一种中性纤维素酶突变体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一种中性纤维素酶突变体及其应 用。
【背景技术】
[0002] 纤维素酶，是一种复合酶，是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，习惯上将纤维素 酶分成三类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶。纤维素酶是在工业中应用最 广泛的酶之一，一般应用于纺织工业、去污剂工业、纸浆和造纸工业、饲料和食品工业（包 括烘焙），以及用于木质纤维素材料水解，用于例如生物乙醇生产等。
[0003] 纤维素酶可以按照其一级序列分类成各种糖基水解酶家族，这得到了家族一些成 员的三维结构分析的支持（Henrissat 1991，Henrissat和Bairoch 1993，1996)。例如，糖 基水解酶家族5、7、12和45含有内切葡聚糖酶。大多数纺织用酸性纤维素酶属于家族5,而 大多数纺织用中性纤维素酶为家族12或45。
[0004] 中性纤维素酶可广泛应用在纺织领域，特别在棉织物整理上，经过纤维素酶整理 后，织物表面的绒毛被除去，处理后织物更光洁，颜色更鲜艳，棉织物的手感和外观获得很 大的改善。用于牛仔水洗整理，可解决传统石洗的断砂磨损和酸洗时的日久发黄等许多问 题，水洗的牛仔花点大小均勾，蓝白对比鲜明，质地柔软、舒适、美观大方。
[0005] 但目前市售的中性纤维素酶种类较少，且普遍存在催化效率不高、产品储存期较 短、酶活损失快等缺点，因此现在急需开发一款稳定性高，单位蛋白催化效率高且对织物强 力损失小的中性纤维素酶，以满足工业生产的需求。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种中性纤维素酶突变体，其热稳定性得到显著提高，且在 纺织除毛和水洗的应用中具有更显著的效果，可广泛应用于纺织工业领域。
[0007] 本发明一方面提供了一种纤维素酶突变体，是氨基酸序列为SEQIDN0 :1的纤维 素酶第23位氨基酸由Pro变为Ser，第38位氨基酸由Leu变为lie，第213-284位氨基酸 序列替换成里氏木霉（Trichoderma reesei)来源的纤维素酶的第447-514位氨基酸序列。
[0008] 上述里氏木霉（Trichoderma reesei)来源的纤维素酶的氨基酸序列为SEQ ID NO :3,其编码基因的核酸序列为SEQ ID NO :4。
[0009] 上述纤维素酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO :5,其一种编码基因的核酸序列 为 SEQ ID N0 :6。
[0010] 本发明另一方面提供了携带有编码序列为SEQ ID NO :6的纤维素酶突变体基因的 重组质粒。
[0011] 本发明还涉及一种工程菌株，其携带有上述重组质粒。
[0012] 所述工程菌株为里氏木霉（Trichoderma reesei)。
[0013] 本发明还涉及上述纤维素酶突变体在纺织领域中的应用。
[0014] 本发明所述纤维素酶突变体最适作用温度为60°C，最适作用pH为6. 5,且在pH 6. 0-7. 0范围内均能保持80%以上的酶活水平，而野生型纤维素酶的最适作用pH为5. 5,在 pH 5. 0-6.5范围内维持80%以上的酶活。与野生型比较，本发明提供的纤维素酶突变体的 pH适用范围更加偏向于中性条件，具有更大的应用空间。此外，纤维素酶突变体的耐热性和 稳定性得到显著提高，在42°C条件下存放35天后，仍能保持90%以上的残留活性，而野生 型纤维素酶酶活仅残留不足60%。
[0015] 本发明提供的纤维素酶突变体可广泛应用于纺织加工领域，在pH 4. 0-8. 5范围 内应用，效果良好；除毛干净，对织物强力损失小；牛仔水洗，起花小，花点较小，批差稳定； 且相同蛋白含量的纤维素酶突变体的应用效果显著优于野生型，能大大节约生产成本，提 高经济效益。
【附图说明】
[0016] 图1为纤维素酶突变体与野生型相对酶活-pH曲线图；
[0017] 图2为纤维素酶突变体与野生型残留酶活-时间曲线图。
【具体实施方式】
[0018] 本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook,2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献 提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任 何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。
[0019] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细描述。
[0020] 实施例1 :纤维素酶突变体的获得
