为其内含子序列，cDNA长1287bp，其cDNA序列如SEQ ID NO. 4所示：
[0023]
[0024] 其中，信号肽的碱基序列为：
[0025] "ATGAAGGCTG TTCTATTCAC CATCACGGCA GCAGCTGGTT CTGCTTACGC T"
[0026] 因此，成熟基因的编码序列为
[0027] SEQ ID NO. 5 所示：
[0028]
[0029] 成熟蛋白理论分子量为43. 3kDa，该酶属于糖基水解酶第5家族。将纤维素酶基 因 Cel5cDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，确定Cel5是 一种新的纤维素酶。
[0030] 本发明还提供了包含上述纤维素酶基因的重组载体，优选为pPIC9-ce15。将本发 明的纤维素酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的 与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将纤维素酶基因插 入到质粒PPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于Α0Π 启 动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-cel5。
[0031] 本发明还提供了包含上述纤维素酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/ cel5〇
[0032] 本发明还提供了一种制备纤维素酶的方法，包括以下步骤：
[0033] 1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0034] 2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶的表达；以及
[0035] 3)回收并纯化所表达的纤维素酶。
[0036] 其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris)细胞、啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)细胞或多型汉逊酵母（Hansenula polymorpha)细胞，优选 将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞（Pichic pastoris)GS115,得到重组菌株GS115/ cel5〇
[0037] 本发明还提供了上述纤维素酶的应用。运用基因工程手段来产业化生产纤维素 酶。
[0038] 本发明提供了一个新的纤维素酶基因，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据 本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的纤维素酶。
【附图说明】
[0039] 图I Cel5在毕赤酵母中表达的SDS-PAGE分析
[0040] 图2本发明重组纤维素酶的最适pH值。
[0041] 图3本发明纤维素酶的pH稳定性。
[0042] 图4本发明纤维素酶最适反应温度。
[0043] 图5本发明纤维素酶热稳定性。
【具体实施方式】
[0044] 试验材料和试剂
[0045] 1、菌株及载体：毕赤酵母（Pichia pastoris GSl 15)为本实验室保存；毕赤酵母 表达载体pPIC9及菌株GSl 15购自于Invitrogen公司。
[0046] 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司， 其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。
[0047] 3、培养基：
[0048] (I)产酶培养基：30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆柏，5g/L大麦葡聚糖，5g/ L(NH4)SO4, lg/L KH2PO4,0· 5g/L MgSO4 · 7Η20,0· Olg/L FeSO4 · 7Η20,0· 2g/L 〇&(：12于 IL 去 离子水中，121°C，15镑条件下灭菌处理20min
[0049] (2)大肠杆菌培养基1^(126蛋白胨、0.5%酵母提取物、126似(：1，？!17.0)。
[0050] (3) BMGY 培养基；1 %酵母提取物，2 % 蛋白胨，1. 34 % YNB，0· 000049〈Biotin，1 % 甘油（v/v)。
[0051] (4) BMMY培养基：除以0· 5 %甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4. 0。
[0052] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0053] 实施例1纤维素酶编码基因 cel5的克隆
[0054] 提取 Bisp