新颖的杆菌BagCel纤维素酶的制作方法

专利名称：新颖的杆菌BagCel纤维素酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新颖的纤维素酶，在此被称作BagCel。本发 明也描述了编码该纤维素酶的核酸，包括所述纤维素酶的组合物，鉴 定新的纤维素酶的方法，和应用所述组合物的方法。优选地，纤维素 酶是从杆菌属种类，优选地是及agara^were"s中被分离出来的。本发 明进一步涉及新的纤维素酶在组合物中的应用，在本领域中，认为所 述组合物中被添加了纤维素酶，而具有优势，所述应用包括，作为去 污剂组合物中的添加剂，用在含纤维素织物的处理中，用在纸浆和纸 的处理中，以及用在淀粉的处理中，用于生产高果糖玉米浆或者乙醇。
背景技术：
纤维素(Cellulose)和半纤维素(hemicelMose)是由光合作 用生成的最丰富的植物材料。它们可以被许多微生物降解并用作能量 来源，这包括细菌、酵母和真菌，它们产生能够将多聚物底物水解为 单体糖的胞外酶(Aro"a/.,2001)。由于不可再生资源途径的限制， 纤维素成为主要的可再生能源的潜力是巨大的(Krishna^fl/.,2001)。 通过生物学方法有效利用纤维素，是解决食品、词料和燃料短缺的一 个途径(Ohmiya fl/., 1997 )。
纤维素酶(Cdlulases)是水解纤维素(/3-1，4葡聚糖或者 糖苷键)导致形成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖(cellooligosaccharides) 和类似物质的酶。纤维素酶在传统上被分为三个主要类型内切葡聚 糖酶(endoglucanases ) (EC 3.2丄4) ( "EG")， 外切葡聚糖酶
(exogluc画es)或者纤维二糖水解酶(EC3.2丄91) ("CBH")和/3-葡萄糖苷酶([/5]-D-glucosideglucohydrolase; EC 3.2.1.21) ("BG")。
(Knowles e/a/., 1987; Shulein， 1988)。内切葡聚糖酶主要作用于纤维 素纤维的非晶体部分，而纤维二糖水解酶也可以降解晶体纤维素
(Nevalainen and Penttila， 1995)。因此，纤维二糖水解酶在纤维素酶 系统中的存在对于晶体纤维素的有效溶解是必需的(Suumakki， et al. 2000)。 /5-葡萄糖苷酶的作用是从纤维二糖、纤维寡糖和其它糖苷释放 出D-葡萄糖单位(Freer, 1993)。
为了有效地将晶体纤维素转变为葡萄糖，完整的纤维素酶系 统是必需的，其包括来自CBH、 EG和BG类别中每一类的成分，而 孤立的成分在水解晶体纤维素方面的有效性较小(Filho et al., 1996)。 己经观察到，在不同类别的纤维素成分之间存在协同关系。特别地， EG-型纤维素酶和CBH-型纤维素酶协同地相互作用，以更加有效地降 解纤维素。参见，例如，Wood, 1985。 尽管纤维素酶组合物在之前已被描述过，但仍存在着对新的 和改进的纤维素酶组合物的需求，它们将用于家用洗涤剂、石磨洗组 合物或者洗衣店洗涤剂，等等。显示出改进的性能的纤维素酶是特别 有价值的。
发明概述 本发明的一个目的是，提供新的纤维素酶，其具有用于洗涤 剂，处理织物，生物量(生物质，生物材料，biomass)转化和制造纸 浆以及纸的有益性质。 本发明的一个目的是，提供有纤维水解活性的多肽和编码该 多肽的多核苷酸。所述多肽可以改进细胞壁物质，例如纤维素和/或半 纤维素的降解。该多肽也可以改进参与植物细胞壁物质例如，生物质 的降解的其它酶的稳定性或者活性。
本发明的一个目的是，提供新的纤维素酶及其衍生物，生产
这样的纤维素酶的方法，和含有这种新的纤维素酶的组合物。本发明 进一步涉及在组合物中应用新的纤维素酶及其衍生物，在本领域中， 认为所述组合物中被添加了纤维素酶，而具有优势，所述应用包括， 作为去污剂组合物中的添加剂，用于处理织物，如含纤维素织物和对 其有用的纤维，作为动物饲料添加剂，用在生物量转化中，用于处理 纸浆和纸，以及用在淀粉的处理中，用于生产高果糖玉米浆或者乙醇。
本发明的又一个目的是，提供通过来自重组宿主细胞的异源
表达，生产新的纤维素酶的方法。 本发明的又进一步的目的是，提供编码本发明纤维素酶的核 酸序列。在一方面，核酸和氨基酸序列有助于商业生产本发明的新的 纤维素酶和纤维素酶组合物。 本发明的再进一步的目的是，提供新的纤维素酶，其具有极 好的特性，用于洗涤剂，处理织物，用作饲料添加剂以及用于制造纸 浆和纸。在进一步的方面，发现纤维素酶在生物量转化中有用。
在第一个方面，本发明包括具有编码BagCd序列的分离的 多核苷酸，与5agCe/基因编码序列互补的序列，和含有该多核苷酸的 组合物。多核苷酸可以是mRNA、 DNA、 cDNA、基因组DNA、或者 它们的反义类似物。 在一种实施方案中，SagCd多核苷酸可以包括分离的核酸分 子，在中度至高度严紧(stringency)的条件下，该分子和被显示为SEQ ID NO: 1的核酸的互补序列杂交，其中所述核酸分子编码显示出纤维 素结合活性的BagCel多肽。
与被显示为SEQ ID NO : 1的序列具有至少80%、 85%、 90%、 95%、 98%或者更多序列同一性的多核苷酸，可以编码BagCd 蛋白。在一种具体的实施方案中，多核苷酸包括与SEQ ID NO : 1基 本相同的序列。本发明也预期了多核苷酸的片段，优选地是长度至少 大约15-30个的核苷酸。 在第二个方面，提供了可以从杆菌(Bfld//1^)得到的新的纤 维素酶或其衍生物。优选地，本发明的纤维素酶包括，根据图2(SEQID NO:2)的氨基酸序列，片段、或者其衍生物，与其活性部分具有大于90%的序列同一性，优选地，具有大于95%的序列同一性，和更优选 地，具有大于97%的序列同一性。 在第三方面，本发明涉及含有编码本发明多肽的核苷酸序列 的构建物，所述核苷酸序列和一个或者多个调控序列有效地连接，调 控序列指导多肽产物在合适的宿主中产生。 本发明进一步提供了重组的表达载体，其包括编码BagCel 或者片段或者其剪接变体的核酸序列，核酸序列和调控元件有效地连 接，调控元件对于在选定宿主中表达蛋白是有效的。在一个相关方面， 本发明包括含有该载体的宿主细胞。 在第四方面，本发明涉及含有本发明核酸构建物的重组表达 载体。 在第五方面，本发明涉及含有本发明核酸构建物的重组宿主 细胞。 本发明进一步包括，通过重组技术生成BagCd的方法，这 是通过在可有效促进蛋白表达的条件下，培养含有编码BagCel的核酸 序列的重组原核宿主细胞或者真核宿主细胞，并随后从宿主细胞或者 细胞培养介质中回收蛋白而实施的。 在第六方面，本发明涉及用于生成本发明多肽的方法，方法 包括(a)培养微生物，以生成多肽，所述微生物在野生型形式下可 以生成多肽；和(b)回收多肽。 在第七方面，本发明提供了在纤维素向乙醇转变中有用的酶 组合物。在一种优选的实施方案中，酶组合物包括BagCel。该组合物 可以进一步包括其它的纤维素酶，如内切葡聚糖酶和/或者纤维二糖水 解酶。组合物可以以BagCel被富集。
在本发明的一个实施方案中，提供了通过从环境中分离总微 生物群落DNA而鉴定新的酶，在大肠杆菌中构建基因组DNA文库， 筛选库中纤维素酶活性表达，在纤维素酶阳性克隆中鉴定纤维素酶基 因和确定新的纤维素酶的特征的方法。 此处进一步提供了用于检测SflgCe/核酸和BagCel蛋白的分 析方法，这也构成本发明的一部分。
根据本发明的又一种实施方案，提供了用根据本发明的编码纤维素酶的核酸序列转化合适的微生物的方法。提供了从所述的转化 微生物生成根据本发明的纤维素酶的方法。 本发明的迸一步的目的是，提供在链霉菌(&r印/om少c^)中 特别有效的表达载体。链霉菌作为选择性的宿主细胞，用于生产各种 蛋白；并且在表达和生成纤维素酶上，可以提供比杆菌宿主细胞优越 的许多益处，特别是当细胞在高细胞密度下生长时。优选的表达载体 包括调控多核苷酸序列，它包含来自游动放线菌G4^/20/7/w^)的葡 萄糖异构酶基因的启动子序列，来自链霉菌纤维素酶基因的信号序列， 和编码纤维素酶，特别是根据本发明的纤维素酶的DNA序列。
在本发明的优选实施方案中，从杆菌可以得到全长的纤维素 酶。 从下面的详细描述，本发明的其它目的、特征和益处将是显 然的。然而，应该理解，详细的说明和具体的实施例，尽管指出了是 本发明的优选实施方案，是仅通过例证的方式给出的，原因是，对于 本领域的技术人员来说，从此详细的说明中，在本发明的范围和精神 之内的各种变化和修改，将是显然的。
附图简述

图1示例了环境核苷酸序列(SEQ ID NO : 1)。 图2示例了编码新的纤维素酶的核酸序列(SEQ ID NO : 2)。 图3示例了本发明纤维素酶的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO : 3)。
发明详述现在，将通过参考、使用下面的定义和实施例来详细描述本发明。 此处提及的所有的专利和出版物，包括在这些专利和出版物中公开的 序列，都明确地以引用方式并入。 除非本文另有定义，此处应用的所有技术术语和科学术语， 皆具有本发明所属领域的普通技术人员所普遍理解的同一含义。
Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York(1994)和Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)向技术人员提供了本发明中应 用的许多术语的一般性词典式解释。尽管与此处描述的方法和材料相 似或者等价的任意方法和材料可以被用于本发明的实践或者试验中， 但仍描述了优选的方法和材料。数字范围包括用于限定该范围的端值。 除非另有指明，核酸以5'-3'的方向从左至右书写；氨基酸序列以氨基 末端向羧基末端的方向从左至右书写。关于本领域的定义和术语，实 践者可以特别地参考Sambrook et al., 1989和Ausubel FM et al.， 1993 。 应该理解，本发明不限于所描述的具体的方法学、方案和试剂，因为 它们可以变化。 本文提出的标题不是对本发明各个方面或者各种实施方案 的限制，可以通过参考整个说明书来考虑它们。因此，通过将说明书 作为一个整体来参考，下面即将被定义的术语可以被更加全面地定义。
