专利名称：一种纤维素酶产生菌及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种细菌及其制备和应用，具体为涉及一种纤维素酶产 生菌及其筛选及菌种鉴定的方法，所筛选到的细菌其分泌的纤维素酶具有耐高温、耐碱性的 特性。
背景技术：
纤维素是世界上最丰富的可再生资源。利用微生物纤维素酶降解纤维素较传统的理化方 法具有明显经济、有效、节约的特点，在生物燃料、医药、日用化工、食品发酵、废水处理、 工业洗涤、中草药提取等领域都有一定程度的应用。由细菌产生的纤维素酶一般最适pH为 中性至偏碱性。近20年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗 涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的，在于提供一种纤维素酶产生菌，以及简便、可靠的纤维素酶产生菌的筛 选及鉴定方法，以期简化以往在筛选及传统生理生化法菌种鉴定上的繁琐步骤，所筛选到的 纤维素酶产生菌能够产生耐高温、耐碱性的纤维素酶，能被广泛应用于生物燃料、医药、日 用化工、食品发酵等多个行业。
本发明的一种纤维素酶产生菌，所述菌株在地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生 物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC N0 3006; 保藏日期2009年4月9日，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli )，菌株的16S rRNA 基因序列如SEQ ID NOl所述；菌株的ITS基因序列如SEQ ID N02所述。
上述纤维素酶产生菌的制备方法为
(1) 用附着于腐烂树根土壤制成的混浊液,在LB液体培养基中，37°C， 225rpm，振荡 培养过夜；所述LB液体培养基组分为每100 ml蒸馏水中含1 g蛋白胨、0. 5 g酵母粉和 1 g氯化钠；
(2) 取振荡培养后的产物，用平板接种筛选纤维素酶的产生菌，所用的培养基为每 100 ml营养液中含0. 5 1. 0 g羧甲基纤维素钠和1. 5 2. 0 g琼脂；所述营养液的组分按质 量体积比为0. 15 0. 20% (朋4)2S0" 0. 05 0. 10%MgS04， 0.1 0.15% &織和0. 05 0.10% NaCl，余量为水，自然pH;
(3) 从筛选的纤维素酶产生菌中选择能够分泌高活性的耐高温、耐碱性纤维素酶的菌
株；(4)对菌株16S rRNA和ITS基因克隆及序列分析，测序结果进行数据库同源性比较； 用于克隆细菌16S rRNA的通用上游引物序列为AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,通用下游引物序 列为AAGGAGGTGATCCAGCC;用于克隆细菌16S rRNA和23S rRNA之间的ITS基因的上游引 物退火结合于细菌16S rRNA中，序列CTTGACATCCACGGAAGTTT,下游引物退火结合于细菌 23S rRNA中，序列GTTCTTTTTCACTCCCCTCG。
本发明所述的纤维素酶产生菌应用于生产纤维素酶。
本发明利用改良型羧甲基纤维素钠平板与基因工程技术手段，从土壤中筛选并鉴定了一 种纤维素酶产生菌，经菌株特性及其分泌的纤维素酶特性分析之后，结果表明，该菌具有耐 高温的能力，其分泌的纤维素酶具有耐高温、耐碱性的特点，最终命名该菌为大肠杆菌TCP-l， 其16S rRNA和ITS基因序列已登录GenBank数据库，登录号分别为FJ823386和FJ823387。 本发明釆用的筛选及鉴定方法均具有简便、可靠的特点，所筛选到的细菌及其分泌的纤维素 酶有望在生物燃料、医药、日用化工、食品发酵等多个行业中得到广泛应用。
图1.利用改良型羧甲基纤维素钠(CMC-Na，购自Sigma公司)平板和刚果红染色法筛 选纤维素酶产生菌。菌株经划线、挑单克隆菌落继代纯化培养3次后，在CMC-Na平板上接 种培养3天，菌落周围出现明显的透明圈。
图2.利用邻位相连法，绘制出基于几乎完整的细菌16SrRNA基因序列的系统进化树， 显示出所筛选菌株TCP-1与数据库中fsc力eric力ia coW和幼J'《eWa代表菌种的亲缘关系。 序列由ClustalX程序进行比对，系统进化树由Phylip软件包(版本号3. 68)经1000次重 复运算后生成。被比对分析序列的右侧为其碱基对数及其对应的GenBank序列号。
