一种工程化有机磷水解酶、核酸和突变体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，尤其是设及一种有机憐水解酶、突变体及其编码 基因，W及该有机憐水解酶及其突变体在有机憐农药降解中的应用。
【背景技术】
[0002] 我国是农药生产和使用大国。全国约有2000多家农药生产企业，生产农药种类超 过200种。有机憐农药具有价格低廉、高效、广谱等特点，是广泛生产、应用的杀虫剂，占据 世界杀虫剂市场38%的份额。2010年国内农药总产量为226. 22万吨，其中有机憐农药产 品占到总量的80%。在我国，农药年使用量高达80-100万吨，居世界首位。尽管有机憐农 药有效防治了农作物病虫害，显著提高了农作物的产量，但长期和大量的使用给食品安全 W及生态环境带来了许多负面的影响。2012年，对9个品牌18种国内常见的中档茶叶调查 发现所有样品均有多种农药残留。农田喷洒的农药除了少量被农作物吸收，大量农药聚集 在±壤中，并通过降雨、排水等途径进入大气和湖泊，造成±壤、大气污染和水体生态的严 重破坏。对硫憐、甲基对硫憐、内吸憐、马拉硫憐、乐果、毒死婢等有机憐农药是我国生活饮 用水的农药检测项目。据统计，我国被农药污染的±壤已达1300-1600万公顷，经济损失超 过十亿元，农药的污染已经十分严重，降解高毒有机憐农药的工作刻不容缓。其中，W微生 物或酶制剂为代表的生物降解和修复技术由于其高效率、低成本和环境友好等特点，显示 出广阔的前景。
[0003]根据农业部禁用高毒农药的1586号公告，我国自2011年10月31日起，全面停止 包括甲基对硫憐、苯线憐、地虫硫憐、甲基硫环憐、硫线憐、蛹毒憐、治惧憐、特下硫憐等在内 的高毒有机憐农药的生产，并在2013年10月31日起停止其销售和使用。因此，毒性相对 较小的马拉硫憐、乐果、杀惧硫憐等农药的生产量与使用量日益增长，成为广泛使用的有机 憐类农药。其中马拉硫憐也是目前美国使用量最大的有机憐农药，适用于防治烟草、茶、蔬 菜、棉花和谷物等作物上的害虫，也可作为室内杀虫剂防治仓库害虫，使用范围广泛。尽管 毒性相对较低，但接触后仍可造成严重的中毒反应，例如呼吸困难、肺水肿，肌疫李W及中 枢神经系统素乱，表现为头痛、乏力、抽摇、昏迷或脑水肿。目前发现的微生物来源的有机憐 水解酶包括两大类：憐酸Ξ醋酶（PTE)，属于酷胺水解酶超家族；甲基对硫憐水解酶（MPH) 和有机憐水解酶C2 (0PHC2)，属于β-内酷胺酶超家族。然而，上述有机憐水解酶对常用农 药马拉硫憐的降解活性很低。例如，属于内酷胺酶超家族的有机憐水解酶化0ΡΗ，经过突变 改造后，其双突变体化〇ΡΗμ2对禁用农药甲基对硫憐的活力高达56. 8U/mg，但其对目前常用 农药马拉硫憐的活力却不足lU/mg。因此，利用理性的进化分析和蛋白质工程手段，开发具 有高活性、高稳定性的有机憐水解酶突变体，用于降解目前常用的有机憐农药，进而降低农 作物及±壤的农药残留问题，具有较大的实际应用价值。
【发明内容】
[0004] 为了克服上述已知有机憐水解酶对常用有机憐农药马拉硫憐性能欠佳的问题，本 发明对已知有机憐水解酶进行基因突变改造w提高有机憐水解酶的活性，同时保留良好的 热稳定性，进而提供一种工程化有机憐水解酶、其编码基因，含有该基因的重组表达质粒和 重组表达转化体及其制备方法，W及突变体蛋白在降解有机憐农药中的应用技术。
[0005] 本发明的目的可W通过W下技术方案来实现：
[0006] 本发明采取的技术方案之一是：
[0007] -种工程化有机憐水解酶，所述的工程化有机憐水解酶是如SEQIDNo.1所示氨 基酸序列的有机憐水解酶的第55位、第57位、第83位、第114位、第137位、第188位或第 262位氨基酸残基中的一个或者多个位点经过氨基酸替换后形成的新氨基酸序列组成且对 马拉硫憐水解活性提高的工程化有机憐水解酶。
[0008] 所述工程化有机憐水解酶的制备可W是从表达该蛋白质的表达转化体中分离获 得，也可W是人工合成获得。由SEQIDNo. 1所示氨基酸序列所构成的有机憐水解酶是申 请人自己保藏的有机憐水解酶突变体，命名为化〇PHm2,并且在申请号为201410167955. 6 的中国专利中有公开。该蛋白质对甲基对硫憐具有很高的有机憐水解酶活性，比活力为 56. 8U/mg，Ts。值为76. 8°C，具有很好的热稳定性，但其对常用农药马拉硫憐的水解活力仅 为 0. 9抓/mg。
[000引为了提高化0PHm2蛋白对马拉硫憐的水解活性，我们通过对化0PHm2进行序列和 构效分析，利用多种蛋白质工程改造技术，组合有益突变，从中筛选对马拉硫憐水解活性提 高、同时保持酶的高热稳定性的工程化有机憐水解酶。
