专利名称：纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶复合酶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种液态混合菌发酵纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的方法。
背景技术：
纤维质原料中纤维素、半纤维素、木质素分别占30 40%、15 30%、10 20%。 纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上最为丰富的可再生性天然资源。据估计，地球上纤维素中所蕴藏的能量大约相当于6400亿吨的石油所含的能量，而且纤维素的可再生性是石油等矿质能源所不可比拟的。充分利用纤维素酶处理纤维素，有可能从根本上解决人类所面临的能源与粮食问题，其深远影响是不可低估的。然而，目前约80%纤维素未被开发利用，具有极为诱人的前景。纤维素酶的生产和其它酶制剂一样，主要有固体发酵和液体深层发酵两种，国内外在这方面做了许多有价值的工作。固体发酵法是以玉米等农作物秸秆为主要原料，其投资少，工艺简单，产品价格低廉，目前国内绝大部分纤维素酶生产厂家均采用该技术生产纤维素酶。但是固体发酵法存在着一定的缺陷，以秸秆为原料的固体发酵法生产的纤维素酶自动化程度低，劳动强度大，产品质量不稳定。因此，随着液体发酵酶工艺的发展及菌种性能的提高，采用液体发酵法生产纤维酶素是必然趋势。木聚糖在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，是半纤维素中含量最丰富的一种。 木聚糖是由D-木糖主链(以0_1，4键相连)和L-阿拉伯糖分枝(a-l，2和a-l，3相连) 所组成的聚合物。半纤维素木聚糖在木质组织中占总量的50%，它结合在纤维素微纤维的表面，并且相互连接，这些纤维构成了坚硬的细胞相互连接的网络。这种坚硬的网络阻碍了纤维素酶对纤维素吸附，从而影响了纤维素的降解速率。在天然纤维素水解成葡萄糖的过程中，必须依靠3种组分的协同作用才能完成。 纤维素大分子首先在C1酶和Cx酶的作用下逐步降解成纤维二糖，而纤维二糖酶则进一步将纤维二糖水解成2个葡萄糖。由于高浓度的纤维二糖对C1酶和Cx酶活力有强烈的抑制作用，而在低浓度时则是纤维素酶的诱导物，如果纤维素酶复合组分中缺乏纤维二糖酶组分就会严重影响纤维素的降解速率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的复合酶及其制备方法。本发明提供的纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的复合酶的制备方法，其为将制备的绿色木霉液体种子和黑曲霉液体种子先后接入发酵培养基中发酵生产纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的复合酶。在本发明的一个实施方案中，先将绿色木霉液体种子以体积比1 5%的接种量接种后发酵3 8天后，以体积比1 5%的接种量接入黑曲酶液体种子，再共同发酵3 8天。优选的，先将绿色木霉液体种子以体积比5%的接种量接种后发酵3 8天后，以体积比3%的接种量接入黑曲酶液体种子，再共同发酵3 8天。其中，所述的发酵培养基为液体培养基。优选的发酵培养基含有微晶纤维素 20-30wt %、玉米浆5-10wt %、尿素5-10wt %、硫酸铵5_10wt %、磷酸氢二钾5_10wt %、硫酸镁 Tween800. l_lwt%，其余为水。本发明中，优选的发酵条件为pH维持在5 7，温度25 30°C，转速200 400 转/min，罐压0. 05 0. 15Mpa，通风比(发酵液体积气体体积)1 0. 5 1 1.5。其中，用于培养绿色木霉液体种子的种子培养基含有葡萄糖3-5wt%、玉米浆 2-4wt %、尿素l_3wt %、硫酸铵%、磷酸氢二钾%，硫酸镁0. 5-lwt %，其余组分为水。用于培养黑曲霉液体种子的种子培养基含有麸皮3-5wt%、尿素l-3wt%、硝酸铵 l-3wt%、磷酸二氢钾l_3wt%、碳酸钙l_3wt%，其余组分为水。本发明中，绿色木霉液体种子的制备方法如下将绿色木霉的孢子接入液体种子培养基中，20 30°C培养48小时。黑曲霉液体种子的制备方法如下将黑曲霉孢子接入液体种子培养基中，20 30°C培养48小时。本发明中，所述的绿色木霉优选为绿色木霉CGMCC 3. 3744，所述的黑曲霉优选为黑曲霉 CGMCC 3. 3150。本发明的关键点在于所得酶系丰富，各酶之间相互协同作用，促进酶活增加。用单一绿色木霉菌种发酵所得到纤维素酶活为20IU/ml，用单一黑曲霉菌种发酵所得到木聚糖酶酶活1000IU/ml，纤维二糖酶酶活50IU/ml，采用本技术混菌发酵后增加至纤维素酶活 50IU/ml，木聚糖酶酶活4000IU/ml，纤维二糖酶酶活400IU/ml。