图3.经含1% CMC-Na的LB发酵培养基培养的大肠杆菌TCP-1分泌的纤维素酶的特性。 (A)大肠杆菌TCP-1的CMCase， FPase和p-glucosidase活性的最佳培养时间。分别以羧 甲基纤维素钠、滤纸和水杨苷为底物，在50'C和0.1 M柠檬酸盐缓冲液(PH5.0)条件下孵 育酶液30 min后，测定不同培养时间(24-168 h)条件下，细菌CMCase，FPase和p-glucosidase 的活性变化。(B)大肠杆菌TCP-1的CMCase活性的最佳反应pH。将最佳培养时间的酶液于 不同反应pH (pH 3.0-10.0)条件下，用同(A)的方法测定50'C和不同反应pH条件下，细 菌CMCase的活性变化。(C)大肠杆菌TCP-1的CMCase活性的最佳反应温度。将最佳培养时 间的酶液，于最佳反应pH和不同反应温度《(40-90°C)条件下，用同(A)的方法测定不同 反应温度条件下细菌CMCase的活性变化。(D)大肠杆菌TCP-1的CMCase的耐热性。将最佳 培养时间的酶液于不同的温度条件下分别预处理10-60 min后(如图所示)，在最佳反应pH和最佳反应温度条件下，用同(A)的方法测定经不同热处理后细菌CMCase的活性变化。
具体实施例方式
本发明的具体实施步骤如下
1.实验主要材料
改良型羧甲基纤维素钠平板0.5 1.0g羧甲基纤维素钠(CMC-Na，购自Sigma公司)，
1. 5 2 g琼脂，100 ml营养液中组分为(NH》风0. 15~0. 20% (m/v) ; MgSOt 0. 05 0. 10% (m/v); K2HP0<， 0. 10 0. 15%(m/v) : NaCl， 0. 05 0. 10% (m/v)，余量为水，自然pH。
LB液体培养基1 g蛋白胨，0.5 g酵母粉，1 g氯化钠，100 ml蒸馏水。 刚果红染液0.1 g刚果红，100ml蒸馏水，溶解后过滤，用蒸馏水定容至100 ml。 氯化钠脱色液58.44 g氯化钠，1000 ml蒸馏水。 发酵培养基100 ml LB液体培养基，1 g羧甲基纤维素钠。 所有培养基均经12rC高温灭菌处理。
2. 菌种筛选
(1) 取IO g左右附着于腐烂树根的土壤，置于250 ml锥形瓶中，加入IOO ml蒸馏水，37 。C， 160rpm，振荡l h后，取l ml混浊液,加到5 ml LB液体培养基中，37'C， 225rpm，振 荡培养过夜。
(2) 将过夜培养的菌液划线培养于改良型羧甲基纤维素钠平板上，37'C倒置培养约36 h， 直至有菌落出现。这些菌落便是纤维素酶的产生菌。
(3) 挑取直径较大的单菌落，于LB液体培养基中，37°C， 225rpm，振荡培养过夜。
(4) 在平板上划线、挑单克隆菌落于LB液体培养基中继代纯化培养3次后，在平板中间垫 上直径约0. 5厘米的圆形滤纸，取10 ul经LB过夜培养的单菌落菌液，接种到滤纸上，37 'C，倒置培养3天后，经刚果红染色和氯化钠脱色液脱色，观察菌落周围透明圈的大小，定 性鉴定该菌具有分泌高活性纤维素酶的能力。
3. 菌种鉴定
(1) 将该菌株划线、挑单克隆菌落继代纯化培养3次后，挑取单菌落，于LB液体培养基中， 37'C， 225rpm，振荡培养过夜。
(2) 取少许菌液用于革兰氏染色鉴定。
(3) 剩余菌液经4000 rpm离心收集菌体，.弃上清，提取细菌的基因组。
(4) 利用细菌16S rRNA的通用引物，以细菌基因组为模板，通过PCR扩增反应，扩增细菌 的16S rRNA基因，并对PCR产物进行纯化，连接T载体及测序，对该菌16S rRNA的测序结 果进行数据库同源性比较。其中，细菌16S rRNA的通用上游引物序列为AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，通用下游引物序列为AAGGAGGTGATCCAGCC。
(5)根据16SrRNA同源性比较结果，设计引物，以细菌基因组为模板，通过PCR扩增反应， 扩增细菌的16S rRNA部分基因、23S rRNA部分基因及其两者之间的ITS基因，并对PCR产 物进行纯化，连接T载体及测序，最后进行数据库同源性比较。其中，上游引物退火结合于 细菌16SrRNA中，序列为CTTGACATCCACGGMGTTT,下游引物退火结合于细菌23S rRNA中， 序列为GTTCTTTTTCACTCCCCTCG。 4.细菌纤维素酶活性测定
将1 ml经LB过夜培养的细菌接种到100 ml发酵培养基中，37°C, 225rpm进行发酵实 验。发酵结束后，4'C， 4000 rpm离心收集上清，作为粗酶液，用于测定酶活性和蛋白质浓 度。
(1) 葡萄糖标准曲线的绘制分别吸取O. 1%标准葡萄糖溶液0、 2.0、 4.0、 6.0、 8.0、 10.0 ml，分别加双蒸水定容至50 ml。再分别吸取上述溶液各2. 5 ml于试管中，各加2. 5 ml 3, 5-二硝基水杨酸(DNS)，煮沸5rain。冷却后，以不含葡萄糖的试管为对照，在530 nm波长 下进行比色，记录各管的光密度值，以光密度作纵坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数 为横坐标，绘制标准曲线。其中，0.1%标准葡萄糖溶液的配制为准确称取经105"C烘至恒 重的无水葡萄糖250. 000 mg，溶于双蒸水中，定容至250 ml。
