一种纤维素酶高效生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及发酵工程技术领域，具体设及一种纤维素酶生产方法。
【背景技术】
[0002] 纤维素酶来源广泛、成分复杂，广泛存在于昆虫体、软体动物体W及真菌、细菌与 放线菌等微生物的代谢产物中，主要生产途径是微生物发酵，其中W丝状真菌和细菌纤维 素酶应用最为广泛，目前主要还是利用真菌来发酵产纤维素酶。
[0003] 在细菌中大多数好氧细菌和厌氧细菌都富含丰富的纤维素酶系，特别是瘤胃中富 含多种纤维素降解酶系的厌氧菌。世界纤维素市场中的纤维素酶有20 %来自木霉属和曲 霉属。主要是由于丝状真菌具有产酶的诸多优点：①产生的纤维素酶为胞外酶，便于酶的分 离和提取；②产酶效率高，且产生纤维素酶的酶系结构较为合理；③同时可产生许多半纤 维素酶、果胶酶、淀粉酶等。纤维素酶是一个复合酶系，酶系由Ξ类功能不同但又互补的酶 组成。运Ξ类酶分别是内切葡聚糖酶巧G，Cx酶，又称CMC酶）、外切葡聚糖酶（纤维二糖 水解酶，CBH，C1酶）和β-葡萄糖巧酶度化，纤维二糖酶）；大多数编码纤维素酶的基因是 染色体基因。纤维素酶系降解原理目前尚无定论，主要有Ξ种作用机理：协同理论、碎片假 说和原初反应假说，其中W协同理论被大部分研究学者和专家所认可，其主要观点为内切 葡聚糖运类酶首先作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1，4-糖巧键， 将长链纤维素分子截断，产生大量非还原性末端。然后外切葡聚糖酶逐个切下纤维素的非 还原末端水解产生纤维二糖；而β-葡萄糖巧酶则水解纤维二糖生成葡萄糖。Ξ者缺一不 可，协同作用，也只有在合适的比例和组成下，才能共同作用快速实现纤维素的完全水解。
[0004] 纤维素酶发酵过程容易受到碳水阻遏效应（CCR)对酶发酵合成的影响，即在半纤 维素和/或纤维素酶合成过程中，往往由于培养基中存在着葡萄糖、木糖等单糖而通过碳 水阻遏效应（CCR)抑制了酶的合成。目前常用选育方法消除部分CCR效应，例如，周广麟等 人先后研究了去泛素化蛋白酶基因creB缺失及转录调控基因bglR缺失对生产菌株生长状 态及形态、纤维素酶活力、纤维素酶性质的影响。creB基因缺失突变株纤维素酶表达分泌抗 葡萄糖代谢阻遏效应，菌株的滤纸酶活、内切纤维素酶活、木聚糖酶活W及外切纤维素酶活 分别提高1. 8倍、1. 71倍、2. 06倍化及2. 04倍，其胞外蛋白质含量提高了 2. 68倍；而bglR 基因为转录调控因子的缺失，β葡萄糖巧酶酶活力得到大幅度提高，提高了 40%，但滤纸 酶活、内切葡聚糖酶及木聚糖酶活明显降低。现有技术虽然取得了一定成效，但如何解决纤 维素酶发酵过程碳水阻遏效应（CCR)、提高纤维素生产能力，仍是本领域技术人员面临的主 要问题。
【发明内容】
[0005] 为解决上述现有技术中存在的问题，发明人通过研究发现，草酸青霉发酵生产纤 维素酶的过程中，补料、DO、抑等发酵条件与纤维素酶表达量密切相关，通过补料、DO、抑等 工艺实现了纤维素的表达量和胞外蛋白的表达量的大幅度增加；进一步的，通过研究发现， 补料过程中，菌株的代谢与摄氧率极为相关，通过OUR控制可W解除补料过程的碳阻遏效 应，控制0UR维持在一定水平维持菌株正常生长代谢来增强次级产物纤维素酶的产生，可 W明显提高生产纤维素酶的FPA、β葡萄糖巧酶活力和蛋白含量。
[0006] 具体的，本发明提供了W下技术方案：
[0007] -种草酸青霉液态发酵生产纤维素酶的方法，其特征在于，控制整个发酵期间抑 维持在3. 5~6. 0之间，发酵中后期至发酵结束期间进行补料培养，期间控制摄氧率（0UR) 维持 12(±5)~35(±5)mmol/L/h。