本发明中纤维素酶的测定方法用0. Ig滤纸作为底物，加0. 9mL pH4. 8柠檬酸缓冲液，再加 0. ImL粗酶离心上清液，50°C恒温水浴摇床反应30min，用3，5- 二硝基水杨酸法测定生成的还原糖，以葡萄糖为标准糖，以每分钟生成ι μ mol还原糖所需的酶量定义成一个纤维素酶酶活力单位(IU)。液体发酵好的醪液离心取上清液即为粗酶液。柠檬酸缓冲液为21g无水柠檬酸、7. 8g氢氧化钠加蒸馏水定容至2L，pH为4. 8。还原糖测定方法采用DNS法，以葡萄糖为标准。木聚糖酶的测定方法是用0. 2g木聚糖作为底物，加0. 9mL pH4. 8柠檬酸缓冲液， 再加0. ImL粗酶稀释液，50°C恒温水浴摇床反应30min，用3，5- 二硝基水杨酸法测定生成的还原糖，以木糖为标准糖，以每分钟生成1 μ mol还原糖所需的酶量定义成一个木聚糖酶酶活力单位(IU)。液体发酵好的醪液离心取上清液即为粗酶液。柠檬酸缓冲液为21g无水柠檬酸、7. 8g氢氧化钠加蒸馏水定容至2L，pH为4. 8。还原糖测定方法采用DNS法，以木糖为标准。固体培养基水分测定水分测定仪测定。纤维二糖酶的测定方法是在小试管中加入Iml酶液，再加入Iml 二糖底物，用橡皮塞封口。试管放入50°C水浴中，预热5min，保温30min后终止反应。一个纤维二糖酶活力国际单位定义为标准反应条件下，每分钟生成2 μ mol葡萄糖的酶量。液体发酵好的醪液离心取上清液即为粗酶液。柠檬酸缓冲液为21g无水柠檬酸、7. Sg氢氧化钠加蒸馏水定容至 2L, pH 为 4. 8。
本发明中，黑曲霉能高产木聚糖酶和纤维二糖酶，而绿色木霉生产木聚糖酶和纤维二糖酶的能力较弱，生产纤维素酶的能力较强。而纤维素的水解需要多种酶的协同作用， 故在发酵过程中，通过木聚糖酶对木聚糖的水解可以降低其和纤维素的连接，从而增加了纤维素酶对纤维素吸附，从而提高了纤维素的利用率，使发酵液中的糖含量有所增加。而纤维二糖酶则水解产生纤维二糖，会使纤维二糖的含量在发酵过程中处于低浓度水平，从而诱导纤维素酶降解纤维素。最终使发酵液中的纤维素酶酶活增加，同时联产木聚糖酶和纤维二糖酶。在发酵罐中进行培养，生产出同时含有纤维素酶、木聚糖酶、纤维二糖酶的液体复合酶。该方法生产的液体、生产周期短、成本低、质量稳定。本发明提供的纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的复合酶在造纸、纺织等各种需要纤维素预处理的环节中均可以应用。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1以绿色木霉(CGMCC 3. 3744，购自中科院微生物所)为单一菌种的发酵培养基含有微晶纤维素20wt%、玉米浆5wt%、尿素10wt%、硫酸铵5wt%、磷酸氢二钾5wt%、其余为水。选择长势良好的绿色木霉菌种斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含有121°C 30min灭菌的绿色木霉液体种子培养基的种子瓶中，扎好8层纱布，30°C下190转经4 摇床培养。 其中，所述的种子培养基含葡萄糖日衬^^玉米浆-丨^^尿素3wt%、硫酸铵2wt%、磷酸氢二钾2wt%，硫酸镁lwt%，其余组分为水。培养结束后接入70%装液量的30L发酵罐中按 5%接种量进行发酵，控制pH 6、温度30°C、转速200转/min、罐压0. 05Mpa、通风1 1.4。 维持条件不变发酵培养7天，得到纤维素酶活为20IU/ml。实施例2以黑曲霉(CGMCC 3. 3150，购自中科院微生物所)为单一菌种的发酵培养基含有 玉米浆5wt %、尿素IOwt %、磷酸氢二钾5wt %、硫酸镁5wt %和Tween801.0wt%,其余为水。选择长势良好的黑曲霉菌种斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含121°C 30min灭菌的黑曲霉液体种子培养基的种子瓶中，扎好8层纱布，30°C下210转经4 摇床培养。其中， 黑曲霉液体种子培养基含麸皮5wt%、尿素^^^、硝酸铵；？衬^^磷酸二氢钾Iwt %、碳酸钙 3wt%，其余组分为水。培养结束后按3%接种量接入70%装液量的30L发酵罐中进行发酵，控制PH 5、温度30°C、转速300转/min、罐压0.05Mpa、通风1 1。维持条件不变发酵培养5天，得到木聚糖酶酶活为1000IU/ml，纤维二糖酶酶活为50IU/ml。实施例3制备发酵培养基微晶纤维素30wt%、玉米浆5wt%、尿素IOwt %、硫酸铵5wt%、 磷酸氢二钾10wt%、硫酸镁5 丨％和Tween801. 0wt%，其余为水。