一种用于复合生物菌肥的纤维素酶制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物发酵领域。更具体地，涉及一种用于复合生物菌肥的纤维素酶制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]农作物秸杆是很重要的有机肥源。其养分丰富，来源广，数量多，可直接还田。是生物菌肥的重要原料。中国主要农作物秸杆每年总生成量平均为4亿多吨，按稻草还田率30%,麦秸还田率45%，玉米秸还田率20%计算，每年可用作有机肥料的秸杆就有1.3亿多吨，约可提供氮素66万吨，磷素40万吨，钾10.6万吨，农作物秸杆主要成分为纤维素。纤维素酶制剂促进土壤纤维素的迅速分解，有助于土壤腐殖质的形成和碳素养分的释放，因此，纤维素的分解和利用对提高土壤肥力和增加作物产量有十分重要的意义。
[0003]纤维素酶制剂是能降解纤维素的一类酶的总称，由多种酶构成的一个复杂酶系，主要来自于真菌和细菌.现己确定纤维素酶制剂含有三种主要组分:(I)葡聚搪内切酶:也称Cx酶、CMC酶，来自真菌的简称EG，来自细菌的简称Len。它能水解溶解的纤维素衍生物，以及膨胀和部分降解纤维素，但不能作用于结晶的纤维素。可将长链纤维素分子截断。产生大量带有非还原末端的小分子纤维素。它的主要产物是纤维糊精、纤维二糖和纤维三糖。
(2)葡聚糖外切酶:也称Cl酶，来自真菌的简称CBH，来自细菌的简称Cex。是纤维素酶系中的重要组分，在天然纤维素的降解过程中起主导作用，它能从纤维素链的非还原性末端切割，水解糖昔键，每次切下一个纤维二糖分子，生成可溶的纤维糊精和纤维二糖，故称纤维二糖水解酶。(3) β -葡萄糖普酶:简称BG，它能水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快，随着葡萄糖聚合度的增加，水解速度下降，这种酶的专一性比较差。
[0004]自然界中有很多微生物能够分解纤维素，产纤维素酶的微生物大多属于真菌，其中研究较多的类群是丝状真菌，尤其以曲霉、木霉、青霉的能力最显著。木霉类群中的绿色木霉(Trichoderma viride)、拟康氏木霉(Trichoderma psoudokoningi)康氏木霉(Trichoderma koniggii)、里氏木霉(Trichoderma ressiei)、黑曲霉(Aspergillusniger)等是高活性的代表菌种。
[0005]目前，国内关于纤维素酶的研究多集中于固态发酵，该发酵方法具有产品外观粗糙，质量不稳定，杂质含量高，某些组分常常吸附于固体残余物上，增加了提取难度，不利于现代化流水作业等缺点。液态发酵具有酶组分不理想、分离提取工作量大、耗能高及投资多等缺点。而我国液态发酵纤维素酶还处于实验阶段。本发明弥补了现有技术的不足，纤维素酶制剂的制备是将两种菌株分别培养后，不经提取，不加载体，将其培养物直接干燥粉碎，按一定比例混合而成。
【发明内容】
[0006]本发明的第一个目的在于提供一种纤维素酶制剂。
[0007]本发明的第二个目的在于提供一种纤维素酶制剂的制备方法。本发明制备方法所得的纤维素酶制剂充分发挥了酶组分间的协同作用，加强了酶活力，同时提高了酶的产量；且所得纤维素酶稳定性较好，易与底物分开。同时，此制备方法可长时间反复连续反应。
[0008]本发明的第三个目的在于提供一种纤维素酶制剂在复合生物菌肥中的应用。
[0009]为达到上述第一个目的，本发明采用下述技术方案:
[0010]一种纤维素酶制剂，包含纤维素酶，半纤维素酶，淀粉酶，蛋白酶及果胶酶。
[0011]为达到上述第二个目的，本发明采用下述技术方案:
[0012]—种纤维素酶制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0013]将康氏木霉菌株和黑曲酶菌株分别培养，培养后不经提取，不加载体，直接干燥粉碎，混合后即得纤维素酶制剂。
[0014]优选地，所述发酵过程中，菌株发酵时的PH为3.0-6.0，更优选地，所述PH为
4-5.5ο
[0015]优选地，所述发酵过程中，菌株发酵时的温度为20_60°C，更优选地，所述温度为20-28。。。
[0016]优选地，所述康氏木霉菌株与黑曲霉菌株的混合比例为40% -85%。
[0017]上述菌株的选择以及培养PH及温度的配合，与更换其中任何一个的配比相比，所得纤维素酶制剂中酶的活性更好，且产酶量更高，具有很好的协效产酶及提高酶活性的作用。
[0018]为达到上述第三个目的，一种纤维素酶制剂在复合生物菌肥中的应用，优选地，所述纤维素酶制剂用于土壤纤维素的发酵降解。
[0019]本发明的有益效果如下:
[0020]1.本发明制备方法极易将纤维素酶与底物、产物分开。
[0021 ] 2.本发明制备方法可在较长时间内反复进行分批反应和连续反应。
[0022]3.本发明制备方法提高了纤维素酶的稳定性。
[0023]4.本发明制备方法产物溶液中酶的残留较少，简化了提纯工艺。
[0024]5.本发明制备的纤维素酶，其酶活力高，酶的使用率高，降低成本。
[0025]6.本发明均采用废弃物作为培养基原料，绿色环保。
【具体实施方式】
[0026]为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
[0027]实施例1
[0028]—种纤维素酶制剂的制备方法，包括如下步骤:
[0029]I)菌株获得
[0030]本发明所用菌株为康氏木酶菌株和黑曲霉菌株。这两种菌株均是从吉林省泰新生物技术有限公司购买获得。
[0031]2)原材料
