率开始下降，0UR开始降低，开始补加葡萄糖，维持0UR至20±5mmol/L/h，后期控 制17±5mmol/L/h维持10化。发酵结果：纤维素酶活力在发酵9化时，酶活力最高，FPA约 为9.抓/mL，β葡萄糖巧酶活力为10.lU/mU蛋白含量为8. 8mg/mL。
[0047] 实施例2
[0048] 种子培养基：1 %木糖渣，1 %教皮，1 %葡萄糖，1%蛋白腺，0. 2 %硫酸锭，0. 3%憐 酸二氨钟，0. 05 %硫酸儀，50血于500血Ξ角瓶中，12rc灭菌20min。
[0049] 产酶培养基：6%木糖渣，4%教皮，0. 2%微晶纤维素，0. 5%豆饼粉，0. 2%硫酸锭， 0.1%尿素，0.3%憐酸二氨钟，0.05%硫酸儀，0.3%吐溫80，121°(：灭菌30111111。
[0050] 滤纸酶（FPA)酶活测定方法和化a壯ord法测定蛋白含量如上所述。
[0051] 将草酸青霉JUA10-1划线接种于教皮培养基中30°C培养5天，待长出粉红色的抱 子后转接至新鲜教皮培养基培养5天作为菌种。接2cm2菌种接种于种子培养基中，28~ 32°C20化pm发酵24~4她，制备成一级种子，按照5 %~10 %的接种量接种一级种子于 种子培养基中，28~32°C20化pm培养30~4化制成二级种子，然后将二级种子接种于 4化产酶培养基中，在5化保兴发酵罐中进行产酶发酵，采用气相色谱质谱联用仪（型号 GC-MS6800)进行尾气分析0UR、C邸指标。
[005引（1)抑调节：发酵开始抑调整为5. 5-6. 0,发酵前期抑逐渐下降，用氨水控制渣 4.οW上，中后期抑回升用憐酸调节抑至5. 5W下；（2)通气量控制：每分钟通气量：发酵 体积=1:1 ;(3)溶氧调节：发酵起始溶氧调整至100%，发酵过程中通过调节揽拌转速保持 溶氧在30%W上；(4)溫度调控：整个发酵过程溫度保持30°C;(5)发酵开始，OUR随菌体浓 度增加而逐渐升高，在该培养基条件下，在6化左右达到最高值，约24±5mmol/L/h，维持约 10~1化后，随着培养基中碳源和氮源的耗尽，发酵开始出现碳氮源限制，反应速率开始下 降，OUR开始降低，开始补加葡萄糖母液，维持OUR至24± 5mmol/L/h，后期控制27 ± 5mmol/ LA维持10化。发酵结果：纤维素酶活力在发酵96h时，酶活力最高，FPA约为22.lU/mL， β葡萄糖巧酶活力为24. 3U/mL蛋白含量为24. 7mg/mL。
[00閲实施例3
[0054] 种子培养基：1 %木糖渣，1 %教皮，1 %葡萄糖，1%蛋白腺，0. 2 %硫酸锭，0. 3%憐 酸二氨钟，0. 05 %硫酸儀，50血于500血Ξ角瓶中，12rc灭菌20min。
[0055] 产酶培养基：6%木糖渣，4%教皮，0. 2%微晶纤维素，0. 5%豆饼粉，0. 2%硫酸锭， 0.1%尿素，0.3%憐酸二氨钟，0.05%硫酸儀，0.3%吐溫80，121°(：灭菌30111111。
[0056] 滤纸酶（FPA)酶活测定方法和化a壯ord法测定蛋白含量如上所述。
[0057] 将草酸青霉JUA10-1划线接种于教皮培养基中30°C培养5天，待长出粉红色的抱 子后转接至新鲜教皮培养基培养5天作为菌种。接10cm2菌种接种于种子培养基中，28~ 32°C200rpm发酵24~4她，制备成一级种子，按照5%的接种量接种一级种子于种子培养 基中，28~32°C20化pm培养30~4化制成二级种子，然后将二级种子按5%的接种量接 种于1.化产酶培养基中，在2t发酵罐中进行产酶发酵，采用气相色谱质谱联用仪（型号 GC-MS6800)进行尾气分析0UR、C邸指标。