本文引用的所有出版物均特意地通过引用方式并入本文，以 用于描述和揭示可能与本发明联系使用的组合物和方法学。 1.定义 "纤维素酶"(cellulase)、"纤维水解酶"(cellulolytic enzymes) 或者"纤维素酶酶"(cellulase enzymes)是指此处描述的发明的细菌内 切葡聚糖酶(endoglucanases)。纤维素酶的三种不同形式协同作用， 以将纤维素及其衍生物转化为葡萄糖。 术语"纤维素酶"是指酶的一个种类，该酶能够水解纤维素多 聚物为较短的纤维寡糖寡聚物、纤维二糖和/或者葡萄糖。纤维素酶的 许多例子，如外切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和 葡糖苷酶，已经从可水解纤维素的生物体中获得，特别地，包括真菌 和细菌。这些微生物产生的酶是具有三种类型的功能的蛋白混合物 内切葡聚糖酶(endoglucanases (EG))、纤维二糖水解酶 (cellbiohydrolases(CBH))和/3-葡糖苷酶，它们在纤维素向葡萄糖的 转变中是有用的。纤维素酶的这三种不同形式协同作用，以将纤维素 及其衍生物转化为葡萄糖。
许多微生物都产生水解纤维素的酶，包括腐木真菌木霉 (7h'cAocferwa)、堆肥细菌高温单孢菌(T7zermomo打os^ora)、杆菌(5ac/〃M)和纤维单胞菌(Ce〃w/omo"as);链霉菌(&"; to附;;c^); 和真菌腐质霉(//"wfco/a)、曲霉(^印wg/〃M)和镰孢菌(Fm幼〃'w附)。
术语"宿主细胞"是指含有载体并支持表达构建物的复制和/ 或转录或者转录和翻译(表达)的细胞。用于本发明的宿主细胞可以 是原核细胞，如大肠杆菌，或者真核细胞，如酵母、植物、昆虫、两 栖动物或者哺乳动物细胞。在根据本发明的一种实施方案中，"宿主细 胞"意味着杆菌属细胞。在根据本发明的另一种优选的实施方案中，"宿 主细胞"意味着链霉菌细胞。链霉菌是指，是链霉菌属的一个成员的任 意菌株，如在Buchanan et al.， The Shorter Bergey's Manual For Determinative Bacteriology (Williams & Wilkens 1982)中所分类。特别优 选的链霉菌株包括& //vzVfe"s、S. rw6i^7'"osws、禾口 5". coe/Zco/or。;S1. //v^/e"51 在Lomovskaya et al., J. Virology 9: 258 (1972)中有所描述。然而，技术 人员将认识到，可以应用任何合适的宿主细胞，例如细菌、真菌、真 核细胞和植物细胞。 术语"重组体(recombinant)"，当用于例如细胞或者核酸、 蛋白、载体时，表示该细胞、核酸、蛋白或者载体已经通过异源性核 酸或蛋白的导入或者天然核酸或蛋白的改造而被修饰，或者该细胞来 源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在该细胞的天然(非 重组)形式中未发现的基因，或者表达的是天然基因，但是该天然基 因在其它情况下是异常地表达、表达不足或者根本不表达。
术语"促分泌信号序列"表示编码多肽("促分泌肽"或者"促分 泌信号肽")的DNA序列，促分泌肽作为更大的多肽的一部分，指导 该更大的多肽穿过合成它的细胞的分泌通路。在通过所述分泌通路的 过程中，该更大的肽通常被切割，去除促分泌肽，以生成促分泌信号 肽和通常被称为成熟多肽的较小的肽。 如此处所应用，短语"全纤维素酶制备物(whole cdlulase preparation)，，禾口"全纤维素酶组合物(whole cellulase composition)"可
以互换地应用，可以指天然发生和非天然发生的组合物。"天然发生的" 组合物是由天然发生的来源产生的，其含有，例如， 一个或者多个纤 维二糖水解酶类型、 一个或者多个内切葡聚糖酶类型，和一个或者多 个13-葡糖苷酶成分，其中这些成分中的每一个以由所述来源所产生的比率被发现。某些真菌产生全纤维素酶系统，其包括外切纤维二糖水
解酶或者CBH-类型纤维素酶、内切葡聚糖酶或者EG-类型纤维素酶， 和J3-葡糖苷酶或者BG-类型纤维素酶(Schulein， 1988)。然而，有时这 些系统缺乏CBH-类型的纤维素酶，并且细菌纤维素酶也典型地几乎 不包括CBH-类型的纤维素酶或者不包括CBH-类型的纤维素酶。天然 发生的组合物是由就纤维素水解酶而言未加以修饰的生物体产生的组 合物，因此酶成分的比率与由天然生物体生成的相比没有改变。
"非天然发生的"组合物包括那些如下产生的组合物(1)以 天然发生的比率或者非天然发生的比率即改变的比率将纤维水解酶成 分组合起来；或者(2)修饰生物体，以过量表达或者抑制表达一种或 者多种纤维素水解酶；或者(3)修饰生物体，以致于至少一种纤维素 水解酶被剔除，或者(4)修饰生物体，以表达异源的纤维水解酶成分。
如此处所应用，术语"启动子"是指核酸序列，其功能是指导 下游基因的转录。启动子通常适用于表达靶基因的宿主细胞。启动子 与其它转录调节核酸序列和翻译调节核酸序列(也被称为"调控序 列")，对表达特定的基因是必需的。通常地，转录调节序列和翻译调 节序列包括但不限于，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始序列 和转录终止序列、翻译起始序列和翻译终止序列，以及增强子或者激 活子序列。启动子可以是通常与下游基因相关联的启动子，或者启动 子可以是异源的，即来自另一基因或者另一微生物，只要它是作用是 指导基因。当转化宿主细胞是杆菌时，优选的启动子叩rE启动子。在 一方面，启动子是可诱导型启动子。在一方面，当宿主细胞是丝状真 菌时，启动子是里氏木霉(瑞氏木霉，(7>eese/)) cM/启动子，其在 GenBank中的收录编号(Accession Number)是D86235。在另一个方 面，启动子是来自瑞氏木霉的^////或者木聚糖酶启动子。
当一个核酸被置于与另一个核酸序列的功能联系中时，该核 酸便是"有效连接的(operablylinked)"。例如，如果多肽是以参与该 多肽的分泌的前蛋白形式被表达，那么编码促分泌前导序列即信号肽 的DNA便与该多肽的DNA是有效连接的；如果启动子或增强子可影 响编码序列的转录，那么该启动子或增强子便是有效连接于该序列； 或者，如果核糖体结合位点被定位以致于可协助翻译，那么该核糖体结合位点便是有效连接于编码序列。通常地，"有效连接"意味着被连
接的DNA序列是相邻的，而且在促分泌前导序列的情形中，是相邻 的和处于正确的阅读框架中的。然而，增强子不一定是相邻的。连接 可以通过在方便的限制性位点进行连接而完成。如果这样的位点不存 在，可以按照常规的实践，应用合成的寡核苷酸接头或者连接子。
"DNA构建物"或者"DNA载体"是指核酸序列，其包括编码 新的纤维素酶的一个或者多个DNA片段。"表达载体"包含在"DNA载 体"之中。典型的表达载体含有调节序列，如转录终止子和翻译终止子， 转录起始序列和翻译起始序列，信号序列，和对调节特异核酸表达有 用的启动子。术语"启动子"以其通常的意义被应用，是指多核苷酸序 列，参与调控编码蛋白的多核苷酸序列的转录起始。"信号序列"是指 信号肽或者蛋白质的一部分，所述蛋白质能够指导所需蛋白质以生物 活性形式从宿主中运输。细胞外蛋白的成熟形式缺乏信号序列，其在 分泌过程中被切割。尽管不意图于限制本发明，信号肽中的氨基酸残 基数目可以在大约5至大约100个氨基酸残基之间。信号序列可以被 修饰，以提供克隆位点，以允许连接DNA或者插入编码纤维素酶的 DNA。载体任选地包括一般的表达序列盒，包括至少一个独立的终止 子序列，允许序列盒在原核生物、真核生物或者两者中复制的序列(例 如，穿梭载体)和用于原核系统和真核系统的选择标记。载体适于在 原核生物、真核生物或者两者中复制和整合。参见，GilimanandSmith， Gene 8: 81-97 (1979); Roberts et al.， Nature 328: 731-734 (1987); Berger and Ki醒el, GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL 152， Academic Press, Inc., San Diego， CA ("Berger") ; Scheider, B.， et al., Protein Expr. Purif 6435: 10 (1995); Sambrook et al.， MOLECULAR CLONING-A LABORATORY MANUAL (2ND ED.) VOL. 1-3， Cold Springs Harbor Publishing (1989) ("Sambrook");和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al.， (eds.)， Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1997 Supplement) ("Ausubel")。在链霉菌中有用的载体是已知的，并 参见美国专利4,338,397; 4,411, 994; 4,513,085; 4,513,086; 4,745,056; 5,514,590;和5,622,866号以及W088/07079。
