一种护色纤维素酶及其突变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于功能基因筛选改造技术领域，具体涉及一种护色纤维素酶及其突变 体。
【背景技术】
[0002] 纤维素是世界上蕴藏量最丰富的天然高分子化合物，绝大多数由绿色植物通过光 合作用合成。微生物对纤维素的降解、转化是自然界中碳素转化的主要环节。纤维素酶是 降解纤维素生成葡萄糖的多组分酶的总称。目前，纤维素酶产品广泛应用于纺织、洗涤、饲 料、酿造、制药、造纸等行业，尤其是在洗涤行业的应用范围目前正在不断扩大。
[0003] 纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌和真菌等都能 产生纤维素酶。主要的是：康氏木霉、里氏木霉、黑曲霉、斜卧青霉、芽孢杆菌等。丝状真菌 产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物，而嗜碱细菌产生的纤维 素酶在碱性范围内起作用。
[0004] 碱性纤维酶的研宄比较晚，但发展得很快。日本学者对碱性纤维素酶进行了大量 的研宄。1970年，UNILIVER公司首先发现纤维素酶用于洗涤剂，可以使由于反复洗涤而发 黄变硬的棉纤维织品恢复原来的艳丽色彩和柔软，但当时在碱性范围内具有较高活性的纤 维素酶还没有实现工业化。1972年horikoshi报道发现了嗜碱芽孢杆菌No. N-l、N-2、N-3 和N-4能产生碱性纤维素酶，但酶活性很低。1974年日本东京工业大学研宄了奢碱性芽孢 杆菌N-l、N-4产的酶为分解代谢阻遏型。一直到1980年，N0V0公司发现了在碱性范围有较 高活性的腐植菌，通过液体发酵，成功地生产了洗涤剂用碱性纤维素酶，并很快得到应用。
[0005] 碱性纤维素酶在洗涤剂中的应用可以说是一项重要的发明。它不但具有优良的去 污除垢的能力，而且经多次使用后，仍可使棉织物柔软、增艳，使织物纹理清晰，翻旧如新。 织物经多次使用后，侵入棉单纤维结构内部的污垢越来越多，由于被纤维素分子与水形成 的凝胶所封闭，这种污垢是很难去除的，从而导致了棉织物的发黄、泛灰和变硬。而碱性纤 维素酶能作用于棉纤维内部的非结晶区域，使上述凝胶结构有效地软化，使其中的污垢较 容易地分离出来，从而可避免织物的发黄、泛灰和变硬。
[0006] 目前国内对于碱性纤维素酶的研宄还处于起步阶段，已产业化的护色效果显著的 碱性纤维素酶种类较少，且在产品性能和生产成本方面与国外同类产品的差距很大，远远 不能满足国内日益增长的市场需要。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种纤维素酶及其突变体，本发明通过对来源于特异腐质霉 (Humicola insolens)的纤维素酶进行蛋白质工程改造，获得了护色效果显著的突变体蛋 白。本发明的纤维素酶在碱性条件下的酶活力得到显著提高，且稳定性更好，不仅具有良好 的去污作用，还具有使纤维织物清洁、柔顺，且护色效果显著，可广泛应用于洗涤工业领域。
[0008] 申请人通过对特异腐质霉（Humicola insolens)的纤维素酶进行大量突变的筛 选，发现P23G、D67N、A69S、R158S这四个位点的突变，可使该纤维素酶的作用pH和稳定性 发生改变，并显著提升其护色效果，从而促成本发明。
[0009] 本发明一方面提供了一种纤维素酶，其氨基酸序列为SEQ ID N0 :1。
[0010] 所述纤维素酶的一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO :2。
[0011] 本发明另一方面提供了一种纤维素酶突变体，是氨基酸序列为SEQIDNO:1的纤 维素酶第23位氨基酸由Pro变为Gly，第67位氨基酸由Asp变为Asn，第69位氨基酸由Ala变为Ser，第158位氨基酸Arg变为Ser。
[0012] 上述纤维素酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO :3,其一种编码基因的核酸序列 为 SEQ ID N0 :4。
[0013] 本发明另一方面提供了携带有编码序列为SEQ ID NO :3的纤维素酶突变体基因的 质粒。
[0014] 本发明再一方面提供一种重组里氏木霉，是将上述质粒转入里氏木霉 (Trichodermareesei)中构建的。
[0015] 本发明还提供了上述纤维素酶突变体在洗涤剂中的应用。
[0016] 本发明提供的纤维素酶突变体在碱性条件下的适用范围更加宽泛，耐热性和稳定 性更突出。所述纤维素酶突变体的最适作用pH为6. 0,且在pH4. 5-8. 0范围内均能保持 60%以上的酶活，而野生型在pH4. 5-7. 5范围内仅能维持40%左右的酶活，至pH8.0时，酶 活降为20%。所述纤维素酶突变体在40°C水浴处理30天后，残留酶活高达88%，而野生型 的残留酶活仅为60%。与野生型相比，本发明所述纤维素酶突变体的护色效果得到显著提 升，取得了意料不到的技术效果。本发明所述纤维素酶突变体不仅具有良好的去污作用，还 具有使纤维织物清洁、柔顺，且护色效果显著，可广泛应用于洗涤工业领域。