(2) BSA蛋白质标准曲线的绘制采用改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒(上海生工) 制作BSA蛋白质标准曲线，即分别吸取lmg/ml的BSA蛋白质标准液0、 100、 150、 200、 250、 300 ul,分别加水定容至1 ml。在一酶标板上取若干孔，分别加入上述各浓度的BSA 蛋白质溶液20 ul，再在各孔中加入200 ul Bradford试剂，迅速振荡混匀后，室温静置10 min, 期间振荡混匀l-2次。10min后，以不含蛋白质的孔为空白对照，在酶标仪上测各孔的A59S 值。重复三次，并分别计算出相同蛋白质浓度的三个孔中A^的平均值。以这些A亂;平均值为 纵坐标，对应的蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
(3) CMCase活性测定
以葡萄糖为标准，用DNS法测定经酶处理后CMC-Na释放的葡萄糖的含量，从而测定 CMCase的活性。对照酶液预先经10 min沸水浴灭活处理。反应混合物包括2 ml用0. 1 M柠 檬酸盐缓冲液(pH 5. 0)配制的10 g/1的CMC-Na和0. 5ml经0. 1 M柠檬酸盐缓冲液(pH 5. 0) 适当稀释的酶液，两者充分混合。对照和测'试样品经5(TC水浴30 min后取出。在对照液中 加入2.5ml DNS终止酶和底物的反应。测试液先迅速放入沸水浴中煮沸10 min后取出，冷 却至室温后，加入2.5mlDNS。充分混匀后，对照液和测试液一起放入沸水浴中煮5 min后取出，冷却至室温后在530 nrn波长下测试吸光度。酶活性按照国际单位的定义，即在标准 测试下，1 min释放l umol葡萄糖所需的酶量。
(4) FPase活性测定
以葡萄糖为标准，用DNS法测定经酶处理后滤纸释放的葡萄糖的含量，从而测定FPase 的活性。测定步骤为对照酶液预先经10 min沸水浴灭活处理。准确吸取经适当稀释的对 照和测试酶液4 ml，分别放入试管中，各加1 ml缓冲液(pH 4. 8)，再各加入新华5号滤纸 条一条(剪成l cmX6 cm纸条，50 mg)， 5(TC反应30 min后取出。吸取对照酶液的滤纸酶 解液lml于新试管中，加入1.5 ml双蒸水和2.5 ml DNS。测试液先迅速放入沸水浴中煮10 分钟后取出，冷却后吸取测试酶液的滤纸酶解液lmL于新试管中，加入1.5ml双蒸水和2.5 ml DNS。充分混匀后，对照和测试样品一起放入沸水浴中煮沸5 min后取出，冷却至室温后 在530 nm处测定光密度值。酶活性按照国际单位的定义，即在标准测试下，1 min释放1 umol 葡萄糖所需的酶量。
(5) 卩-glucosidase活性测定
以葡萄糖为标准，用DNS法测定经酶处理后水杨苷释放的葡萄糖的含量，从而测定 (J-glucosidase的活性。对照酶液预先经10 min沸水浴灭活处理。取2. 00 ml 1%水杨苷(用 pH 4.8的缓冲液配制)于试管中，各加入0.5 ml经适当稀释的对照酶液和测试酶液，50'C 反应30min后取出。在对照液中加入2.5 ml DNS终止酶和底物的反应。测试液先迅速放入 沸水浴中煮沸10 min后取出，冷却至室温后，加入2皿5 ml DNS。充分混匀后，对照液和测 试液一起放入沸水浴中煮5 min后取出，冷却至室温后在530 nm波长下测试吸光度。酶活 性按照国际单位的定义，即在标准测试下，1 min释放l umol葡萄糖所需的酶量。
(6) 蛋白质浓度测定
采用改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒(上海生工)测定蛋白质浓度，即将样品 作适当倍数的稀释，在一酶标板上取若干孔，分别加入水和样品稀释液各20 ul，再在各孔 中加入200 ul Bradford试剂，迅速振荡混匀后，室温静置10 min，期间振荡混匀1-2次。 10 min后，在酶标仪上测各孔的^5值。重复三次，并以加水的孔为空白对照，分别计算出 同一样品的三个孔中A^的平均值。根据标准曲线和稀释倍数计算出该样品的蛋白质浓度。 5.细菌纤维素酶特性分析 (1)最佳培养时间 ,
设置梯度培养时间，24-168 h，间隔为24h。分别以羧甲基纤维素钠、滤纸和水杨苷为 底物，在5(TC和0. 1 M柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0)条件下孵育酶液30 min后，测定不同培养时间条件下，细菌CMCase， FPase和p-glucosidase的活性变化。
