步骤无外加引物。PCR反应体系为：基因短片段模板25ng，lOXBuffer 2. 5μ1，dNTPs(2mM)2. 5μ1，，KOD-plus-酶 0. 5U，蒸馈水补足至 25μ1。PCR扩增程序为： (1) 94°C2min;似 98°ClOsec;做 55°C30sec; (4) 68°CImin;步骤似~（4)进行 45 个循 环。扩增得到的PCR产物稀释200倍后作为巢式PCR的模板，克隆引物与易错PCR相同。 PCR反应体系为：模板，lOXBuffer2. 5μ1，dNTPs(2mM)2. 5μ1，，一对克隆引物（lOpmol/μU各 0. 75μ1，KOD-plus-酶 0. 5U，蒸馈水补足至 25μ1。PCR扩增程序为：（1) 94°C2min; 似98°ClOsec;(3)55°C30sec;(4)68°CImin;步骤似~（4)进行30个循环。利用琼脂 糖凝胶DNA回收试剂盒回收唯一的目标条带，得到DNA重排突变基因库，进行克隆、表达和 筛选，方法与易错PCR突变库相同。
[0089] DNA重排突变库筛选结果如表4所示。其中S22A7突变体对马拉硫憐的活力最高， 为母本化〇PHm2的33. 5倍，命名为化ΟΡΗMS。
[0090] 表4.DNA重排突变库筛选结果
[0091]
[009引 实施例4
[0093] 热稳定有机憐水解酶突变体的制备W及热稳定性测定
[0094] 化OPHms的热稳定性相较于母本化0PHm2发生了显著下降。利用FoldX软件进行理 性设计，制备相应的化OPHms突变体，对得到的突变体进行活力和热稳定性筛选。热稳定性 测定筛选方法如下：破碎上清在65 °C保溫15min，在30 °C测定残余活力，对其进行比较。
[0095] 筛选结果如表5所示。其中，K83G突变体的稳定性获得提高，同时保留了原有突 变体的活力，命名为化〇PHm9。
[0096] 表5.热稳定性理性设计突变体筛选结果
[0097]
[0098]
[0099] 对所得到的突变体进行纯化，使用Ni亲和层析柱（GE公司HisTrap?FF柱，5血） 纯化突变体蛋白，具体方法如下：
[0100] (1)用5倍床层体积的Tris-肥1缓冲液（20mM,pH8. 0,含0. 5M化C1和20mM咪 挫）平衡Ni层析柱；
[0101] (2)将实施例2中所得的粗酶液WIml/min流速通过Ni层析柱；
[010引 （3)用5倍床层体积的20mMpH8.OTris-肥1缓冲液（含0. 5M化C1和20mM咪 挫）洗脱非特异结合的杂蛋白；
[010引 （4)用5倍床层体积的20mMpH8.OTris-HCl缓冲液（含0. 5M化C1和0. 5M咪 挫）洗脱特异结合的目的蛋白。
[0104] 测定所得到的突变体的动力学参数和热稳定性，结果如表6所示。其中化0ΡΗμ9的 活力获得显著提高，同时保持了优良的热稳定性。
[0105] 表6.有机憐水解酶突变体活性和热稳定性表征
[0106]
[0107] 化〇ΡΗμ9的Ts。值为67.6°C，50°C时的半衰期高达64.她。Ts。显著高于目前其他具 有高有机憐水解活性的酶，包括MPH和PTE灯^值分别为48°C和62°C)。
[010引 实施例5
[0109] 突变体化0ΡΗμ9对于其他几种常用有机憐农药的水解活性
[0110] 为评价化〇ΡΗμ9用于多种有机憐农药降解的效能，测定了化0ΡΗμ9纯酶对甲基对硫 憐、杀惧硫憐、二嗦憐和乐果的催化水解活性，见表7。
[0111] 表7.化0ΡΗμ9纯酶对于部分有机憐农药的水解活性
[0112]
[0113] 其中，对甲基对硫憐的反应条件为：取100μ1酶液加入900μ1含有0. 5mM甲基对 硫憐的Tris-HCl缓冲液（50mM，抑9. 0)中，30°C条件下反应，在405nm处检测吸光值的变 化率。
[0114] 对于杀惧硫憐的反应条件为：890μ1Tris-HCl缓冲液巧0mM，pH9. 0)中加入 10μ1杀惧硫憐母液（25mM)W及100μ1酶液，30°C条件下反应，在358nm处检测吸光值的 变化率。
[0115] 对二嗦憐的反应条件为：890μ1Tris-HCl缓冲液巧OmM，pH9. 0)中加入10μ1二 嗦憐母液（25mM)W及100μ1酶液，30°C条件下反应，在228nm处检测吸光值的变化率。
[0116] 对于乐果的反应条件为：890μ1Tris-HCl缓冲液巧OmM，pH9. 0,含终浓度2mM的 Ellman'Sreagent)中加入10μ1乐果母液（lOOmM)W及100μ1酶液，30°C条件下反应， 在412nm处检测吸光值的变化率。