如此处所应用，术语"基因"是指参与生成多肽链的DNA片 段，可以包括或者不包括编码区之前的区域和之后的区域，例如，5' 非翻译区(5'UTR)或者"前导"序列和3'UTR或者"尾部"序列，也可 以包括或者不包括各个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
当用于谈及核酸部分时，术语"异源的，，("heterologous")表 示，该核酸含有2个或者更多个子序列(subsequences),其在正常情 况下在自然界中未发现相互之间具有同样的关系。例如，该核酸典型 地通过重组产生，具有例如来源于不相关的基因的2个或者更多个序 列，它们被排列以形成具有新功能的核酸，例如，所述的序列可以是 一个来源的启动子和另一个来源的编码区域。类似地，异源蛋白常常 涉及两个或者更更多个子序列，其在自然界中并未发现具有同样的相 互关系(例如，融合蛋白)。 如此处所应用，术语"分离的"或者"纯化的"是指与同其天然 联系的至少一种成分分离开的核酸或者氨基酸。
在本文中，术语"大体上纯化的多肽"(substantially pure polypeptide)意味着，含有与其天然相关的其它多肽物质的最多10% 重量的多肽制备物(优选更低百分比的其它多肽物质，例如，最多8 %重量，最多6%重量，最多5%重量，最多4%重量，最多3%重量， 最多2%重量，最多1%重量，和最多1/2%重量)。因此，优选地，大 体上纯化的多肽是至少92%纯度的，gp，该多肽构成制备物中存在的 总多肽物质的至少92%重量，优选更高的百分比，如至少94%纯度， 至少95%纯度，至少96%纯度，至少96%纯度，至少97%纯度，至 少98%纯度，至少99%纯度，和至少99.5%纯度。此处公开的多肽优 选地处于大体上纯化的形式。具体来说，优选地，此处公开的多肽是 处于"基本纯化的形式"(essentially pure form)，即，多肽制备物基本 上不含有与其天然相关的其它多肽物质。这可以通过，例如，用公知
的重组方法制备多肽而完成。在此处，术语"大体上纯化的多肽"与术
语"分离的多肽"和术语"分离形式的多肽"是同义的。
—般来说，在中度至高度严紧(stringency)的条件下，编码
BagCel的核酸分子会和此处提供为SEQ ID NO: 2 (BagCel)的序列
杂交。然而，在一些情形下，应用的是具有大体上不同的密码子选择的编码BagCel的核苷酸序列，而由该编码BagCel的核苷酸序列编码 的蛋白质具有和天然蛋白质相同的或者大体上相同的氨基酸序列。例 如，根据特定密码子被宿主应用的频率，编码序列可以被修饰以有利 于BagCd在特定原核细胞或者真核细胞表达系统中更快地表达，例 如，Te'o, et al. (2000)描述了在丝状真菌中表达基因的最优化方式。
如果两个序列在中度至高度严紧的杂交和洗脱条件下彼此 特异地杂交，那么便认为其中一个核酸对于另一个参照核酸，是"可选 择性地杂交"的。杂交温度是基于核酸结合复合物或者探针的解链温度 (Tm)。例如"最大的严紧性"典型地发生在大约Tm-5。C (低于探针的 Tm5。C);"高严紧性"发生在低于Tm大约5-l(TC;"中度"或者"中间 严紧性"发生在低于探针的Tm大约10-2(TC;"低严紧性"发生在低于 Tm大约20-25t:。从功能上来说，最大严紧条件可以被用来鉴定与杂
交探针具有严格同一性或者接近严格的同一性的序列，而高严紧条件 被用来鉴定与探针具有大约80%或者更多的序列同一性的序列。
中度严紧和高度严紧的杂交条件在本领域是公知的(参见， 例如，Sambrook, et al, 1989, Chapters 9 and 11,以及Ausubel, F. M., et al., 1993，在此特意地并入作为参考)。高度严紧条件的例子包括，在 大约42。C，在50%甲酰胺、5xSSC、 5xDenhardt's溶液、0.5%SDS和 100jitg/ml变性载体DNA中杂交，随后，用2xSSC和0.5% SDS室温 洗涤2次，用O.lxSSC和0.5%SDS在42'C再洗涤2次。
如本文所应用，当用于描述细胞时，术语"转化的"、"稳定 转化的"或者"转基因的"是指该细胞具有非天然的(异源的)核酸序列， 其被整合入细胞的基因组中或者作为附加体质粒，经过多代之后依然 被维持。 如本文所应用，术语"表达"是指根据基因的核酸序列产生多 肽的过程。此过程既包括转录又包括翻译。 在谈及将核酸序列插入到细胞中时，术语"导入"是指"转染" 或者"转化"或者"转导"，包括将核酸序列整合到真核细胞或者原核细 胞中，其中所述核酸序列可以被并入到细胞的基因组(例如，染色体、 质粒、质体或者线粒体DNA)，转变为自主复制子，或者瞬时表达(例 如，转染的mRNA)。
如本文所应用，术语"含纤维素的织物(cellulose containing fabric)"是指任何缝制或者非缝制的织物、纱或者纤维，由含棉或者 不含棉的纤维素制成，或者由含棉或者不含棉的纤维素混合物制成， 所述的纤维素混合物包括天然纤维素和人造纤维素(如黄麻、亚麻、 苎麻、人造丝和莱赛尔纤维(lyocell))。 如本文中所使用的，术语"含棉织物(cotton-containing fabric)"指缝制或者非缝制的织物、纱或纤维，其由纯棉或棉混合物 制成，棉混合物包括棉织物(cotton woven fabrics)、棉编织物(cotton knits)、斜纹粗棉布(cotton denims)、棉纱(cotton yarns)、原棉和类 似物。 如本文中所应用，术语"石磨洗组合物"是指用于石磨洗含纤 维素的织物的制剂。石磨洗组合物被用于在出售之前，即，在生产过 程中修饰含纤维素的织物。与之不同，洗涤剂组合物主要用于清洁污 染的衣服，而不是用在生产过程中。
如本文中所应用，术语"洗涤剂组合物(detergent composition)"是指打算应用于洗涤介质中用于洗涤污染的含纤维素织 物的混合物。就本发明来说，除了纤维素酶和表面活性剂，这样的组 合物还可以包括另外的水解酶、助洗剂(buiders)、漂白剂、漂白催化 剂、蓝色漂白剂(bluing agents)和荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂 (masking agents)、纤维素酶激活剂、抗氧化剂和增溶剂。
如本文中所应用，术语"活性的"或者"生物活性的"是指与特 定蛋白相关联的生物活性，它们在此可以互换应用。例如，与蛋白酶 相关联的酶活性是蛋白水解，因此，活性蛋白酶具有蛋白水解活性。 这样，特定蛋白的生物活性是指本领域技术人员通常认为该蛋白具有 的任何生物活性。 当应用于酶溶液时，BagCd成分通常被加入的量足以允许可 溶性糖以最大速度从生物材料中释放出来。加入的BagCel成分的量取 决于要被糖化的生物材料的类型，这可以被技术人员容易地确定。然 而，当被应用时，BagCel成分相对于纤维素酶组合物中存在的任何其 它纤维素酶类型成分的重量百分比是从优选地大约1、优选地大约5、 优选地大约10、优选地大约15或者优选地大约20的重量百分比至优 选地大约25、优选地大约30、优选地大约35、优选地大约40、优选 地大约45或者优选地大约50的重量百分比。进一步地，优选的范围 可以是，大约0.5至大约15的重量百分比、大约0.5至大约20的重量 百分比、从大约1至大约10的重量百分比、从大约1至大约15的重 量百分比、从大约1至大约20的重量百分比、从大约1至大约25的 重量百分比、从大约5至大约20的重量百分比、从大约5至大约25 的重量百分比、从大约5至大约30的重量百分比、从大约5至大约 35的重量百分比、从大约5至大约40的重量百分比、从大约5至大 约45的重量百分比、从大约5至大约50的重量百分比、从大约10 至大约20的重量百分比、从大约10至大约25的重量百分比、从大约 10至大约30的重量百分比、从大约10至大约35的重量百分比、从 大约10至大约40的重量百分比、从大约10至大约45的重量百分比、 从大约10至大约50的重量百分比、从大约15至大约20的重量百分 比、从大约15至大约25的重量百分比、从大约15至大约30的重量百分比、从大约15至大约35的重量百分比、从大约15至大约30的 重量百分比、从大约15至大约45的重量百分比、从大约15至大约 50的重量百分比。
II.分子生物学 本发明依赖于重组遗传学领域中的常规技术。公开了用于本 发明的一般性方法的基本文献包括Sambrook et al.， Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler， Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990),禾卩Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994)。
为了获得克隆基因的高水平表达，异源基因优选地位于，距 启动子的距离与在天然发生的纤维素酶基因中大约相同的位置。然而， 如本领域中己知，此距离可以出现一些变化，而不丧失启动子功能。
本领域中的技术人员意识到，天然的启动子可以通过一个或 者多个核苷酸的替换、取代、添加或者刪除被修饰，而不改变其功能。 本发明实践包含对启动子的这些改变但不受其所限。
表达载体/构建物典型地含有转录单位或者表达序列盒，其含 有用于异源序列表达所需的所有附加的元件。因此，典型的表达序列 盒含有启动子，它有效地连接于异源核酸序列和转录物、核糖体结合 位点及翻译终止的有效聚腺苷酸化所需的信号。序列盒的附加元件可 以包括增强子和，如果基因组DNA被用作结构基因，包括内含子， 其带有功能性剪接供体部位和受体部位。 本发明实践不受对遗传构建物中启动子的选择所限。在启动 子选择中唯一的限制是，它在所应用的宿主细胞中是有功能的。当转 化宿主细胞是杆菌(Sad//^)时，优选的启动子是aj^E启动子。