选择长势良好的绿色木霉(CGMCC 3.3744)菌种斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含有121°C 30min灭菌的绿色木霉液体种子培养基的种子瓶中，扎好8层纱布，30°C下190转经4 摇床培养。其中，所述的种子培养基含葡萄糖5wt %、玉米浆%、尿素3wt %、硫酸铵2wt%、磷酸氢二钾2wt%，硫酸镁lwt%，其余组分为水。培养结束后按3%接种量接入 70%装液量的30L发酵罐中进行发酵，控制pH5、温度30°C、转速200转/min、罐压0. 05Mpa、通风1 1.4。选择长势良好的黑曲霉菌种斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含12rC30min灭菌的黑曲霉液体种子培养基的种子瓶中，扎好8层纱布，30°C下210转经4 摇床培养。其中，黑曲霉液体种子培养基含麸皮5wt%、尿素^^^、硝酸铵；？衬^^磷酸二氢钾lwt%、碳酸钙3wt%，其余组分为水。待绿色木霉发酵3天后按3%接种量接入黑曲霉(CGMCC3. 3150) 液体种子，维持原条件不变继续发酵培养5天。得到纤维素酶活为50IU/ml，木聚糖酶酶活为3000IU/ml，纤维二糖酶酶活为300IU/ml。实施例4制备发酵培养基微晶纤维素20wt%、玉米浆8wt%、尿素5wt%、硫酸铵7wt%、磷酸氢二钾5wt%、硫酸镁Tween800. 6wt%，其余为水。选择长势良好的绿色木霉(CGMCC 3.3744)菌种斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含有121°C 30min灭菌的绿色木霉液体种子培养基的种子瓶中，扎好8层纱布，30°C下190转经4 摇床培养。其中，所述的绿色木霉种子培养基含葡萄糖3wt%、玉米浆2wt%、尿素 Iwt %、硫酸铵%、磷酸氢二钾%，硫酸镁0. 5wt %，其余组分为水。培养结束后按5 % 接种量接入70%装液量的30L发酵罐中进行发酵，控制pH 6、温度^TC、转速300转/min、 罐压0.07Mpa、通风比1 1.2。选择长势良好的黑曲霉菌种斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含121°C 30min灭菌的黑曲霉液体种子培养基的种子瓶中，扎好8层纱布，30°C下210转经 4 摇床培养。其中，黑曲霉液体种子培养基含麸皮3wt%、尿素3wt%、硝酸铵lwt%、磷酸二氢钾3wt %、碳酸钙Iwt %，其余组分为水。待绿色木霉发酵3天后按1 %接种量接入黑曲霉(CGMCC 3.3150)(购自中科院微生物所)液体种子，维持原条件不变继续发酵培养4天。 得到纤维素酶活为50IU/ml，木聚糖酶酶活为4000IU/ml，纤维二糖酶酶活为400IU/ml。实施例5制备发酵培养基微晶纤维素25wt%、玉米浆10wt%、尿素6wt%、硫酸铵10wt%、 磷酸氢二钾7wt%、硫酸镁10 丨％和Tween800. lwt%，其余为水。选择长势良好的绿色木霉(CGMCC 3.3744)菌种斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含有121°C 30min灭菌的绿色木霉液体种子培养基的种子瓶中，扎好8层纱布，30°C下190转经4 摇床培养。其中，所述的绿色木霉种子培养基含葡萄糖#丨％、玉米浆3wt%、尿素 2wt %、硫酸铵3wt %、磷酸氢二钾3wt %，硫酸镁0. 8wt %，其余组分为水。培养结束后按5 % 接种量接入70%装液量的30L发酵罐中进行发酵，控制pH 7、温度、转速400转/min、 罐压0.09Mpa、通风1 1.3。选择长势良好的黑曲霉菌种斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含 121°C 30min灭菌的黑曲霉液体种子培养基的种子瓶中，扎好8层纱布，30°C下210转经4 摇床培养。其中，黑曲霉液体种子培养基含麸皮^t %、尿素2wt %、硝酸铵2wt %、磷酸二氢钾2wt %、碳酸钙2wt %，其余组分为水。待绿色木霉发酵3天后按3 %接种量接入黑曲霉 (CGMCC 3.3150)液体种子，维持原条件不变继续发酵培养4天。得到纤维素酶活为40IU/ ml，木聚糖酶酶活为4500IU/ml，纤维二糖酶酶活为400IU/ml。实施例6制备发酵培养基微晶纤维素30wt%、玉米浆5wt%、尿素IOwt %、硫酸铵6wt%、 磷酸氢二钾9 丨％、硫酸镁6 丨％和Tween800. ，其余为水。选择长势良好的绿色木霉(CGMCC 3.3744)菌种斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含有121°C 30min灭菌的绿色木霉液体种子培养基的种子瓶中，扎好8层纱布，30°C下190转经4 摇床培养。其中，所述的绿色木霉种子培养基含葡萄糖3wt%、玉米浆3wt%、尿素 2wt%、硫酸铵2wt%、磷酸氢二钾#t%，硫酸镁lwt%，其余组分为水。