【附图说明】
[0017] 图 1 为 SDS-PAGE 电泳图；
[0018] 其中M所示为蛋白Marker;泳道1为里氏木霉工程菌HIEGV发酵上清液中蛋白表 达情况，泳道2所示为里氏木霉工程菌MEGV发酵上清液中蛋白表达情况，箭头所指处为分 子量为40KDa的蛋白条带；
[0019] 图2为纤维素酶突变体与野生型相对酶活-pH曲线图；
[0020] 图3为纤维素酶突变体与野生型温度稳定性曲线图。
【具体实施方式】
[0021] 本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如 MOLECULARCL0NING:ALABORATORYMANUAL, 3ndEd. (Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文 献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。而且本发明不限定于实施例中记载的具体方 法、实验方案和试剂，还包括本领域的技术人员。
[0022] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细描述。
[0023] 实施例1 :纤维素酶突变体基因的合成
[0024] 为了提高纤维素酶（野生型氨基酸序列为SEQIDN0:1，编码核苷酸序列为SEQ ID NO :2,由上海生工生物工程股份有限公司合成）在偏碱性条件下的酶活力，通过定向进 化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计PCR引物HIEGV-F和HIEGV-R如下：
[0025] HIEGV-F ：AAAgaattcTATGCGTTCCTCCCCCCTC
[0026] HIEGV-R ：AAAgcggccgcCTACAGGCACTGATGGTAC
[0027] 以SEQ ID N0:2基因为模板，以上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒 (Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶 切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培 养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150 y L含有0.1 mM IPTG的 LB+Amp培养基，37°C 220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁， 获得含有纤维素酶的大肠杆菌细胞裂解液。
[0028] 分别取出50 y L裂解液至两块新的96孔板，分别在pH 6. 0和pH 8. 0的条件下测 定其纤维素酶活，结果发现，有些突变子在碱性条件下的酶活力没有变化，有些突变子的酶 活甚至降低了，对在pH 8. 0条件下依然保持高活性的突变子进行DNA测序，最终获得了能 显著提高纤维素酶在碱性条件下耐受性的突变位点组合P23G、D67N、A69S和R158S。
[0029] P23G、D67N、A69S和R158S四点突变的纤维素酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO :3,编码核苷酸序列为SEQ ID NO :4。SEQ ID NO :4由上海生工生物工程股份有限公司 合成完成，并且在合成序列5'和3'两端分别加上Kpnl和Mlul两个酶切位点。
[0030] 实施例2重组菌株的构建和筛选
[0031] 合成后的质粒用限制性内切酶Kpnl和Mlul (Fermentas)进行酶切；同时，用限制 性内切酶Kpnl和Mlul对载体pCIlG进行酶切；凝胶回收目的基因片段和载体；并用T4DNA 连接酶将上述两片段连接，转化DH5 a大肠杆菌，用氨苄青霉素进行筛选。为确保准确，对 若干克隆进行测序（Invitrogen)。
[0032] 使用质粒中量制备试剂盒（Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质 粒，将纤维素酶重组表达质粒命名为pCIG-MEGV。
[0033] 2. 1原生质体制备
[0034] 取纤维素酶基因缺陷型的宿主菌里氏木霉（Trichoderma reesei)孢子悬液，接 种于PDA平板上生长6天；切取直径约3cm的菌落置于约60mlYEG(0. 5%酵母粉、1 %葡萄 糖）的液体培养基中，30°C、200rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛 有10-20ml裂解酶液（Sigma L1412)酶解2-3小时；取出酶解液，加入0. 7M NaCl溶液，轻轻 摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000rpm，离心10min ;弃上清，加10-20ml STC 液（20%蔗