除启动子序列之外，表达序列盒还应该含有结构基因下游的 转录终止区，以提供有效的终止。终止区可以从与启动子序列相同的 基因获得，或者可以从不同的基因获得。 用于转运遗传信息进入细胞的具体表达载体不是特别严格 的。可以应用用于真核细胞或者原核细胞中的任意常规表达载体。标 准的细菌表达载体包括噬菌体入和噬菌体M13，以及质粒如基于pBR322的质粒，Pskf， pET23D，和融合表达系统如MBP， GST和 LacZ。表位标签(epitope tags)也可以被加入重组蛋白，以提供方便 的分离方法，例如，c-myc。 典型地包括在表达载体中的元件也包括，复制子，编码抗生 素抗性的基因以允许选择出含有重组质粒的细菌，和质粒的非必需区 中的单一限制性位点，以允许异源序列的插入。选择的具体抗生素抵 抗基因是不严格的，本领域中已知的众多抗性基因中的任意一个均是 适合的。 本发明的转化方法可以导致转化载体的全部或者部分被稳 定地整合到丝状真菌的基因组中。然而，转化也可以导致自我复制的 染色体外转化载体的维持，这也被本发明预期。
应用入噬菌体(表达)载体和大肠杆菌宿主细胞，可以克隆出 编码本发明纤维素酶的基因。(选择性地，可以应用在保守结构域上设 计的共有引物，进行PCR克隆。)申请人已经揭示了，编码本发明纤 维素酶的基因的转化和在大肠杆菌中的表达，导致形成活性蛋白。在 大肠杆菌中的第一个克隆步骤之后，根据本发明的纤维素酶基因可以 被转运至更优选的工业表达宿主中，如杆菌属或者链霉菌属，丝状真 菌，如曲霉(A/ er^〃船)或者木霉(7h'c/zo&wm)，或者酵母如酵母 属(&cc/^om少cM)。在这些宿主微生物中可以获得的高水平表达及 分泌，使纤维素酶在发酵培养基中积累，随后，纤维素酶从发酵培养 基中被回收。 在Ferrari etal.的美国专利5,264,366号中，提供了，对于蛋 白酶删除杆菌株而言，优选的普通的转化及表达方案，该专利在此并 入，作为参考。在例如，Berkaetal.的美国专利5,364,770号中，描述 了在曲霉中的转化和表达，该专利在此并入，作为参考。
许多标准的转染方法可以被用来产生表达大量异源蛋白的 瑞氏木霉细胞系。用于将DNA构建物导入产纤维素酶木霉株的一些 已公开的方、法包括，Lorito, Hayes， DiPietro and Harman, 1993, Curr. Genet. 24: 349-356; Goldman, VanMontagu and Herrera-Estrella, 1990， Curr. Genet. 17: 169-174; Penttila, Nevalainen， Ratto, Salminen and Knowles, 1987, Gene 6: 155-164, X寸于曲霉菌，Yelton, Hamer andTimberlake, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470- 1474，对于镰刀 菌，Bajar， Podila and Kolattukudy， 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8202-8212，对于链霉菌，Hopwood et al., 1985, The John Innes Foundation, Norwich, UK, 以及X寸于芽孢杆菌，Brigidi， DeRossi， Bertarini， Riccardi and Matteuzzi， 1990, FEMS Microbiol. Lett. 55: 135-138)，所有的文献在此并入，作为参考。 然而，用于将外源核苷酸序列导入宿主细胞的任何已知的方 法都可以被应用。这些方法包括应用磷酸钙转染、凝聚胺法 (polybrene)、原生质体融合、电穿孔、生物弹、脂质体、微注射、等 离子体载体、病毒载体和用于将克隆的基因组DNA、 cDNA、合成的 DNA或其它外源遗传物质导入宿主细胞的任何其它已知的方法(参 见，例如，Sambrook et al.,见上文)。也可以应用美国专利6,255,115 中描述的农杆菌介导的转染方法。这里的要求仅是所使用的具体遗传 工程方法能够成功地将至少1个基因导入能够表达该异源基因的宿主 细胞。 表达载体被导入细胞之后，将转染的细胞在有利于基因表达 的条件下培养，所述表达是在纤维素酶基因启动子序列调控下进行的。 大量的转化细胞可以如下面所描述而被培养。最后，用标准技术将产 物从培养物中回收。 因此，本发明在此提供了本发明的纤维素酶的表达和增加的 分泌，所述纤维素酶的表达是在纤维素酶基因启动子序列的调控下进 行的，包括天然发生的纤维素酶基因，融合DNA序列，和各种异源 构建物。本发明也提供了用于表达和分泌高水平的本发明纤维素酶的 方法。
III.鉴定核酸和编码的蛋白序列
应用本领域中己知的标准技术，制备来自杆菌^z"7/w flgararf/^erara (DSM 8721)的基因组文库。该生物体产生碱性纤维素 酶，(内切-1，4-/3-葡聚糖酶)，属于糖基水解酶的纤维素酶家族5，内切 葡聚糖酶5A ， EC 3.2丄4， Swiss-Port: 085465，条目名称 GUN5—BACAG. EBI序列号AF067428)，其基因长度是1203bp，(Daviesetal. 1998)。纤维素酶阳性克隆是用1/3000的频率在平板分析 中检测的。根据本发明的一个方面，在用于分离基因的方法中，应用 基于此酶的编码序列的简并引物。然而，出乎意料的是，应用已知引 物扩增已知的5. 4gara^iaera打s纤维素酶时，没有得到PCR产物。因 此，编码纤维素酶的完整插入序列是通过引物步移法(primer walking) 被确定的。 根据本发明的第二方面，用于分离基因的方法利用了其与含 有如序列表所示的SEQ ID NO: 2的全部或者部分的核苷酸序列的同 源性。此方法的例子包括-
a) 用核苷酸序列作为探针，筛选预测含有BagCel基因的基因 文库。
b) 根据核苷酸序列信息制备引物，然后用预测含有BagCel 基因的样品作为模板，进行PCR反应。
更具体地，上述的方法a)包括
a)制备预测含有纤维素酶基因的基因文库，用含有如序列表所示 的SEQ ID NO: 2核苷酸序列的全部或者部分的核苷酸序列筛选该基 因文库，从基因文库中选出与含有如序列表所示的SEQ ID NO: 2核 苷酸序列的全部或者部分的核苷酸序列杂交的序列，然后分离选出的 序列，并从已从基因文库选出并分离的序列中分离BagCel序列。
基因文库可以是基因组DNA文库或者cDNA文库，可以根
据己知的方法来制备。
IV.蛋白表达 本发明的蛋白是通过培养用表达载体转化的细胞而生产的， 表达载体含有本发明的纤维素酶基因，该基因的表达处于启动子序列 的调控之下。本发明对于增加蛋白的细胞内和/或者细胞外生成是特别 有用的。蛋白可以是同源的或者是异源的。
本发明的蛋白也可以被修饰，修饰的方式是，形成含有与另 一个异源多肽或者氨基酸序列融合的所需蛋白的嵌合分子。在一种实 施方式中，这样的嵌合分子包括，用标记多肽进行所需蛋白的融合， 标记多肽提供了抗标签抗体可以选择性地与之结合的表位。表位标记通常被置于所需蛋白的氨基或者羧基末端。 各种标记多肽和它们各自的抗体在本领域中是公知的。例子 包括，聚组氨酸(poly-his)或者聚组氨酸-苷氨酸(poly-his-gly)标记;HISS 和金属鳌合标记，flu HA标记多肽及其抗体12CA5 (Field et aL, Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988) ) ; c-myc标记及其8F9,3C7，6E10,G4,B7 和9E10抗体(Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5: 3610-3616 (1985));和单纯疱疹病毒糖蛋白D (gD)标记及其抗体(Paborsky et al., Protein Engineering 3 (6): 547-553 (1990))。其它的标记多肽包括 FLAG-肽(Hopp et al., BioTechnology 6 : 1204-1210 (1988) ) ; KT3表位 肽(Martin et al., Science 255: 192-194 (1992));微管蛋白表位肽 (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266: 15163-15166(1991));和T7基因10 蛋白肽标记(Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6393-6397(1990》。 适于表达所述BagCel基因的条件包括，向培养物提供用于 本发明的纤维素酶生长和/或者表达所需的成分。根据对宿主细胞的选 择，以及随着对欲表达蛋白的选择，用于生成蛋白的最佳条件将会有 所变化。本领域的技术人员通过常规的实验或者优化，可以容易地确 定该条件。 在表达之后，所需蛋白典型地被纯化或者分离出来。根据样 品中存在的其它成分，用本领域的技术人员已知的各种方式，可以将 所需蛋白分离或者纯化出来。标准的纯化方法包括电泳技术、分子技 术、免疫学技术和层析技术，层析技术包括离子交换层析、疏水层析、 亲和层析、和反相HPLC层析、和层析聚焦。例如，可以用标准的抗 所需蛋白的抗体柱，将所需蛋白纯化出来。超滤技术和透析过滤技术 与蛋白浓縮相结合，也是有用的。关于合适的纯化技术的一般指导， 参见Scopes, Protein Purification (1982)。根据所需蛋白的用途，所需的 纯化程度将有所不同。在一些情况下，不需要进行纯化。