[0008] 本领域技术人员应当明了草酸青霉发酵生产纤维素酶中进入发酵中后期的时间， 此时葡萄糖消耗，碳阻遏效应解除，纤维素酶开始合成，优选，发酵24h至发酵结束期间进 行补料培养。
[0009] 优选的，补料培养过程中，0UR与溶氧、补料Ξ者变量关系，溶氧与补料呈协同互 补关系，0UR与溶氧具有一定的比例关系，通过更换奖叶，调节揽拌转速保持溶氧在15%W 上。
[0010] 优选的，补料培养期间控制摄氧率（0UR)维持15(±5)~30(±5)mmol/L/h。
[0011] 优选的，发酵过程抑调节为：发酵开始抑调整为5. 5-6.0,0-20h抑逐渐下降， 用氨水控制发酵培养基抑3. 5W上，50-6化后抑回升至5. 5-6. 0后，开始用憐酸调节抑至 6. 0W下；
[0012] 优选的，发酵过程进行通气量控制，每分钟通气量：发酵体积> 1:1 ;
[0013] 优选的，发酵过程调节溶氧，发酵起始溶氧调整至100%，发酵过程中通过调节揽 拌转速保持溶氧在15 %W上；
[0014] 优选的，整个发酵过程溫度保持28~33°C;
[0015] 更为优选的，将草酸青霉划线接种于教皮培养基中28~32°C培养3-5天，待长出 粉红色的抱子后转接至新鲜教皮培养基培养3天作为菌种。接0. 2-20cm2菌种接种于种子 培养基中，28~32°C20化pm发酵24~4她，制备成一级种子，按照5%~10%的接种量接 种一级种子于种子培养基中，28~32°C20化pm培养30~4化制成二级种子，然后将二级 种子接种于产酶培养基进行产酶发酵。产酶发酵具体参数控制如下：
[0016] (1)抑调节：发酵开始抑调整为5.5-6.0,0-20h抑逐渐下降，用氨水控制发酵 培养基抑3. 5W上，50-6化后抑回升至5. 5-6. 0后，开始用憐酸调节抑至6. 0W下；
[0017] (2)通气量控制：每分钟通气量：发酵体积> 1:1 ;
[0018] (3)溶氧调节：发酵起始溶氧调整至100%，发酵过程中通过调节揽拌转速保持溶 氧在15%W上；
[0019] (4)溫度调控：整个发酵过程溫度保持28~33°C;
[0020] (5)OUR调节：
[0021] 发酵开始，OUR随菌体浓度增加而逐渐升高，在该培养基条件下，在4化左右达到 最高值，约23-27mmol/L/h，维持约10~1化后，随着培养基中碳源和氮源的耗尽，发酵开 始出现碳氮源限制，反应速率开始下降，0UR开始降低，在0UR出现明显下降后，约在下降 地（发酵时间约5化左右），开始补加葡萄糖、木糖或微晶纤维素，控制0UR至15( + 5)-30(±5)mmol/L/h之间维持10化，出现最高纤维素酶滤纸活力，胞外蛋白含量最大，此时停 止发酵。
[0022] 培养过程所用的培养基如下：
[0023] 教皮培养基：7~10%教皮与适量的自来水中，煮沸30min，8层纱布过滤，再用自 来水定容到所需要的体积，加入1. 5%的琼脂，配置成教皮斜面培养基，用于菌种活化与筛 选。
[0024] 种子培养基：1 %木糖渣，1 %教皮，1 %葡萄糖，1%蛋白腺，0. 2 %硫酸锭，0. 3%憐 酸二氨钟，0. 05 %硫酸儀，50血于500血Ξ角瓶中，12rC灭菌20min。
[00巧]产酶培养基：2~7 %木糖渣，1~4%教皮，0. 2~1 %微晶纤维素，0. 5 %豆饼 粉，0. 2 %硫酸锭，0. 1 %尿素，0. 3 %憐酸二氨钟，0. 05 %硫酸儀，0. 3 %吐溫80,121°C灭菌 30min〇
[0026] 采用质谱仪或尾气分析仪对发酵过程中的进气和尾气进行实时在线采集分析，该 质谱仪能够精确测定发酵过程尾气中的氨气、氮气、二氧化碳和氧气等分子量300W内的 可挥发性气体。使用之前用标准气体对仪器的响应度进行标定。