[005引（1)抑调节：发酵开始抑调整为5. 5,发酵前期抑逐渐下降，用氨水控制抑在4. 0 W上，中后期抑回升用憐酸维持抑5.0-6.6之间；（2)通气量控制：每分钟通气量：发酵体 积=1:1 ;(3)溶氧调节：发酵起始溶氧调整至100%，发酵过程中通过调节揽拌转速保持溶 氧在20%W上；(4)溫度调控：整个发酵过程溫度保持30°C; (5)发酵开始，0UR随菌体浓 度增加而逐渐升高，在该培养基条件下，在6化左右达到最高值，约18±5mmol/L/h，维持约 10~1化后，随着培养基中碳源和氮源的耗尽，发酵开始出现碳氮源限制，反应速率开始下 降，0UR开始降低，开始补加葡萄糖母液，维持0UR至20±5mmol/L/h，后期控制20±5mmol/ LA维持10化。发酵结果：纤维素酶活力在发酵96h时，酶活力最高，FPA约为17. 5U/mL， β葡萄糖巧酶活力为16.lU/mL蛋白含量为20. 2mg/mU见图3。
[00则对比例1:
[0060]滤纸酶（FPA)酶活测定方法：发酵液8000巧m离屯、lOmin，取上清为粗酶液，用于 酶活力及蛋白含量测定。参照轻工业行业标准（地2583-2003)进行测定，取适当稀释的粗 酶液0. 5血，W 50mg(lcmX6cm)新华滤纸条为底物，加入抑4.8醋酸缓冲液1. 5血和0. 5血， W不加底物为对照，50°C反应60min，取出，加入3mlDNS溶液，沸水浴中保持lOmin，水浴冷 却，定容至25ml，混匀，在540皿处比色。
[006。化a壯ord法测定蛋白含量：W牛血清白蛋白制作标准曲线，根据标准曲线计算出 粗酶液中的蛋白含量。
[0062] 种子培养基：1 %木糖渣，1 %教皮，1 %葡萄糖，1%蛋白腺，0. 2 %硫酸锭，0. 3%憐 酸二氨钟，0. 05 %硫酸儀，50血于500血Ξ角瓶中，12rc灭菌20min。
[0063] 产酶培养基：3%木糖渣，3%教皮，0. 2%微晶纤维素，0. 5%豆饼粉，0. 2%硫酸锭， 0. 1%尿素，0. 3%憐酸二氨钟，0. 05%硫酸儀，0. 3%吐溫80,121°C灭菌30min。
[0064] 将草酸青霉JUA10-1划线接种于教皮培养基中28~32°C培养6天，待长出粉红色 的抱子后转接至新鲜教皮培养基培养3天作为菌种。接lcm2菌种接种于50mL种子培养基 中，28~32°C20化pm发酵24~4她，制备成一级种子，按照5%的接种量接种一级种子于 400mL种子培养基中，28~32°C200巧m培养4化制成二级种子，然后将二级种子按照10% 的接种量接种于化产酶培养基中，在化保兴发酵罐中进行产酶发酵。
[0065] 产酶发酵具体参数控制如下：抑发酵开始抑调整为5. 5,发酵前期抑逐渐下降， 用氨水控制抑在4.0W上，中后期抑回升用憐酸维持抑5.0-6.6之间；通气量为每分钟通 气量：发酵体积为1:1，将发酵起始溶氧调整至100%，转速控制在2(Κ)巧mW上，按2g/L/h 速率进行补料，发酵过程中通过调节揽拌转速保持溶氧在20%W上，OUR不做控制，自然回 落。整个发酵过程溫度保持30°C，发酵在9化达到最高酶活达6FPA/mL，β葡萄糖巧酶活 力为3.lU/mL，蛋白含量3.6mg/mL。溶氧、0UR与FPA之间关系如图4所示。
[0066] 本发明通过试验其他生产纤维素酶草酸青霉菌株，具有相似的纤维素酶代谢情 况。上述虽然对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属 领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造 性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围W内。
【主权项】
1. 一种草酸青霉液态发酵生产纤维素酶的方法，其特征在于，整个发酵过程pH调节在 3. 5~6. 0之间，发酵中后期至发酵结束期间进行补料培养，期间控制摄氧率（OUR)维持 15 (±5)~35 (±5)mmol/L/h〇2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，发酵24h至发酵结束期间进行补料培养。3. 根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，补料培养过程中，通过更换桨叶，调节搅 拌转速保持溶氧在15%以上，通过补料控制摄氧率（OUR)。4. