胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物传感器识别元件快速测定bod的方法

胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物传感器识别元件快速测定bod的方法
【专利摘要】本发明公开了属于生物传感器领域的以胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件快速测定BOD的方法。该方法包括选择胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件、制备胶原纤维固定化大肠杆菌生物识别元件的方法、利用胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件对BOD的快速测定方法，以及生物识别元件的保存和活化方法。本发明提供了一种用于微生物传感器的生物识别元件；这种识别元件具有传质性能好、稳定性强、微生物活性好等优点，其良好的传质性能使得传感器中固定微生物用量可适当增大而不影响微生物膜通透性，进而使得传感器具有较宽的线性响应范围和较高的灵敏度。本传感器对GGA标准液的线性响应范围为BOD50-600mg/L，线性相关系数大于0.999，响应时间为3-15min，微生物膜可连续使用200次以上，固定化微生物保存6个月经活化后仍保持良好性能。
【专利说明】胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物传感器识别元件快速测 定BOD的方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物传感器领域，提供了用于生化需氧量生物传感器的胶原纤维固定 化大肠杆菌生物识别元件的制备及其使用方法。

【背景技术】
[0002] 生化需氧量（Biochemical Oxygen Demand,B0D)是一项衡量水质污染程度的重要 指标，表示水中有机物经微生物生化作用分解时所消耗的溶解氧量。国内外测定B0D值的 传统方法是5日生化需氧量接种稀释法（B0D 5法），即样品在20± 1°C条件下培养5d，测定 样品培养前后的溶解氧，两者之差即为5日生化需氧量，但此法耗时耗力、重现性差且不宜 现场监测。近年来，微生物传感器法由于其测定时间短、操作简便、易于现场监测等优点而 被逐渐应用于B0D的检测。
[0003] B0D微生物传感器主要由固定化微生物、信号转换装置和信号输出装置组成，其中 固定化微生物对传感器的灵敏度、响应范围等性能均有重要影响。常见的微生物固定化载 体有聚乙烯醇、活性交联树脂、溶胶凝胶等，但这些载体大多传质性能及生物相容性较差， 使得由其制得的传感器普遍存在响应值较小、测量范围较窄、微生物利用率较低等问题。
[0004] 胶原纤维是一种天然高分子材料，金属离子锆（Zr)、铁（Fe)等改性后的胶原纤维 具有良好的传质性能、生物相容性、热稳定性、耐生物降解性及广泛的酸碱适应范围等优 点。将其作为微生物固定化载体制备微生物传感器，可较大程度增加固定微生物用量并保 持较高微生物利用率。
[0005] 大肠杆菌是一种易于培养、呼吸活性强、适应范围广的细菌，金属离子锆（Zr)改性 后的胶原纤维对大肠杆菌具有较大的固定量且能使其保持较稳定的活性。本专利以金属离 子锆（Zr)改性胶原纤维（ZICF)为载体固定大肠杆菌作为生物识别元件制备B0D微生物传 感器，基于ZICF良好的传质性能及生物相容性，本发明对传感器灵敏度、测量范围等性能 的提升有较大意义。


【发明内容】

[0006] 本发明的目的是提供一种以胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件快速测 定B0D的方法，其特征在于，该方法包括选择胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件， 制备胶原纤维固定化大肠杆菌生物识别元件的方法，利用胶原纤维固定化大肠杆菌作为生 物识别元件对B0D的快速测定方法，以及该固定化大肠杆菌的保存方法和该微生物敏感膜 的活化方法。
[0007] 所述胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件的原因如下： 1) 胶原纤维作为一种天然高分子材料，具有通透性好、耐曝气强度高、生物相容性好、 成本低廉、机械性能好、酸碱适应范围广等优点； 2) 经金属离子改性后的胶原纤维在保持胶原纤维原有优良性能的基础上，更具备了 良好的耐热性和耐生物降解性； 3) ZICF良好的传质性能使得传感器中固定微生物用量可适当增大，从而拓宽传感器的 线性响应范围，提升传感器的灵敏度； 4) 胶原纤维固定大肠杆菌具有固定量大、微生物活性高的特点，这些特点可使传感器 获得更宽的线性响应范围； 5) 胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件具有使用寿命长，识别元件保存和活化 方法简单的特点。
[0008] 所述金属离子锆（Zr)改性胶原纤维固定化载体（ZICF)由已有方法制备(发明专 利：胶原纤维固载金属离子吸附材料及其制备方法和用途，专利号 ：200410040145.0)。
[0009] 所述固定化大肠杆菌的制备方法：称取干重0. 5g ZICF置于无菌水中浸泡5_12h。 大肠杆菌在营养肉汤培养基中活化培养18_24h，经离心、无菌生理盐水清洗后收集细胞，将 其加入无菌生理盐水中制得菌悬液，并调节菌悬液浓度为10 7-10lclcfu/mL。将ZICF过滤后 加入上述菌悬液中，37°C震荡吸附5h后用无菌生理盐水清洗至无游离菌检出，即得胶原纤 维固定化大肠杆菌。
[0010] 所述生物识别元件的制备方法：每次称量湿重为〇. 10-0. 30g的胶原纤维固定化 大肠杆菌，将固定化大肠杆菌置于两层200目尼龙网之间，使之形成一层固定化微生物膜， 使用时将该膜紧贴于溶解氧电极头前的半透膜上，并用电极帽固定。
[0011] 所述利用胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件对B0D的快速测定方法：测 量时，将附有固定化大肠杆菌的溶解氧电极头置于盛有〇.〇7mol/L磷酸氢二钠、磷酸二氢 钾缓冲液（PBS缓冲液）的测量杯中，以24L/h的曝气强度对缓冲液进行曝气，测量温度为 36-37°C、pH为6-7 ;待溶解氧（D0)值稳定后加入含有机物的样品，固定化微生物分解有机 物导致水中D0值下降到另一个稳定值，求得前后两次D0值之差，通过标准曲线计算样品的 B0D 值。
[0012] 所述固定化大肠杆菌的保存方法：胶原纤维固定化大肠杆菌在pH为6-7的PBS缓 冲液中，4°C条件下密封保存。胶原纤维固定化大肠杆菌经本法保存6个月后仍具有良好 活性。
[0013] 所述固定化大肠杆菌的活化方法：将存于4°C条件下的固定化大肠杆菌在 36-37°C条件下于PBS缓冲液中放置24h ;组成B0D传感器后对一定浓度的葡萄糖谷氨酸 (GGA)溶液反复多次测定，D0下降值连续5次相对偏差小于5%，即完成固定化大肠杆菌的 活化。