[0027] 摄氧率伽R)测定：
[0028] 0UR的计算通过对发酵尾气的分析数据计算得到。W进气和尾气中惰性气体肥维 持恒定建立平衡方程，求得0UR的计算公式如下：
[OOWFm:进气流量L/min;V:发酵液体积L;C*in\C02m\CC02m:分别为进气中惰性气 体、氧气及二氧化碳的质量分率；C02wt\CC02。。,:分别为排气中氧气和二氧化碳的质量分率；Pm:进气的绝对压强化；t1。:进气的溫度°C;h:进气的相对湿度（％ )。
[0032] 本发明的优点在于，
[0033] (1)通过维持菌株的最佳0UR值来实现菌株生长最佳的碳氮比，防止菌体在发酵 过程中出现营养饥饿现象而导致自隧现象，而导致蛋白含量偏低，酶活力不高的现象。
[0034] (2)通过0UR来控制菌体整个生理状态与生长状态，形成了菌体生长、纤维素酶产 生和大规模生产的核屯、控制因素，可W数十倍放大、准确控制大规模发酵。
[0035] (3)通过0UR来反应菌体生长需求，部分解除碳阻遏效应，大幅度提高酶活力水平 和蛋白水平。
【附图说明】
[0036] 图1实施例1发酵结果
[0037] 图2实施例2发酵结果
[003引 图3实施例3发酵结果
[0039] 图4对比例1发酵结果
【具体实施方式】
[0040] 实施例1:
[0041] 种子培养基：1 %木糖渣，1 %教皮，1 %葡萄糖，1%蛋白腺，0. 2 %硫酸锭，0. 3%憐 酸二氨钟，0. 05 %硫酸儀，50血于500血Ξ角瓶中，12rc灭菌20min。
[0042] 产酶培养基：3%木糖渣，3%教皮，0. 2%微晶纤维素，0. 5%豆饼粉，0. 2%硫酸锭， 0. 1%尿素，0. 3%憐酸二氨钟，0. 05%硫酸儀，0. 3%吐溫80,121°C灭菌30min。
[0043] 滤纸酶（FPA)酶活测定方法：发酵液8000巧m离屯、lOmin，取上清为粗酶液，用于 酶活力及蛋白含量测定。参照轻工业行业标准（地2583-2003)进行测定，取适当稀释的粗 酶液0. 5血，W50mg(lcmX6cm)新华滤纸条为底物，加入抑4. 8醋酸缓冲液1. 5血和0. 5血， W不加底物为对照，50°C反应60min，取出，加入3mlDNS溶液，沸水浴中保持lOmin，水浴冷 却，定容至25ml，混匀，在540皿处比色。
[0044] 化a壯ord法测定蛋白含量：W牛血清白蛋白制作标准曲线，根据标准曲线计算出 粗酶液中的蛋白含量。
[0045] 将草酸青霉JUA10-1划线接种于教皮培养基中28~32°C培养7天，待长出粉红 色的抱子后转接至新鲜教皮培养基培养5天作为菌种。接lcm2菌种接种于种子培养基中， 28~32°C20化pm发酵24~4她，制备成一级种子，按照5%~10%的接种量接种一级种 子于种子培养基中，28~32°C20化pm培养30~4化制成二级种子，然后将二级种子接种 于化产酶培养基中，在化保兴发酵罐中进行产酶发酵，采用气相色谱质谱联用仪（型号 GC-MS6800)进行尾气分析0UR、C邸指标。（0UR与C邸指标基本一致，W0UR进行表征）。 [004引（1)抑调节：发酵开始抑调整为5. 5-6. 0,发酵前期抑逐渐下降，用氨水控制渣 4. 0W上，中后期抑回升用憐酸调节抑至5. 5W下；（2)通气量控制：每分钟通气量：发酵 体积=1:1 ; (3)溶氧调节：发酵起始溶氧调整至100%，发酵过程中通过调节揽拌转速保 持溶氧在30%W上；(4)溫度调控：整个发酵过程溫度保持30°C; (5)发酵开始，0UR随菌 体浓度增加而逐渐升高，在该培养基条件下，在4化左右达到最高值，约23 (±5) -27 (±5) mmol/L/h，维持约10~1化后，随着培养基中碳源和氮源的耗尽，发酵开始出现碳氮源限 审IJ，反应速