[0010] 其中所述工程化有机憐水解酶较佳的情况是：对SEQIDNo. 1所示氨基酸序列的 第 1、14、55、57、68、83、87、88、114、137、177、187、188、203、248、262、267、318 位氨基酸残基 中的一个或者多个位点进行氨基酸替换后的形成的新氨基酸序列对应的水解酶。
[0011] 所述工程化有机憐水解酶更佳的情况是：对SEQIDNo. 1所示氨基酸序列的有机 憐水解酶的第55位、第57位、第83位、第114位、第137位、第188位和第262位氨基酸残 基中的一个或者多个位点经过氨基酸替换形成的新氨基酸序列对应的水解酶。
[0012] 所述工程化有机憐水解酶最佳的情况是：同时对SEQIDNo.1所示氨基酸序列的 有机憐水解酶的第55位、第57位、第83位、第114位、第137位、第188位和第262位氨基 酸残基经过氨基酸替换的新氨基酸序列对应的水解酶。
[0013] 如SEQIDNo.1所示氨基酸序列的各位氨基酸残基的替换具体如下：
[0014] 所述氨基酸序列的第1位的甲硫氨酸突变为精氨酸（M1R);
[0015] 所述氨基酸序列的第14位的甲硫氨酸突变为亮氨酸（M14L);
[0016]所述氨基酸序列中的第55位的鄉氨酸突变为异亮氨酸（V55I)、亮氨酸（V55L)或 丝氨酸（V55巧，其中更佳的是突变为异亮氨酸（V55I);
[0017]所述氨基酸序列中的第57位的亮氨酸突变为甘氨酸化57G)或异亮氨酸化571)， 其中更佳的是突变为甘氨酸化57G);
[0018] 所述氨基酸序列的第68位的赖氨酸突变为谷氨酸化68巧；
[0019] 所述氨基酸序列的第83位的赖氨酸突变为甘氨酸化83G);
[0020] 所述氨基酸序列的第87位的苏氨酸突变为丙氨酸（T87A);
[0021] 所述氨基酸序列的第88位的丙氨酸突变为脯氨酸（A88巧；
[0022] 所述氨基酸序列的第114位的苏氨酸突变为丙氨酸灯114A);
[0023] 所述氨基酸序列的第137位的亮氨酸突变为异亮氨酸化1371);
[0024] 所述氨基酸序列的第177位的苏氨酸突变为丙氨酸（T177A);
[0025] 所述氨基酸序列的第187位的甘氨酸突变为异亮氨酸（G187I);
[0026] 所述氨基酸序列的第188位的甲硫氨酸突变为苯丙氨酸（M188巧；
[0027] 所述氨基酸序列的第203位的天冬酷胺突变为天冬氨酸（N203D);
[0028] 所述氨基酸序列的第248位的异亮氨酸突变为苏氨酸（I248T);
[0029]所述氨基酸序列的第262位的鄉氨酸突变为丙氨酸（V262A)或甘氨酸（V262G)，其 中更佳的是突变为丙氨酸（V262A);
[0030] 所述氨基酸序列的第267位的谷氨酷胺突变为精氨酸（Q274R);
[0031] 所述氨基酸序列的第318位的丝氨酸突变为甘氨酸（S318G)。
[0032] 本发明采取的技术方案之二是：
[0033] -种分离的核酸，所述核酸是编码上述工程化有机憐水解酶的核酸分子。
[0034] 本发明所述的核酸的制备方法较佳为：可W从含编码表达所述蛋白的氨基酸序列 的表达质粒或重组转化体中分离获得，也可W通过全基因序列人工合成获得。
[0035] 如本领域技术人员所知：由于密码子的简并性，编码所述工程化有机憐水解酶的 碱基序列不仅限于一种，还可W适当引入替换来提供一个多聚核巧酸的同系物。本发明中 多聚核巧酸的同系物可W通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持酶活性范 围内进行替换来制得。
[0036] 本发明采取的技术方案之Ξ是：
[0037] -种包含本发明所述的核酸序列的重组表达质粒。
[0038] 其可通过本领域常规方法制备，即将编码本发明所述的工程化有机憐水解酶的核 酸序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种质粒，优 选质粒祀T-28a(+)。
[0039] 本发明采取的技术方案之四是：
[0040] 一种包含上述重组表达质粒的重组表达转化体。
[0041] 其可通过将上述重组表达质粒转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领 域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达质粒可稳定地自行复制，且所携带的本发明的基 因可被有效表达即可。较佳地为大肠杆菌，更佳地为大肠杆菌E.coliBL2UDE3)。其