[0021] 为了提高野生型纤维素酶NCE4(氨基酸序列为SEQ IDN0:1，其编码核苷酸序列为 SEQ IDN0:2)对温度的耐受性和稳定性，申请人对该酶的氨基酸位点进行了大量的点突变 筛选，并对该酶原有的CBD结合域序列进行了大量替换筛选。在筛选过程中，申请人发现： 有些突变对纤维素酶的耐热性没有影响，而有些突变甚至会导致其耐热性更差了，还有些 突变虽然能显著提高纤维素酶的耐热性，但酶活水平很低，不适用于工业生产。最终，申请 人筛选到一种既能使纤维素酶耐热性和热稳定性显著提高、又不影响其酶活水平的突变位 点和CBD结合域序列的组合：野生型纤维素酶NCE4的第23位氨基酸由Pro变为Ser，第38 位氨基酸由Leu变为lie，第213-284位氨基酸序列替换为里氏木霉（Trichoderma reesei) 来源的纤维素酶的第447-514位氨基酸序列。
[0022] 所述里氏木霉（Trichoderma reesei)来源的纤维素酶的氨基酸序列为SEQ ID NO :3,其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO :4。
[0023]申请人将包含上述突变位点的纤维素酶突变体命名为NCE4-D，其氨基酸序列为 SEQ IDN0:5,编码核苷酸序列为SEQ IDN0:6。
[0024] 申请人依照里氏木霉的密码偏爱性对纤维素酶突变体的基因进行优化合成，并且 在合成序列5'和3'两端分别加上Kpnl和Xbal两个酶切位点。上述基因合成工作由上海 生工生物工程股份有限公司完成。
[0025] 同时，采用同样的方法合成得到野生型纤维素酶NCE4的基因片段SEQ ID NO: 2。
[0026] 实施例2纤维素酶突变体的表达
[0027] 2. 1表达载体的构建
[0028] 将合成后的纤维素酶突变体基因序列和pTG载体分别用限制性内切酶Kpnl和 Xbal (Fermentas)进行酶切，使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶 (Fermentas)将上述两个酶切产物连接并转化大肠杆菌Trans5 a (Transgen)，用氨节青霉 素进行选择，并对克隆进行测序（Invitrogen)。测序正确后，即得到含有纤维素酶突变体基 因的重组载体PTG-NCE4-D。
[0029] 采用上述同样方法构建得到含有野生型纤维素酶NCE4基因的重组载体 PTG-NCE4。
[0030] 2. 2重组菌株的构建及筛选
[0031] (1)原生质体制备
[0032] 接种里氏木霉（Trichoderma reesei) SCHD4菌丝于PDA平板上，30°C培养6天； 待其产孢丰富后，切取约lcmXlcm的菌落置于含120mL YEG+U(0. 5%酵母粉、1%葡萄糖、 0. 1%尿苷）的液体培养基中，30°C，220rpm振荡培养14~16h ;
[0033] 多层纱布过滤收集菌丝，并用无菌水清洗一次；将菌丝体置于含有20mL10mg/mL 裂解酶液（SigmaL1412)的三角瓶中，30°C，90rpm作用1-2h;用显微镜观察检测原生质体 转化进展；
[0034] 将预冷的20mL 1. 2M山梨醇（1. 2M山梨醇，50mM Tris-Cl，50mM CaCl2)加入上述 三角瓶中，轻轻摇勾，用无菌Miracloth滤布过滤收集滤液，3000rpm，4°C离心10min ;弃上 清，加入预冷的5mL 1. 2M山梨醇溶液悬浮菌体，3000rpm，4°C离心10min ;弃上清，加入适量 预冷的1. 2M山梨醇悬浮分装（200 y L/管，原生质体浓度为10s个/mL)。
[0035] (2) PEG介导的原生质体转化与菌株验证
[0036] 以下操作均在冰上进行，将10 y g重组质粒加入到200 y L上述原生质体溶液中， 接着加入50 y L25% PEG轻轻混匀，温和混匀后在冰上放置20min，然后加入lmL25% PEG， 轻轻混匀，室温静置5min，然后加入2mL25 % PEG溶液和4mLl. 2M山梨醇溶液，温和混匀 各管，把混合物轻轻加到50mL左右且熔化后冷却至45-55°C的转化上层培养基中（0. 1% MgS04,1 % KH2P04,0? 6 % (NH4) 2S04,1 % 葡萄糖，18. 3 % 山梨醇，0? 35 % 琼脂糖，0? 1 %微量元 素（微量元素：在 250mL dlH20 中加入 lg FeS04.7H20,8. 8g ZnS04.71120,0. 4g CuS04.5H20， 0? 15g MnS04 ? 4H20,0. lg Na2B407 ? 10H20,50mg(NH4)6Mo70 24 ? 4H20,0. 2mL 浓 HC1，完全 溶解后用dlH20定容至1L))，轻轻混匀后倒入转化下层培养基平板（2%葡萄糖，0.5% (順4) 2504，1.5%腿风0.06%]\%504,0 . 06%〇&(：12，1.5%琼脂，0.1%微量元素），30。(：培 养5~7d至转化子长出。
[0037] 挑取转化子至下层培养基平板，30°C培养2d;取适量菌丝体置于2mL离心管中，加 入 100mg无菌石英砂和 400 yL抽提缓冲液（100mM Tris-HCl, 100mM EDTA，250mM NaCl, 1% SDS);用珠打仪剧烈振荡2min ;65°C水浴20min后，加入200 y L 10M NH4AC，冰浴lOmin ; 13000rpm离心10min ;取上清，加入2倍体积的无水乙醇，_20°C放置30min ;13000rpm离心 10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加水