V.纤维素酶的效用
根据本发明，对织物的处理预期了，用含有本发明纤维素酶 的组合物对织物进行加工或者清洁。这种处理包括但不限于，石磨洗，修饰含纤维素织物的质地、手感和/或者外观，或者在含纤维素织物的 生产或者清洁/修复期间应用的其它技术。另外地，在本发明的内容中 的处理预期了 ，从纤维素织物或者纤维中去除"不成熟的"或者"死的" 棉。不成熟的棉比成熟的棉更加不定形，这是由于，例如，不均匀染 色。本发明中预期的组合物进一步包括，用于清洗污染的人造的含纤 维织物的纤维素酶成分。例如，本发明的纤维素酶可以被用于洗衣店 的洗涤剂组合物中。根据本发明的有用的洗涤剂组合物包括特殊配方， 如预洗、预浸泡和家用恢复颜色组合物。这种处理组合物，如此处所 应用，可以以需要稀释的浓縮物形式存在，或者以稀释液的形式存在， 或者以可以被直接用于含纤维素织物的形式存在。用于织物的纤维素
酶处理的普通处理技术，在例如欧洲专利出版物220 016号和英国出 版物1,368,599及2,095,275中有所描述。 根据本发明，对纤维素物质的处理进一步预期了，对动物饲 料、纸浆和/或者纸、食物和谷物的处理，处理的目的在本领域中是已 知的。例如，已知纤维素酶增加动物饲料的价值，改进木纸浆的滤水 性能，增加食物产物并在谷物湿磨过程及干磨过程中降低谷物中的纤 维。
根据本发明的处理包括，制备包含有效量的纤维素酶或者 纤维素酶与其它任选成分的结合物的水溶液，任选成分包括，例如， 缓冲液、表面活性剂、和/或者洗涤剂。有效量的纤维素酶组合物是指， 足以用于其意图用途的纤维素酶浓度。因此，例如，根据本发明，在 石磨洗中的"有效量"的纤维素酶是指，会提供所需效果，例如，在 接缝处及在纤维嵌条(fabricpands)上产生磨过的和褪色的外观(look) 的量。相似地，在意图改进含纤维素织物手感和/或者表观(表观， appearance)的组合物中，"有效量"的纤维素酶是指，在手感上产生可 测定的改善的量，例如，改进了织物的光滑度，或者在表观上产生可 测定的改善的量，如，去除可降低织物外观的清晰度的小球和fabril (原纤维)。应用的纤维素酶量也取决于采用的设备，使用的处理参数 (纤维素酶处理溶液的温度，暴露于纤维素酶溶液的时间和类似参 数)，和纤维素酶的活性(如，特别的溶液需要较低浓度的纤维素酶， 其中与较不活化的纤维素酶组合物相比，应用了更活化的纤维素酶组合物)。根据上述的因素以及所需的结果，技术人员可以容易地确定纤 维素酶在欲处理织物被加入其中的水处理液中的确切浓度。在石磨洗 方法中通常优选的是，纤维素酶在水处理液中存在的浓度为，从大约
0.5至5,000 ppm总蛋白，和最优选的是大约10至200 ppm总蛋白。
在用于改善含纤维素织物的手感和/或者表观的组合物中，通常优选的 是，纤维素酶在水处理液中存在的浓度为，从大约0.1至2000ppm总 蛋白，和最优选的是大约0.5至200ppm总蛋白。
在一种优选的处理方案中，在处理组合物中采用缓沖液，以 致于缓冲液的浓度足以将溶液的pH值维持在应用的纤维素酶显示活 性的范围内。纤维素酶显示活性的pH值取决于技术人员可以容易地 考虑的几个因素。例如，在一种优选的实施方案中，选择缓冲液及缓 冲液的浓度，以使最终的纤维素酶溶液的pH值维持在最大化纤维素 酶活性所需的pH范围内。对本发明纤维素酶的最佳pH范围的确定可 以根据公知的技术来确认。对于本领域的技术人员来说，在纤维素酶 活性范围内的pH值的合适的缓冲液也是已知的。
除了纤维素酶和缓冲液，处理组合物可以优选地含有表面活 性剂。合适的表面活性剂包括与应用的纤维素酶及织物相容的任意表 面活性剂，包括，例如，阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂 和兼性表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于，线性的 或者分支的垸基苯磺酸盐；具有线性或分支垸基基团或者烯基基团的 烷基或烯基醚硫酸盐；垸基或烯基硫酸盐；烯烃磺酸盐；烷基磺酸盐 和类似物质。阴离子表面活性剂的合适的平衡离子包括但不限于，碱 金属离子如钠和钾；碱土金属离子如钙和镁；胺离子，和具有碳原子 数为2或3的1至3个垸醇基团的链烷醇胺。兼性表面活性剂包括， 例如，季铵磺酸盐和甜菜碱型兼性表面活性剂。这样的兼性表面活性 剂在同一分子中既有正电荷基团又有负电荷基团。非离子型表面活性 剂通常包括聚乙二醇，以及更高级的脂肪酸链垸醇酰胺或者其氧化烯 加合物，和脂肪酸甘油单酯。也可以采用本领域技术人员己知的方式， 应用表面活性剂的混合物。 可以制备浓縮的纤维素酶混合物，用于此处描述的本方法 中。这样的浓縮物含有浓縮量的上述纤维素酶组合物，缓冲液和表面活性剂，优选地存在于水溶液中。当如此制备时，纤维素酶浓縮物可 以容易地用水被稀释，以致于快速并精确地制备出具有每种成分所需 浓度的纤维素酶制备物。配制水性浓縮物时，可以将这些浓縮物稀释， 以致于达到上面所示的，在纤维素酶溶液中的成分的所需浓度。显然 地，这种纤维素酶浓度使得协助形成纤维素酶溶液，以及使得组合物 可行地被转运至其将被应用的位置。处理浓縮物可以是本领域中承认 的任意方式，例如，液体、乳剂、凝胶、或者浆糊。这样的形式对于 本领域的技术人员来说是已知的。
当应用固体纤维素酶浓縮物时，纤维素酶组合物可以是颗
粒、粉末、团块或者固体片。可以配制颗粒，以致于含有物质以降低 颗粒进入清洗介质的溶解速度。这样的物质和颗粒在美国专利
5,254,283中公开，该专利在此以整体并入，作为参考。 [98] 也可以如所需，将其它物质与本发明的纤维素酶组合物使 用，或者放在本发明的纤维素酶组合物中，根据组合物的最终用途， 其它物质包括石头、轻石、填充剂、溶剂、酶激活剂、和抗再沉积剂。 [99] 通过举例的方式，将详细描述石磨洗方法，然而，本领域的 技术人员可以容易地改变描述的参数，用于其它用途，即改善织物的 手感和/或者外观。通过用石磨洗组合物混合处理组合物，将含纤维素 织物与含纤维素酶的石磨洗组合物接触，所述石磨洗组合物含有有效 量的纤维素酶，并因此使纤维素酶与织物接近。随后，搅动含纤维素 酶和水溶液和织物。如果处理组合物是水溶液，可以将织物直接浸泡 在溶液中。相似地，当石磨洗组合物是浓縮物时，稀释浓縮物进入带 有含纤维素织物的水浴中。当石磨洗组合物处于固体形式，例如，预 洗凝胶或者固体棒时，可以通过直接向织物或者洗液应用组合物，接 触石磨洗组合物。 在使酶的作用有效赋予含纤维织物石磨洗外观的条件下，用 石磨洗溶液孵育含纤维织物。例如，在石磨洗期间，可以调节pH值， 液体比例，温度和反应时间，以最佳化石磨洗组合物作用的条件。所 需的"有效"条件是指允许纤维素酶与含纤维织物有效地反应的pH，液 体比例，和温度，在此情形下产生石磨洗的效果。最大化用于应用根 据本发明的石磨洗组合物的条件的方法，在本领域技术人员的技术范围内。
此处应用的，在石磨洗过程中的液体比例，即，石磨洗组合
物溶液的重量(即，洗涤液)与织物重量的比，通常是在粗斜纹棉布 织物中足以获得所需的石磨洗效应的量，并取决于应用的方法。优选
地，液体比例是从大约4:1至大约50:1，更优选地，从大约5:1至大 约20:1，和最优选地，从大约10:1至大约15:1。 [102] 在用本发明的石磨洗组合物进行石磨洗期间，反应温度是由 两个竞争性因子来控制的。首先，高温通常对应于增加的反应动力学， 即，更快的反应，与低温时所需的反应时间相比，这使反应时间减少。 因此，反应温度通常是至少大约IO'C及更高的温度。其次，纤维素酶 是这样一种蛋白，其在特定的反应温度以外丧失活性，该温度取决于 所应用的纤维素酶的性质。因此，如果允许反应温度升得过高，由于 纤维素酶的变性，纤维水解活性丧失。而本领域中使用纤维素酶的标 准温度通常在35'C至65'C范围内，并且这些反应条件也将被预期适合 于本发明的纤维素酶，对于应用的具体的纤维素酶，最适温度条件应 该根据公知的技术来确定。 反应时间取决于石磨洗发生的具体条件。例如，pH值，温 度和纤维素酶的浓度均会影响最佳反应时间。通常地，反应时间是从 大约5分钟至大约5小时，和优选地，从大约10分钟至大约3小时， 和最优选地，从大约20分钟至大约1小时。
根据本发明的又一种实施方案，本发明的纤维素酶可以被用 在洗涤剂组合物中。根据本发明的洗漆剂组合物作为预洗组合物，预 浸泡组合物，或者用于正常清洗或漂洗循环期间的清洁，是有用的。 优选地，本发明的洗涤剂组合物包括有效量的纤维素酶，表面活性剂， 并任选地包括下面描述的其它成分。
用于本发明洗涤剂组合物的纤维素酶的有效量是，足以对含 纤维素织物施加所需影响的量，已知该影响是由纤维素酶产生的，例 如，去球，软化，抗起球，表面纤维去除，抗暗淡和清洁。优选地， 洗涤剂组合物中应用的纤维素酶的浓度是，从大约10 ppm至大约 20,000 ppm洗涤剂。 用于洗涤剂组合物的纤维素酶的浓度被优选地选出，因此，一旦被稀释入清洗介质，纤维素酶的浓度范围是，大约0.01至大约