(2) 最佳反应pH
设置梯度反应pH，即配制梯度pH值缓冲液，pH 3. 0-10. 0,间隔为1. 0，用于酶反应底 物的配制及酶液的稀释。将最佳培养时间的酶液于5(TC和不同反应pH条件下，测定细菌 CMCase的活性变化。
(3) 最佳反应温度
设置梯度反应温度，40'C-90'C，间隔为1(TC。将最佳培养时间的酶液，于最佳反应pH 和不同反应温度条件下，测定细菌CMCase的活性变化。
(4) 耐热性
设置梯度预处理温度，50°C-90'C,间隔为l(TC。预先将最佳培养时间的酶液于各温度
条件下处理10-60 min，间隔为10 min,然后于最佳反应pH和最佳反应温度条件下，测定
经不同热处理后细菌CMCase的活性变化。
以上试验结果表明，本发明的纤维素酶产生菌具有耐高温的能力，其分泌的纤维素酶具 有耐高温、耐碱性的特点。序列表 〈110〉浙江大学
<120>—种纤维素酶产生菌及其制备和应用
<160>6 〈210〉1 <211>1534 <212>腿
<213>中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC NO 3006的菌株 〈220〉
〈223〉 SEQ ID N01: 16S rRNA基因序列 <400〉1
agagtttgat cctggctcag attg朋cgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgaac 60 ggtaacagga aacagcttgc tgtttcgctg acgagtggcg gacgggtgag taatgtctgg 120 gaaactgcct gatggagggg gataactact ggaaacggta gctaeitaccg cataacgtcg 180 caagaccaaa gagggggacc ttcgggcctc ttgccatcag eitgtgcccag atgggattag 240 ctagtaggtg gggtaacggc tcacctaggc gacgeitccct agctggtctg agaggatgac 300 cagccacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat 360 tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt 420 gtaaagtact ttcagcgggg aggaagggag taaagttaeit acctttgctc attgacgtta 480 cccgcagaag aagcaxxggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcaa 540 gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg cacgcaggcg gtttgttaag tcagatgtga 600 aatccccggg ctcaacctgg gaactgcatc tgatactggc aagcttgagt ctcgtagagg 660 ggggtagaat tccaggtgta gcggtgaaat gcgtagagat ctggaggaat accggtggcg 720犯ggcggccc cctggacgaa gactgacgct caggtgcgaa agcgtgggga gcaaeicagga 780 ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcgact tggaggttgt gcccttgagg 840 cgtggcttcc ggagctaacg cgttaagtcg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa 900 aactcaaatg犯ttgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc 960 aacgcgaaga accttacctg gtcttgacat ccacggaagt tttcagagat gagaatgtgc 1020 cttcgggaac cgtgagacag gtgctgcatg gctgtcgtca^ gctcgtgttg tgaaatgttg 1080 ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tcctttgttg ccagcggtcc ggccgggaac 1140 tcaaaggaga ctgccagtga taaactggag gaaggtgggg atgacgtc犯gtca/tcatgg 1200 