[0032]以稻草秸杆、玉米粉、麸皮，硫酸铵、尿素等为主要原材料。要求无酶变、无泥沙、无其他污物。
[0033]3)康氏木酶发酵过程
[0034]主要试剂:DNS试剂；1%乙酸一乙酸钠缓冲溶液；1%羧甲基纤维素钠溶液。培养基:去皮马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂15g、水1000ml，121°C高压蒸汽灭菌30min。固体发酵培养基:稻草、麸皮、尿素；改变固体培养基初始PH值为5.5，在室温(温度和湿度不恒定的条件下)，培养72小时。此经测定，时产酶活力最大，达到330U/g。
[0035]4)黑曲酶发酵过程
[0036]培养基:羟甲基纤维素钠(CMC);酵母膏；(NH4)2SO4;琼脂；pH = 5.5。种子培养基:水稻稻杆粉；小麦麸皮；(NH4)2SO4;玉米粉；CaCl 2；pH = 5.5。发酵培养基:水稻稻杆粉；小麦麸皮；黄豆；饼粉；玉米浆；KH2P04;CaCl 2;pH = 5.5。发酵原料:水稻秸杆:粉碎过60目筛；麸皮:过60目筛；玉米粉:过60目筛;(NH4)2SO45CaCl 2;KH 2P04等为分析纯。30°C培养，酶活性达198U/mL0
[0037]5)复合生物菌肥酶制剂获得
[0038]康氏木霉菌株和黑曲霉菌株分别培养后，不经提取，不加载体，将其培养物直接干燥粉碎，按照40:100的比例混合制成纤维素酶制剂。纤维素酶制剂所含纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和果胶酶。用于土壤纤维素的的发酵降解，改善土壤中有机成分，增强土壤肥力。
[0039]6)滤纸酶活力的检测
[0040]滤纸酶活力(FPA)按照国际理论和应用化学协会(IUPAC)推荐的标准方法测定，以国际单位IU表不。在试管中放入lX6cm(约50mg)的WhatlnanN0.1滤纸一条，加入0.5mL适当稀释的纤维素酶溶液和ImL柠檬酸缓冲液(0.05M、pH4.8)，将滤纸条充分浸没，于50°C下保温30min。空白试验中除酶液事先灭活外，其余条件不变。反应结束后用DNS法测定还原糖百分含量为20%。
[0041]实施例2
[0042]重复实施例1，区别在于，将步骤3)中固体发酵培养基的PH换为3.0，培养温度换为 20 0C ο
[0043]实施例3
[0044]重复实施例1，区别在于，将步骤3)中固体发酵培养基的PH换为6.0，培养温度换为 60。。。
[0045]实施例4
[0046]重复实施例2，区别在于，将步骤3)中固体发酵培养基的PH换为4.0，培养温度换为 28 0C ο
[0047]实施例5
[0048]重复实施例4，区别在于，将步骤3)中固体发酵培养基的PH换为5.5。
[0049]实施例6
[0050]重复实施例1，区别在于，将步骤4)中培养基、种子培养基以及发酵培养基的PH换为3.0，培养温度换为20 °C。
[0051]实施例7
[0052]重复实施例1，区别在于，将步骤4)中培养基、种子培养基以及发酵培养基的PH换为6.0，培养温度换为60°C。
[0053]实施例8
[0054]重复实施例2，区别在于，将步骤4)中培养基、种子培养基以及发酵培养基的PH换为4.0，培养温度换为28 °C。
[0055]实施例9
[0056]重复实施例4，区别在于，将步骤4)中培养基、种子培养基以及发酵培养基的PH换为 5.5o
[0057]显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【主权项】
1.一种纤维素酶制剂，其特征在于，包含纤维素酶，半纤维素酶，淀粉酶，蛋白酶及果胶酶。2.根据权利要求1所述的一种纤维素酶制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 将康氏木霉菌株和黑曲酶菌株分别发酵培养，培养后不经提取，不加载体，直接干燥粉碎，混合后即得纤维素酶制剂。3.根据权利要求2所述的一种纤维素酶制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵过程中，菌株发酵时的PH为3.0-6.0，优选地，所述PH为4-5.5。4.根据权利要求2所述的一种纤维素酶制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵过程中，菌株发酵时的温度为20-60 °C，优选地，所述温度为20-28 °C。5.根据权利要求2所述的一种纤维素酶制剂的制备方法，其特征在于，所述康氏木霉菌株与黑曲霉菌株的混合比例为40% -85%。6.根据权利要求1-5所述的一种纤维素酶制剂在复合生物菌肥中的应用，其特征在于，所述纤维素酶制剂用于土壤纤维素的发酵降解。
【专利摘要】本发明公开一种纤维素酶制剂及其制备方法。本发明纤维素酶制剂包含纤维素酶，半纤维素酶，淀粉酶，蛋白酶及果胶酶。将康氏木霉菌株和黑曲酶菌株分别培养，培养后不经提取，不加载体，直接干燥粉碎，混合后制得纤维素酶制剂。此制备方法简单且易于分离出纤维素酶，有利于提高纤维素酶的稳定性且所得纤维素酶活性高，酶的使用率高，成本低可长时间反复连续反应。
【IPC分类】C12N9/62, C12N9/42, C05F11/00, C12N9/26, C12N9/88
【公开号】CN105018445
【申请号】CN201510471911
【发明人】姜桂林, 姜寒, 陈琦昌
【申请人】吉林市新陆生态农业科技有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月5日