【专利附图】

【附图说明】
[0014] 图1是B0D5为0-600mg/L范围的GGA溶液较典型的响应曲线。

【具体实施方式】
[0015] 实例1 :以本发明提出的胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件，对不同浓 度的GGA溶液的测定。
[0016] 分别配置 B0D5 浓度为 0、10、20、50、100、150、200、300、400、500、600、700mg/L 的 GGA溶液，用胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件与溶解氧电极结合组成B0D微生 物传感器，测定上述浓度的GGA溶液。测定条件为：温度36°C，pH=6,曝气强度24h/L，磁力 搅拌子转速使溶氧显示值在4-8mg/L。
[0017] 测定结果表明，DO下降值与样品BOD浓度之间具有良好的线性关系，在B0D5浓度 0-600mg/L范围内，线性相关系数大于0. 999,具有极好的测量精度。
[0018] 实例2 :以本发明提出的胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件，在36°C、pH 为6,曝气强度24L/h条件下对B0D5值为50mg/L、100mg/L、200 mg/L的GGA溶液进行测定， 测定传感器的结果重现性，结果如表1所示。
[0019] 如表1所示为传感器重现性测定结果

【权利要求】
1. 一种以胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件快速测定BOD的方法，其特征在 于，该方法包括选择胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件、制备胶原纤维固定化大 肠杆菌生物识别元件的工艺和利用胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件对B0D的 快速测定，以及该固定化大肠杆菌的保存方法和该微生物识别元件的活化方法。
2. 权力要求1所述以胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件快速测定B0D的方 法，其特征在于，所述的微生物固定化载体为金属离子锆（Zr)改性后的胶原纤维（ZICF)。
3. 权利要求1所述以胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件快速测定B0D的方 法，其特征在于，所述的固定化微生物种类为大肠杆菌（大肠埃希氏菌; )。
4. 权利要求1所述胶原纤维固定化大肠杆菌的制备：称取干重0.5g ZICF置于无菌水 中浸泡5-12h ;大肠杆菌在营养肉汤培养基中活化培养18-24h，经离心、无菌生理盐水清洗 后收集细胞于无菌生理盐水中制得菌悬液，并调节菌悬液浓度为10 7-101(lcfu/mL ;将ZICF 过滤后加入上述菌悬液中，37°C震荡吸附5h后用无菌生理盐水清洗至无游离菌检出，即得 胶原纤维固定化大肠杆菌。
5. 权利要求1所述胶原纤维固定化大肠杆菌生物识别元件的制备：每次称量湿重为 0. 10-0. 30g的胶原纤维固定化大肠杆菌，将固定化大肠杆菌置于两层200目尼龙网之间， 使之形成一层固定化微生物膜，使用时将该膜紧贴于溶解氧电极头前的半透膜上。
6. 权利要求1所述利用胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物敏感膜对B0D的快速测定： 测量时，将附有固定化大肠杆菌的溶解氧电极头置于盛有〇. 〇7mol/L磷酸氢二钠、磷酸二 氢钾缓冲液（PBS缓冲液）的测量杯中，通过微量曝气管以24L/h的曝气强度对缓冲液进行 曝气，测量温度为37°C、pH为7,待溶解氧（DO)值稳定后加入含有机物的样品溶液，固定化 微生物分解有机物导致水中DO值下降到另一个稳定值，求得前后两次DO值之差，通过标准 曲线计算所测水样的B0D值。
7. 权利要求1所述的胶原纤维固定化大肠杆菌的保存方法，其特征在于，胶原纤维固 定化大肠杆菌的保存条件为：〇. 〇7mol/L PBS缓冲液，pH=6-7,温度4°C。
8. 权利要求1所述的胶原纤维固定化大肠杆菌的活化方法，其特征在于，胶原纤维固 定化大肠杆菌的活化方法为：将存于4 °C条件下的固定化大肠杆菌在36-37 °C条件下于 原溶液中放置24h ;组成B0D传感器后对浓度为50-200 mg/L的葡萄糖谷氨酸（GGA)溶液多 次测定次，DO下降值连续5次相对偏差小于5%，即完成固定化大肠杆菌的活化。
【文档编号】G01N27/26GK104267082SQ201410537863
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月14日 优先权日:2014年10月14日
【发明者】不公告发明人 申请人:四川农业大学