cccttacgac cagggctaca cacgtgctac aatggcgcat acaaagagaa gcgacctcgc 1260 gagagcaagc ggacctcata aagcgcgtcg tagtccggat tggagtctgc aactcgactc 1320 catgaagtcg gaatcgctag taatcgtgga tcagaatgcc acggtgaata cgttcccggg 1380 ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta ggtagcttaa 1440 ccttcgggag ggcgcttacc actttgtgat tcatgactgg ggtgaagtcg taacaaggta 1500 accgtagggg aacctgcggc tggatcacct cctt 1534
<210〉2
〈211〉1416
〈212〉DNA
<213>中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC NO 3006的菌株 〈220>
<223> SEQ ID N02: ITS基因序列
<400>2 ,
cttgacatcc acggaagttt tcagagatga gaatgtgcct tcgggaaccg tgagacaggt 60 gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgttgtg a犯tgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 120aacccttatc ctttgttgcc agcggtccgg ccgggaactc a犯ggagact gccagtgata 180 aactggagga aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc cttacgacca gggctacac3 240 cgtgctacaa tggcgcatac aaagagaagc gacctcgcga gagcaagcgg acctcataaa 300 gtgcgtcgta gtccggattg gagtctgcaa ctcgactcca tgaagtcgga atcgctagta 360 atcgtggatc agaatgccac ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 420 accatgggag tgggttgcaa aagaagtagg tagcttaacc ttcgggaggg cgcttaccac 480 tttgtgattc fttg3ccgggg tgaagtcgta eic犯ggtaac cgtsgggg犯cctgcggttg 540 gatcacctcc ttaccttaaa gaagcgttct ttgcagtgct cacacagatt gtctgataga 600 aagtgaaaag caaggcgtct tgcgaagcag actgatacgt ccccttcgtc tagaggccca 660 ggacaccgcc ctttcacggc ggtaacaggg gttcgaatcc cctaggggac gccacttgct 720 gg"tttgtgag tgaaagtcac ctgccttaat atctcaaaac tcatcttcgg gtgatgtttg 780 agatatttgc tctttaaaaa tctggatcaa gctga^aaatt gaaacactga acaacgaaag 840 ttgttcgtga gtctctcaaa ttttcgcaac acgatgatga atcgtaagaa acatcttcgg 900 gttgtgaggt taagcgacta agcgtacacg gtggatgccc tggcagtcag aggcgatgaa %0 ggacgtgcta atctgcgata agcgtcggta aggtgatatg aaccgttata accggcgatt 1020 tccgaatggg gaaacccagt gtgtttcgac acactatcat taactgaatc cataggttaa 1080 tg6iggcgaac cggggg犯ct gasLacatctei agtaccccga ggaaaag肪a tc33ccg3ga 1140 ttcccccagt agcggcgagc gaacggggag cagcccagag cctgaatcag tgtgtgtgtt 1200 agtggaagcg tctggaaagg cgcgcgatac agggtgacag ccccgtacac aaa^atgcac 1260 atgctgtgag ctcgatgagt agggcgggac acgtggtatc ctgtctg城atggggggac 1320 catcctccaa ggctaaatac tcctgactga ccgatagtga accagtaccg tgagggaaag 1380 gcgaaaagaa ccccggcgag gggagtgaaa aagaac 1416 〈210〉3〈211>20 〈212>DNA