培养结束后按5% 接种量接入70%装液量的30L发酵罐中进行发酵，控制pH 7、温度、转速400转/min、 罐压0. 13Mpa、通风1 1.5。选择长势良好的黑曲霉菌种斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含 121°C 30min灭菌的黑曲霉液体种子培养基的种子瓶中，扎好8层纱布，30°C下210转经4 摇床培养。其中，黑曲霉液体种子培养基含麸皮5wt %、尿素2wt %、硝酸铵3wt %、磷酸二氢钾lwt%、碳酸钙3wt%，其余组分为水。待绿色木霉发酵3天后按5%接种量接入黑曲霉 (CGMCC 3.3150)液体种子，维持原条件不变继续发酵培养4天。得到纤维素酶活为40IU/ ml，木聚糖酶酶活为4000IU/ml，纤维二糖酶酶活为400IU/ml。 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的复合酶的制备方法，其特征在于，将制备的绿色木霉液体种子和黑曲霉液体种子先后接入发酵培养基中发酵生产纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的复合酶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，先将绿色木霉液体种子以体积比1 5%的接种量接种后发酵3 8天后，以体积比为1 5%的接种量接入黑曲霉液体种子，再共同发酵3 8天。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，先将绿色木霉液体种子以体积比5% 的接种量接种后发酵3 8天后，以体积比为3%的接种量接入黑曲霉液体种子，再共同发酵3 8天。
4.根据权利要求1 3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基含有微晶纤维素20-30wt%、玉米浆5-10wt%、尿素5-10wt%、硫酸铵5_10wt %、磷酸氢二钾 5-10wt%、硫酸镁 5-10wt%iP Tween800. l_lwt%，其余为水。
5.根据权利要求1 3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵条件为pH 维持在5 7，温度25 30°C，转速200 400转/min，罐压0. 05 0. 15Mpa，通风比 1 0. 5 1 1. 5。
6.根据权利要求1 3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述绿色木霉液体种子的种子培养基含有葡萄糖3_5wt %、玉米浆%、尿素l-3wt %、硫酸铵%、磷酸氢二钾2-#t%，硫酸镁0. 5-lwt%，其余组分为水。
7.根据权利要求1 3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的黑曲霉液体种子的种子培养基含有麸皮3-5wt%、尿素l-3wt%、硝酸铵l-3wt%、磷酸二氢钾l-3wt%、碳酸钙 l-3wt%，其余组分为水。
8.根据权利要求1 3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的绿色木霉为绿色木霉CGMCC 3. 3744，所述的黑曲霉为黑曲霉CGMCC 3.3150。
9.权利要求1 8任一项所述的制备方法制备的纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的复合酶。
10.权利要求9所述的纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的复合酶在纤维素类原料预处理中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶复合酶及其制备方法。本发明提供的纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的复合酶的制备方法，其为将制备的绿色木霉液体种子和黑曲霉液体种子先后接入发酵培养基中发酵生产纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的复合酶。该方法生产的液体复合酶活力高、组分配比合理、生产周期短、成本低、质量稳定。
文档编号C12R1/885GK102392004SQ201110332000
公开日2012年3月28日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者戴嘉, 李荣杰 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司