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，补料培养期间控制摄氧率（OUR)维持 18 (±5)~27 (±5)mmol/L/h〇5. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，发酵过程pH调节为：发酵开始pH调整为 5.5-6.0,0-20hpH逐渐下降，用氨水控制发酵培养基pH3.5以上，50-60h后pH回升至 5. 5-6. 0后，开始用磷酸调节pH至6. 0以下。6. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，发酵过程进行通气量控制，通气量每分钟通 气量：发酵体积多1:1。7. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，发酵起始溶氧调整至100%，发酵过程中通 过调节搅拌转速保持溶氧在15%以上。8. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，整个发酵过程温度保持28~33°C。9. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，发酵具体参数控制如下： (1) pH调节：发酵开始pH调整为5. 5-6. 0,0-20hpH逐渐下降，用氨水控制发酵培养基 pH3. 5以上，50_60h后pH回升至5. 5-6. 0后，开始用磷酸调节pH至6. 0以下； (2) 通气量控制：每分钟通气量：发酵体积多1:1 ; (3) 溶氧调节：发酵起始溶氧调整至100%，发酵过程中通过调节搅拌转速保持溶氧在 15%以上； (4) 温度调控：整个发酵过程温度保持28~33°C; (5) OUR调节：发酵开始，OUR随菌体浓度增加而逐渐升高，在40-60h左右达到最高值， 随着培养基中碳源和氮源的耗尽，发酵开始出现碳氮源限制，反应速率开始下降，0UR开始 降低，在0UR出现明显下降后，开始补加葡萄糖、木糖或微晶纤维素、硫酸铵，控制0UR至 18-27mmol/L/h之间维持 100h。10. 根据权利要求9所述方法，其特征在于，发酵前将草酸青霉划线接种于麸皮培养基 中28~32°C培养3-5天，待长出粉红色的孢子后转接至新鲜麸皮培养基培养3天作为菌 种；接菌种于种子培养基中，28~32°C200rpm发酵24~48h，制备成一级种子，接种一级 种子于种子培养基中，28~32°C200rpm培养30~42h制成二级种子，然后将二级种子接 种于产酶培养基进行产酶发酵； 培养过程所用的培养基为： 麸皮培养基：7~10%麸皮与适量的自来水中，煮沸30min，8层纱布过滤，再用自来水 定容到所需要的体积，加入1. 5%的琼脂，配置成麸皮斜面培养基，用于菌种活化与筛选； 种子培养基：1 %木糖渣，1 %麸皮，1 %葡萄糖，1 %蛋白胨，〇. 2 %硫酸铵，0. 3 %磷酸二 氢钾，0.05%硫酸儀，5〇1111^于50〇1]11^三角瓶中，121°(^灭菌2〇111；[11; 产酶培养基：2~7%木糖渣，1~4%麸皮，0. 2~1%微晶纤维素，0. 5%豆饼粉，0. 2% 硫酸铵，0.1%尿素，0.3%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，0.3%吐温80，121°(：灭菌301^11。
【专利摘要】本发明涉及一种纤维素酶高效生产方法，具体公开了一种利用摄氧率控制纤维素酶发酵方法。经过培养基优化筛选及摄氧率工艺条件优化控制，确立了稳定的发酵方法，生产的纤维素酶制剂酶活力提升了50％以上；该工艺可以广泛应用于青霉属、曲霉属等丝状真菌生产纤维素酶。
【IPC分类】C12N9/42
【公开号】CN105255848
【申请号】CN201510649360
【发明人】程少博, 肖林, 夏蕊蕊, 杨建 , 覃树林, 李红震, 孙保剑
【申请人】山东龙力生物科技股份有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月9日