〈213〉中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC NO 3006的菌株 〈220〉
<223〉16S rRNA的通用上游引物序列 〈400>3
AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG 20
〈210〉4
<211>
<212>DNA
〈213〉中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC NO 3006的菌株 〈220〉
〈223>16S rRNA的通用下游引物序列 <400>4
MGGAGGTGA TCCAGCC 17
〈210〉5
〈211>20
〈212>DNA
〈213〉中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC NO 3006的菌株 <220>
<223〉ITS基因的上游引物序列 <400>5
CTTGACATCC ACGGAAGTTT 20<210>6
<211>20
〈212>腿
<213>中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC N0 3006的菌株 <220>
〈223>ITS基因的下游引物序列 〈400>6
GTTCTTTTTC ACTCCCCTCG 20
权利要求
1、一种纤维素酶产生菌，其特征在于所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC NO 3006；菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO1所述；菌株的ITS基因序列如SEQ ID NO2所述。
2、 如权利要求1所述纤维素酶产生菌的制备方法，其特征在于(1) 用附着于腐烂树根土壤制成的混浊液，在LB液体培养基中，37°C， 225rpm,振荡 培养过夜；所述LB液体培养基组分为每100 ml蒸馏水中含1 g蛋白胨、0. 5 g酵母粉和 1 g氯化钠；(2) 取振荡培养后的产物，用平板接种筛选纤维素酶的产生菌，所用的培养基为每 100 ml营养液中含0. 5 1. 0 g羧甲基纤维素钠和1. 5 2. 0 g琼脂；所述营养液的组分按质 量体积比为0.15 0. 20% (肌)孤，0. 05 0.腦MgSO" 0. 1 0. 15% IL线和0. 05 0. 10% NaCl,余量为水，自然pH;(3) 从筛选的纤维素酶产生菌中选择能够分泌高活性的耐高温、耐碱性纤维素酶的菌株；(4) 对菌株16S rRNA和ITS基因克隆及序列分析，测序结果进行数据库同源性比较； 用于克隆细菌16S rRNA的通用上游引物序列为AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，通用下游引物序 列为AAGGAGGTGATCCAGCC;用于克隆细菌16S rRNA和23S rRNA之间的ITS基因的上游引 物退火结合于细菌16S rRNA中，序列为CTTGACATCCACGGMGTTT，下游引物退火结合于细 菌23S rRNA中，序列为GTTCTTTTTCACTCCCCTCG。
3、 如权利要求1所述纤维素酶产生菌的应用，其特征在于所述纤维素酶产生菌应用于生 产纤维素酶。
全文摘要
一种纤维素酶产生菌，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC NO 3006；菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO1所述；菌株的ITS基因序列如SEQ ID NO2所述。用改良型羧甲基纤维素钠平板与基因工程技术手段，从土壤中筛选并鉴定本发明的纤维素酶产生菌，经菌株特性及其分泌的纤维素酶特性分析表明，该菌具有耐高温的能力，其分泌的纤维素酶具有耐高温、耐碱性的特点，该菌及其分泌的纤维素酶将在生物燃料、医药、日用化工、食品发酵等多个行业中具有应用潜力。
文档编号C12N1/20GK101613668SQ20091009887
公开日2009年12月30日 申请日期2009年5月21日 优先权日2009年5月21日
发明者李兴华, 缪云根 申请人:浙江大学