1000ppm总蛋白，优选地，从大约0.02 ppm至大约500 ppm总蛋白， 和更优选地，从大约0.5ppm至大约250 ppm总蛋白。用于洗涤剂组 合物的纤维素酶的量将取决于，洗涤剂被加入水以形成洗液时所稀释 的程度。 本发明的洗涤剂组合物可以是本领域中认可的任意形式，例 如，作为液体，在颗粒中，在凝胶中，在乳剂中，或者在浆糊中。此 形式对于技术人员是公知的。当应用固体洗涤剂组合物时，纤维素酶 被优选地制备为颗粒。优选地，颗粒可以被配制，以致于附加地含有 纤维素酶保护剂。颗粒可以被配制，以致于含有物质以降低颗粒进入 洗涤液的溶解速度。这样的物质和颗粒在美国专利5,254,283中有所描 述，其在此以整体并入，作为参考。 用于本发明洗涤剂组合物的合适的阴离子表面活性剂包括， 线性的或者分支的烷基苯磺酸盐；具有线性或分支烷基基团或者烯基 基团的烷基或烯基醚硫酸盐；垸基或烯基硫酸盐；烯烃磺酸盐；和烷 基磺酸盐。阴离子表面活性剂的合适的平衡离子包括，碱金属离子如 钠和钾；碱土金属离子如钙和镁；胺离子，和具有碳原子数2或3的 1至3个烷醇基团的链烷醇胺。兼性表面活性剂包括季铵磺酸盐和甜 菜碱型兼性表面活性剂。这样的兼性表面活性剂在同一分子中既有正 电荷基团又有负电荷基团。非离子型表面活性剂通常包括聚乙二醇， 以及更高级的脂肪酸链烷醇酰胺或者其氧化烯加合物，脂肪酸甘油单 酯，和类似物质。英国专利申请号2094826A中公开了用于本发明的 合适的表面活性剂，该公开在此并入，作为参考。也可以应用这些表 面活性剂的混合物。表面活性剂或者表面活性剂的混合物在本发明洗 涤剂组合物中应用的量通常是，占总洗涤剂组合物的从大约1重量百 分比至大约95重量百分比，和优选地，占总洗涤剂组合物的从大约5 重量百分比至大约45重量百分比。除了纤维素酶组合物和表面活性 剂，本发明的洗涤剂组合物可以任选地包括下列成分中的一种或者多种
除纤维素酶之外的水解酶 [110]合适的水解酶包括，作用于酯键的羧酸酯水解酶，硫酯水解 酶，磷酸单酯水解酶，和磷酸二酯水解；作用于糖基化合物的糖苷水 解酶；水解N-糖基化合物的酶；作用于醚键的硫醚水解酶；和作用于 肽键的氨基-酰基-肽水解酶，肽-氨基酸水解酶，酰基-氨基酸水解酶， 二肽水解酶，和肽基-肽水解酶。在它们之中，优选的是羧酸酯水解酶， 糖苷水解酶，和肽基-肽水解酶。合适的水解酶包括(1)属于肽基-肽 水解酶的蛋白酶，如胃蛋白酶，胃蛋白酶B，凝乳酶，胰蛋白酶，木 瓜凝乳蛋白酶，无花果蛋白酶，凝血酶，纤维蛋白溶酶，肾素，枯草 木干菌蛋白酉每，aspergillopeptidase A，胶原酶，clostridiopeptidase B，、激 肽释放酶，gastrisin，组织蛋白酶D，菠萝蛋白酶，角蛋白酶，糜蛋 白酶C，胃蛋白酶C， aspergillopeptidase B，尿激酶，羧肽酶A和B， 和氨基肽酶；(2)糖苷水解酶(是其基本成分的纤维素酶从此组中被排 除)a-淀粉酶，/3-淀粉酶，葡糖淀粉酶，转化酶，溶菌酶，果胶酶，几 丁质酶和葡聚糖酶。在它们之中，优选的是a-淀粉酶和/5-淀粉酶。它 们作用于酸性至中性体系中，但是，从细菌获得的酶在碱性体系中显 示了高度活性；(3)羧酸酯水解酶包括羧基酯酶，脂肪酶，果胶酯酶， 和叶绿素酶。在它们之中，特别有效的是脂肪酶。 [111] 根据用途，将除纤维素酶之外的水解酶如所需要地加入洗涤 剂组合物中。优选地，它将以0.001至5重量百分比，和更优选地， 以0.02至3重量百分比的量被并入，这是对纯化的蛋白而言的。酶应 用的形式应该是颗粒，颗粒单独由粗制酶制成，或者是与洗涤剂组合 物中的其它成分联合制成。粗制酶颗粒是以这样的量被应用的，纯化 的酶在颗粒中占0.001至50的重量百分比。颗粒被应用的量是0.002 至20重量百分比，和优选地是0.1至10重量百分比。关于纤维素酶， 这些颗粒可以被配制，以致于包含酶保护剂和溶解延缓物质。
阳离子表面活性剂和长链脂肪酸盐 这样的阳离子表面活性剂和长链脂肪酸盐包括饱和的或不 饱和的脂肪酸盐，垸基或烯基醚羧酸盐，a-磺基脂肪酸盐或酯，氨基 酸-型表面活性剂，磷酸酯表面活性剂，季铵盐，包括那些具有3至4个垸基取代基和多达1个苄基取代的垸基取代基的季铵盐。英国专利
申请号2094826A中公开了合适的阳离子表面活性剂和长链脂肪酸盐， 其公开在此并入，作为参考。组合物可以含有从大约1至大约20重量 百分比的这样的阳离子表面活性剂和长链脂肪酸盐。 助洗剂
A. 二价螯合剂 组合物可以含有从大约0至大约50重量百分比的一种或者 多种助洗剂组分(builder components),该组分选自下列化合物的碱金 属盐和链烷醇胺盐磷酸盐，膦酸盐，膦酰基羧酸盐，氨基酸盐，氨 基聚乙酸盐高分子电解质，非解离聚合物，二羧酸盐，和铝硅酸盐。 英国专利申请号2094826A中公开了合适的二价螯合剂，其公开在此 并入，作为参考。
B. 碱性电解质或者无机电解质 组合物可以含有从大约1至大约50的重量百分比，优选地， 从大约5至大约30的重量百分比，这基于将下列化合物的一种或者多 种的碱金属盐的组合物作为碱性电解质或者无机电解质硅酸盐，碳 酸盐和硫酸盐以及有机碱如三乙醇胺，二乙醇胺，单乙醇胺和三异丙 醇胺。
抗再沉积剂 组合物可以含有从大约0.1至大约5重量百分比的作为抗再 沉积剂的下列化合物中的一种或者多种聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙 烯吡咯烷酮和羧甲基纤维素。 在它们之中，羧甲基纤维素和/或聚乙二醇与本发明的纤维素 酶的联合，提供了特别有用的去污组合物。 漂白剂 本发明的纤维素酶与漂白剂联合应用，进一步改进洗涤效 果，所述漂白剂如单过硫酸钾，过碳酸钠，过硼酸钠，硫酸钠/过氧化 氢加合物和氯化钠/过氧化氢加合物或者/和光敏漂白染料如磺化肽菁 的锌或铝盐。相似地，可以应用如欧洲专利684 304中描述的漂白剂 和漂白催化剂。
上蓝剂(BluingAgents)和荧光染料[118] 如果需要，各种上蓝剂和荧光染料可以被并入本组合物。英 国专利申请2 094 826A号中公开了合适的上蓝剂和荧光染料，其公开 在此并入，作为参考。 结块抑制剂 下列结块抑制剂可以被并入粉末状洗涤剂对甲苯磺酸盐， 二甲苯磺酸盐，醋酸盐，磺基琥珀酸盐，云母，细磨的二氧化硅，粘 土，硅酸钙(如Micro-Cell of Johns Manville Co.)，碳酸钙和氧化镁。 抗氧化剂 抗氧化剂包括，例如，叔丁基羟基甲苯，4，4，-亚丁基双(6-叔_丁基_3_甲基苯酚)，2,2，-亚丁基双(6-叔-丁基-4-甲基苯酚)，单苯 乙烯化甲酚，联苯乙烯化甲酚，单苯乙烯化苯酚，联苯乙烯化苯酚和 1,1-双(4-羟基-苯酚)环己烷。 增溶剂 增溶剂包括，例如，低级醇如乙醇，苯磺酸盐，低级烷基苯 磺酸盐如对甲苯磺酸盐，二元醇如丙二醇，苯乙酮-磺酸盐，乙酰胺， 吡啶二羧酸酰胺，苯甲酸盐和尿素。 本发明的洗涤剂组合物可以被用在从酸性至碱性pH的宽的 pH范围内。在一种优选的实施方案中，本发明的洗涤剂组合物可以被 用在pH值从高于5至不大于大约12的微酸、中性、或者碱性洗涤剂 清洗介质中。 除了上述成分，如果需要，可以在本发明的洗涤剂组合物中 应用香料，缓冲液，防腐剂，染料和类似物质。这些成分可以方便地 以迄今为止在本领域中所应用的量被使用。 当本发明中应用的洗涤剂的基本成分是粉末形式时，它可以 是经任意已知的制备方法而制备的物质，这包括喷雾干燥法和制粒法。 特别是经喷雾干燥法，凝聚法，干燥混合法或非-塔式路线方法 (non-tower route methods)获得的洗涤剂基本成分，是优选的。由喷 雾干燥法得到的洗涤剂基本成分不受制备条件所限制。由喷雾干燥法 得到的洗漆剂基本成分是中空的颗粒，这是通过喷射耐热成分的水性 浆液，如表面活性剂和助洗剂，进入热的空间而实现的。喷雾干燥之 后，可以加入香料，酶，漂白剂，无机碱性助洗剂。通过如喷雾-干燥-制粒法或者凝聚法得到高密度的颗粒洗涤剂基本成分，在制备基本成 分后，也可以加入各种成分。
当洗涤剂基本成分是液体时，它可以是均一的溶液或者非均
一的分散体。为了通过洗涤剂中的纤维素酶去除羧甲基纤维素的分解， 在并入组合物之前，需要将羧甲基纤维素颗粒化或者包被。 本发明的洗涤剂组合物可以和含纤维素织物，例如，污染的 织物孵育，用在工业用途或者家用中，采用的温度，反应时间和液体 比例是在这些环境中可以方便采用的条件。 根据本发明的洗涤剂可以被附加地配制为预洗，配制是在合 适的溶液，在中间pH下进行的，在此情况下，有足够的活性，以提 供所需的改进软化，去球，防起球，表面纤维去除或者清洁作用。当 洗涤剂组合物是预浸泡(例如，预洗或者预处理)组合物时，或是作 为液体，喷雾剂，凝胶或是作为浆糊组合物，应用的纤维素酶通常是， 基于预浸泡或者预处理组合物总重量的从大约0.0001至大约1的重量 百分比。在这种组合物中，任选地应用表面活性剂，并且应用时，其 存在的浓度通常是，基于预浸泡总重量的从大约0.005至大约20的重 量百分比。该组合物的剩余物含有预浸泡中应用的传统成分，即，稀 释剂，缓冲液，其它的酶(蛋白酶)，和类似物质，应用的浓度是传统 的浓度。 预期了，可以将含有此处描述的纤维素酶的组合物，作为适 于恢复褪色织物颜色的独立组合物，用于家用(参见，例如，美国专 利4,738,682号，其在此以整体并入，作为参考)以及用在除斑剂中和 用于去球和抗起球(防起球)。
根据本发明的纤维素酶的应用，在饲料添加剂和纸浆及纸的
处理中，是特别有效的。在例如PCT出版物95/16360号和芬兰的授
权专利87372号中分别描述了这些其它工业应用。
为了进一步阐述本发明及其优势，给出下面的具体实施例，
需理解，提供它们是为了说明本发明，而不应该以任何方式被解释为
对发明范围的限制。
实施例[131] 下面的实施例是提供用来例证的，而不是要限制所要求保护 的发明。
实施例1 样品收集和处理 本实施例例证了如何收集样品及处理样品，以得到足够的 DNA，以创建cDNA文库。 用安装在可弯曲可伸长的lm竿末端的250ml不锈钢烧杯， 从肯尼亚的Sonachi (Crater)湖的沿岸收集水样品(250ml),并放置在 可密封的塑料容器内(WhMpak)，用于在室温下运输至实验室。表面水 温是28。C， pH是lO，电导率是7.23mScm"(在27。C时)。 [134] 为了收集微生物菌丛，将来自肯尼亚的Sonachi (Crater)湖 的水样品(750ml)通过一系列无菌膜滤器(47mm直径)原位过滤(用 手动真空泵)，直至水流停止，其中无菌膜滤器由硝酸纤维素或者醋酸 纤维素组成，孔的大小逐渐降低。滤器的顺序是8/mi， 3][mi和0.22Mm。 将分别的膜滤器立即放置在10ml冷的无菌细胞稳定缓冲液中(TES)， 缓冲液含有10mM Tris HCl，pH为8.0; 1 mM EDTA禾卩5% w/v的NaCl， 在30ml的无菌塑料普通试管中，并在冷冻的冷箱中冰上保存，直至 它们被进一步处理，这通常是在取样的4小时之内。通过与无菌的玻 璃珠(5ml)混合，剧烈漩涡振荡，分散滤器中的微生物物质，并通 过13,000g离心5分钟，将微量离心管中的细胞沉淀下来。将微生物 物质等分至微量离心管中，体积估计为含有相等的108至109细菌细 胞，总共得到12管。用GenomicPrepTM Cells and Tissue DNAisolation kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)，按照制造商的 指导，提取DNA。将每一试管中的DNA重悬浮于提供的细胞裂解液 600W中，并在8(TC孵育5分钟以裂解细胞。经此方法制备的样品在 室温中稳定至少18个月，并以此形式被运送回实验室。按照制造商的 方案，经RNA酶A处理，蛋白沉淀和DNA的异丙醇沉淀，完成DNA 提取。将每一 DNA溶解在10mM， pH 8.5的无菌Tris缓冲液 中。
通过在0.5w/v的琼脂糖凝胶上跑5^1样品，并与已知量的细菌基因组DNA相比较，估计DNA的产量。收集样品，总共得到200 DNA。由于产量低，用从水样品提取的大约30%的额外物质补充 该物质，所述水样品是与原位物质同时收集的并在实验室4"C保存直 至被需要。DNA的这些量，大约30pg，是初步实验显示的所需的起 始物质的量，以进行实验和大批限制性消化和按大小的分级分离，以 得到足够的物质用于文库构建。
实施例2 文库构建 下面的实施例详细描述了如何制备DNA文库，用于在大肠 杆菌中筛选并检测新的序列。 DNA的制备 将收集的DNA用于构建基因组DNA文库。用^"3A1部分 消化纯化的DNA，得到的平均片段长度是大约5kb。通过在TAE (0.04M Tris-醋酸盐，0,001 M EDTA pH 8.0)的0.5%琼脂糖凝胶中电 泳，将限制酶切的DNA以其大小分级分离。切取1.5至10kb范围的 物质，并置于在琼脂糖凝胶的未使用部分中切取的相同大小的孔中， 通过反向电流浓縮为窄的条带。切取DNA条带，并根据制造商的指 示，用凝胶提取试剂盒QIAGEN (Crawley, UK) QIAEXII gel extraction kit提取DNA。用乙醇沉淀洗脱的DNA，并将DNA重悬浮在pH8.5 的10mM Tris HC1缓冲液中。 X文库的制备 按照制造商的方案，用载体试剂盒ZAP-ExpressTM vector kit (用BamHl预先消化并用碱性磷酸酶处理)和Gigapak III Gold packaging extract (Stratagene, Amsterdam, The Netherlands), ^l每限第!l酶切 的DNA克隆入X载体。如每一方案，通过将含有 5x104 pfli的等分 试样和宿主大肠杆菌株XL1-Blue MRP铺板在150 mm佩氏培养皿上 并在缓冲液中洗脱噬菌体，扩增初级文库。在液氮中冷冻之后，将扩 增的文库于-8(TC保存在7% v/v的二甲基亚砜中。原始的总滴定度是 1.8xl06pfU，扩增之后为6.8xl()9pflimr1。 文库质量的评定[139] 如制造商所描述，用辅助噬菌体ExAssist helper phage (Stratagene)从XZAP文库提取噬菌粒载体pBK-CMV，并将其用于转染 大肠杆菌菌株XLOLR。通过在含有50jiig ml—1卡那霉素的Luria-Bertani (LB)琼脂上铺板，将含质粒的克隆分离出来。在Xgal[5-溴-4-氯-3-吲 哚-Z3-D-半乳糖苷]和IPTG[异丙基硫代-]S-D-半乳糖苷]存在下，用蓝白 斑筛选确定克隆有效性。如果没有DNA被克隆入X载体，在诱导剂 IPTG存在下，]8-半乳糖苷基因被表达，导致底物类似物Xgal切割， 在菌落中产生蓝色色彩。然而，如果基因组DNA的片段已被成功克 隆入入载体，它破坏了/3-半乳糖苷基因的表达，因此不生成酶，菌落 保持白色。因此，可以用蓝白菌落的比例来计算含有插入序列的克隆 的百分数。对于本文库，蓝白斑筛选得到的比例是，7个蓝色菌落对 286个白色菌落，这提示97%的克隆含有基因组DNA的插入片段。 随机选取24个菌落，并用Wizard@Plus SV Miniprep DNA purification system (Promega UK, Southampton)制备质粒DNA。用BamHl克隆位 点侧翼的Pstl和HindIII进行限制性内切酶分析，随后用琼脂糖凝胶电 泳确定插入片段长度。24个克隆中，有1个克隆未发现可检测的插入 片段。其余的克隆含有从1.5kb至8.0kb范围的插入片段。实施例3 对文库筛选纤维素酶 [140] 用在大肠杆菌克隆中的平板分析，筛选pBK-CMV噬菌粒中 DNA文库的纤维素酶活性。为了检测纤维素酶活性，将基因组文库铺 板于含卡那霉素，0.5Xw/v羧甲基纤维素(低粘度钠盐；Sigma，Poole, UK)和IPTG的LB琼脂上(在7cm直径的佩氏培养皿中，将1.5/d 0.5M 溶液，铺在琼脂表面上)。37。C过夜生长后，用随后被冷却至50。C的 溶解于水的3ml熔化的0.7X w/v琼脂糖，覆盖菌落。凝固之后，用 0.1 %w/v刚果红溶液充满平板30分钟，随后用1M氯化钠清洗2次。 显示细胞外纤维素酶活性的阳性克隆被黄色的卤素包绕，这与红色的 背景相对(R. Teather and R J. Wood, Applied & Environmental Microbiology, 43: 770-780,1982)。[141] 对110,000个大肠杆菌pBK-CMV进行筛选，产生4个清楚表明了潜在的产纤维素酶菌落的区。在匀浆取自透明区的圆柱状琼脂 样本，对单一的菌落种菌划线并通过刚果红实验证实表现型之后，这之中的3个区成功地被恢复为产纤维素酶克隆。实施例4纤维素酶阳性克隆的评定[142] 从这些纤维素酶阳性克隆中分离质粒DNA，如上所描述通 过限制性消化确定插入片段的大小。如凝胶电泳所确定，全部三个质 粒具有相同大小(大约3.5kb)并在消化后具有相同大小的片段。这提 示，所有三个分离物是一致的，是通过单一克隆的扩增而得到的。这 被质粒DNA的第一轮测序(用pBKCMV质粒中的引物位点)所证实。 这是由莱斯特大学(Leicester University)的蛋白和核酸化学实验室 (Protein and Nucleic Acid Chemistry Laboratory)应用Perkin Elmer 'BigDye， terminator chemistry和377型ABI自动化DNA测序仪来实施 的。序列的完全覆盖是通过从插入片段的5'和3'末端的'引物步移' 而f寻至[J的。用Applied Biosystems multisequence editor SeqedTM version 1.0.3编辑该序列。用可以从莱斯特大学(the University of Leicester) 得到的GCG Wisconsin Package, version 10.2-UNIX中的程序汇编该序 列。这鉴定到了含有4205个核苷酸碱基的环境DNA插入片段(图1)。实施例5 纤维素酶基因的鉴定 [143] 用MapDraw程序的ORF査找工具(DNASTAR， Brighton, MA: USA)或者来自Vector NTI Suite程序中的ORF搜索(InforMax私North Bethesda， MD， USA)，鉴定克隆BagCel中的插入环境DNA的核苷酸 序列中的可能的开放阅读框(OpenReading Frames, (ORF))。 [144] 这鉴定了由对应于含570个氨基酸的蛋白的1713个核苷酸 组成的ORF,从插入序列的1532位处起始并在3244位处结束。用 EditSeq (DNASTAR)切除此ORF，并通过BLAST程序检测。 [145] 图2显示了此ORF的核苷酸序列。[146] 用BLASTn程序检测核苷酸序列，BLASTn程序在非冗余核苷酸序列数据库(non-redundant sequence data)中比较了核酸査询序 列，提示与耐盐芽孢杆菌(5^7/ws/m/o^ra"s)基因组的一部分具有 同一性。 用BLASTx程序检测核苷酸序列，它在蛋白序列库中比较了 核酸查询序列(两条链)的六框架概念的翻译产物(six-frame conceptual translation products),提示与许多细菌内切纤维素酶具有显著的相似 性。最高联配分数揭示了与兼性嗜碱性细菌SflCz7/附/w/o^ra"s株 C125的内切-/3-1,4-葡聚糖酶(纤维素酶B)的154个氨基酸区有66 %的同一性(103个氨基酸)，所述株C125的内切-/3-1，4-葡聚糖酶含 有574个氨基酸(蛋白标号BAB04322，编号AP001509)。此新鉴定 的基因编码570个氨基酸的蛋白，与耐盐芽孢杆菌纤维素酶有66%同 一性。
图3显示了由570个氨基酸组成的翻译蛋白。
实施例6 酶特征分析
盐的影响 在5ml缓冲液(20 mM TRIS-HC1, pH8.0; 500mMNaCl; 0.1 mM EDTA; 0.1% Triton X-100)中悬浮含BagCel基因的大肠杆菌 pBK-CMV细胞，并在冰上经超声降解破裂。在不同的NaCl浓度下， 在羧甲基纤维素(CMC)上经琼脂扩散分析，测定超声降解的提取物。 超声降解提取物(100/d)并将10倍稀释物中的一份置于在CMC-琼 脂板中打孔的孔中，所述琼脂板含有不同量的NaCl。在37'C下孵育 板16小时，以毫米测定得到的提示纤维素水解的透明区。纤维素酶 BagCel在0-25 % w/v NaCl范围内是有活性的，尽管在25 % w/v NaCl 时的活性仅为0% w/vNaCl时活性的大约50Q/^。
pH的影响 用Grant & Tindall描述的pH-梯度板方法，研究pH对纤维 素酶活性的影响(Isolation of alkaliphilic bacteria, In : Microbial Growth and Survival in Extreme Environments, Academic Press, London, 1980,pp. 27-36)。将含有CMC的琼脂培养基倒入正方形的替氏培养皿中lcm 深，并使其凝固。从板的边缘切取lcm宽的统一的槽，将含有20% w/v Na2CO3.10H2O和0.2 M NaOH (通过在6(TC混合等量的无菌0.4 M NaOH/40% w/v Na2CO3.10H2O和4% w/v琼脂制备)的琼脂倒入槽内。 使板在37t:生长过夜，以允许形成从pH12至pH17的均一梯度。为 了检测BagCel纤维素酶的pH耐受性，以合适的角度穿过(琼脂)梯 度切取窄的槽，至原来的槽，并用lml超声降解破裂的细胞提取物充 满。使板在37〔放置过夜。用刚果红处理板30分钟，以看见纤维素 水解区。BagCel纤维素酶在达到大约pH 11.5时是有活性的。 [151] 应该理解，此处描述的实施例和实施方案仅是为了说明的目 的，基于它的各种修改或变化将被提示给本领域的技术人员，并包含 在本申请的精神和视界内以及待审的权利要求范围内。此处引用的所 有出版物、专利和专利申请以其整体在此并入作为参考，用于各个论 题。
权利要求
1.分离的多核苷酸，选自下列(a)核酸序列，其与如SEQ ID NO1显示序列具有至少85％的序列同一性，或者其互补序列；(b)核酸序列，其编码或者互补于编码BagCel的多肽的序列，所述多肽与图3(SEQ ID NO3)显示的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性；(c)核酸序列，其编码或者互补于编码BagCel的多肽的序列，所述多肽与图3(SEQ ID NO3)显示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性；(d)核酸序列，其编码或者互补于编码BagCel的多肽的序列，所述多肽与图3(SEQ ID NO3)显示的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；(e)核酸序列，其编码或者互补于编码BagCel的多肽的序列，所述多肽具有图3(SEQ ID NO3)显示的氨基酸序列；其中所述分离的多核苷酸编码具有纤维素酶生物学活性的多肽，并且其中的同一性是通过MacVector版本6.5中的CLUSTAL-W程序被确定的，采用缺省参数操作，包括空位开放罚分为10.0，和空位延伸罚分为0.1，和BLOSUM 30相似性矩阵。
2. 分离的多核苷酸，选自下列(a) 显示为SEQIDNO:l的核酸序列，或者其互补序列；(b) 在高度严紧的条件下，与显示为SEQIDNO:l的序列杂交的 核酸序列，或者其互补序列或其片段；(c) 显示为SEQIDNO:2的核酸序列，或者其互补序列；禾口(d) 在高度严紧的条件下，与显示为SEQIDNO:2的序列杂交的 核酸序列，或者其互补序列或其片段；其中所述分离的核苷酸编码具有纤维素酶生物学活性的多肽， 并且其中杂交是在42'C下，在50%甲酰胺，6 X SSC， 5 X Denhardt's 溶液，0.5% SDS和100 pg/ml变性的载体DNA中进行的，随后在2 X SSPE和0.5% SDS在室温中洗涤2次，并在0.1 SSPE和0.5% SDS在42"C下再洗涤2次。
3. 权利要求1所述的分离的核苷酸，其中所述核苷酸选自mRNA， DNA， cDNA，基因组DNA，及其反义类似物。
4. 权利要求3所述的分离的核苷酸，其中所述核苷酸是RNA分子。
5. 权利要求1所述的分离的核苷酸，编码具有纤维素酶活性的酶， 其中所述的酶是从木霉来源被分离的。
6. 权利要求5所述的分离的核苷酸，其中所述的酶是从瑞氏木霉 被分离的。
7. 表达构建物，包括编码氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基 酸序列具有纤维素酶活性，并且(i )与SEQ ID NO : 3显示的氨基酸 序列具有至少85%的序列同一性；或者(ii)在中度至高度严紧的条 件下，能够与探针杂交，所述探针被设计为，与图2所公开的核苷酸 序列杂交，或者(iii)与核苷酸序列互补，所述核苷酸序列与编码SEQ ID NO : 3显示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少85%的同一性，其 中同一性是通过Mac Vector版本6.5中的CLUSTAL-W程序被确定的， 采用缺省参数操作，包括空位开放罚分为10.0，和空位延伸罚分为0.1， 和BLOSUM 30相似性矩阵。
8. 表达载体，包括权利要求1的多核苷酸。
9. 表达载体，包括权利要求1的分离的多核苷酸，有效连接于被 宿主细胞识别的调控序列，所述宿主细胞是用所述载体转化的。
10. 根据权利要求9所述的表达载体，包括调节多核苷酸序列，其 包括来自游动放线菌""—/a,w)的葡萄糖异构酶基因的启动子序列， 来自链霉菌(&r^tom^")纤维素酶基因的信号序列，和编码纤维素酶BagCd的多核苷酸序列。
11. 表达载体，含有权利要求8所述的表达构建物。
12. 宿主细胞，是经权利要求8所述的载体转化的。
13. 权利要求12所述的宿主细胞，其为原核细胞。
14. 权利要求12所述的宿主细胞，其为真核细胞。
15. 大体上纯化的BagCd多肽，具有纤维素酶活性，包括选自下列 的序列(a) 与图3 (SEQIDNO:3)显示的氨基酸序列具有至少85%序 列同一性的氨基酸序列；(b) 与图3 (SEQIDNO:3)显示的氨基酸序列具有至少90%序 列同一性的氨基酸序列；(c) 与图3 (SEQIDNO:3)显示的氨基酸序列具有至少95%序 列同一性的氨基酸序列；(d) 图3 (SEQIDNO:3)显示的氨基酸序列；(e) 如SEQ ID NO : 3显示的氨基酸序列的大体上纯化的生物活 性片段；其中同一性是通过MacVector版本6.5的CLUSTAL-W程序被 确定的，采用缺省参数操作，包括空位开放罚分为10.0，和空位延 伸罚分为O.l，和BLOSUM30相似性矩阵。
16. 提供了大体上纯化的BagCd纤维素酶多肽或者衍生物，其可以 从杆菌(Sfld〃M)中得到。
17. 产生纤维素酶的方法，包括下列步骤(a) 在合适的条件下，合适的培养介质中，培养根据权利要求12 的宿主细胞，以生产纤维素酶；(b) 获得所述的生成的纤维素酶。
18. 权利要求17所述的方法，其中所述宿主细胞是丝状真菌或者酵 母细胞。
19. 权利要求17所述的方法，其中所述宿主细胞是细菌。
20. 权利要求17所述的方法，其中所述细菌是链霉菌。
21. 具有纤维素酶活性的纯化的酶，由权利要求n所述的方法制备。
22. 重组的宿主细胞，包括万flgCe/基因中的删除，插入或者其它改 变，其失活所述基因并且防止BagCel多肽产生。
23. 反义寡核苷酸，与编码BagCel多肽的信使RNA互补，所述多 肽具有SEQ ID NO : 3显示的氨基酸序列；其中当暴露于产纤维素 酶宿主细胞时，所述寡核苷酸降低或者抑制所述宿主细胞生成纤维 素酶。
24. 权利要求23的反义寡核苷酸，其中宿主细胞是丝状真菌。
25. 洗涤剂组合物，所述组合物包括选自下列的多肽(a) 与图3 (SEQIDNO:3)显示的氨基酸序列具有至少85%序 列同一性的氨基酸序列；(b) 与图3 (SEQIDNO:3)显示的氨基酸序列具有至少90%序 列同一性的氨基酸序列；(c) 与图3 (SEQIDNO:3)显示的氨基酸序列具有至少95%序 列同一性的氨基酸序列；(d) 图3SEQIDNO:3显示的氨基酸序列；(e) 如SEQ ID NO : 3显示的氨基酸序列的大体上纯化的生物活 性片段；其中同一性是通过MacVector版本6.5的CLUSTAL-W程序被 确定的，采用缺省参数操作，包括空位开放罚分为10.0，和空位延伸罚分为O.l，和BLOSUM30相似性矩阵。
26. 洗涤剂组合物，包括表面活性剂和根据权利要求15的纤维素酶。
27. 根据权利要求25所述的洗涤剂，其中所述洗涤剂是洗衣店洗涤剂。
28. 根据权利要求25所述的洗涤剂，其中所述洗涤剂是餐盘洗涤剂。
29. 饲料添加剂，包括根据权利要求15的纤维素酶。
30. 处理木浆的方法，包括用根据权利要求15所述的纤维素酶接触 所述木浆。
31. 将生物质转化为糖的方法，包括用根据权利要求15所述的纤维 素酶接触所述生物质。
32. 权利要求31所述的方法，进一步包括产生高果糖玉米浆。
33. 产生乙醇的方法，所述方法包括下列步骤(a) 用含BagCd的酶组合物接触生物材料组合物，以产生糖溶液;(b) 向糖溶液加入促发酵的微生物；和(c) 在足以生成乙醇的下，培养促发酵的微生物，
34. 鉴定新的纤维素酶的方法，包括(a) 从环境中分离总微生物群落DNA;(b) 在大肠杆菌(Eco//)中构建基因组DNA文库； (C)筛选文库中纤维素酶活性的表达；(d) 鉴定纤维素酶阳性克隆中的纤维素酶基因；和(e) 描述新的纤维素酶的特征。
全文摘要
本发明提供了被命名为BagCel的新颖纤维素酶核酸序列，和相应的BagCel氨基酸序列。本发明也提供了包括编码BagCel的核酸序列的表达载体和宿主细胞，重组的BagCel蛋白，以及制备它们的方法。
文档编号C11D3/386GK101300335SQ200480011114
公开日2008年11月5日 申请日期2004年4月28日 优先权日2003年4月30日
发明者B·E·琼斯, S·希普希, S·格兰特, W·D·格兰特 申请人:金克克国际有限公司