[0117] 综上，突变体化0ΡΗμ9对所测试的有机憐农药均能降解，对甲基对硫憐、杀惧硫憐、 二嗦憐、乐果表现出了非常好的降解效果。
[0118] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。 熟悉本领域技术的人员显然可W容易地对运些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般 原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领 域技术人员根据本发明的掲示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的 保护范围之内。
[0119]
[0120]
[0121]
【主权项】
1. 一种工程化有机磷水解酶，其特征在于，如SEQIDNo. 1所示氨基酸序列的第55位、 第57位、第83位、第114位、第137位、第188位或第262位氨基酸残基中的一个或者多个 位点经过氨基酸替换后形成的新氨基酸序列组成的活性提高的有机磷水解酶突变体。2. 根据权利要求1所述的一种工程化有机磷水解酶，其特征在于，为由如SEQIDNo. 1 所示氨基酸序列的第55位、第57位、第83位、第114位、第137位、第188位或第262位氨 基酸残基同时经过氨基酸替换后形成的新氨基酸序列组成的有机磷水解酶突变体。3. 根据权利要求1或2所述的一种工程化有机磷水解酶，其特征在于， 如SEQIDNo. 1所示氨基酸序列中的第55位的缬氨酸替换为异亮氨酸、亮氨酸或丝氨 酸； 如SEQIDNo. 1所示氨基酸序列中的第57位亮氨酸替换为甘氨酸或异亮氨酸； 如SEQIDNo. 1所示氨基酸序列中的第83位赖氨酸替换为甘氨酸； 如SEQIDNo. 1所示氨基酸序列中的第114位苏氨酸替换为丙氨酸； 如SEQIDNo. 1所示氨基酸序列中的第137位亮氨酸替换为异亮氨酸； 如SEQIDNo. 1所示氨基酸序列中的第188位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸； 如SEQIDNo. 1所示氨基酸序列中的第262位缬氨酸替换为丙氨酸或甘氨酸。4. 根据权利要求3所述的一种工程化有机磷水解酶，其特征在于， 如SEQIDNo. 1所示氨基酸序列中的第55位的缬氨酸替换为异亮氨酸； 如SEQIDNo. 1所示氨基酸序列中的第57位亮氨酸替换为甘氨酸； 如SEQIDNo. 1所示氨基酸序列中的第83位赖氨酸替换为甘氨酸； 如SEQIDNo. 1所示氨基酸序列中的第114位苏氨酸替换为丙氨酸； 如SEQIDNo. 1所示氨基酸序列中的第137位亮氨酸替换为异亮氨酸； 如SEQIDNo. 1所示氨基酸序列中的第188位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸； 如SEQIDNo. 1所示氨基酸序列中的第262位缬氨酸替换为丙氨酸。5. -种分离的核酸，其特征在于，所述核酸是编码如权利要求1所述工程化有机磷水 解酶的核酸分子。6. -种包含如权利要求5所述核酸的重组表达质粒。7. -种包含如权利要求6所述重组表达质粒的重组表达转化体。8. -种重组工程化有机磷水解酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步 骤：培养如权利要求7所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组工程化有机磷水解酶。9. 如权利要求1所述的工程化有机磷水解酶在降解有机磷农药中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的有机磷农药包括甲基对硫磷、马 拉硫磷、杀螟硫磷、二嗪磷或乐果。
【专利摘要】本发明涉及一种工程化有机磷水解酶、核酸和突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明的工程化有机磷水解酶，是如SEQ？ID？No.1所示氨基酸序列的第55位、第57位、第83位、第114位、第137位、第188位或第262位氨基酸残基中的一位或者多位经过氨基酸替换后形成的新氨基酸序列组成的活性提高的有机磷水解酶突变体。与现有技术相比，本发明中的有机磷水解酶突变体对马拉硫磷的催化活性提高了36.7倍，同时该突变体保持了母本优良的热稳定性，50℃半衰期达65h。本发明中的有机磷水解酶突变体能够高效降解马拉硫磷等常见有机磷农药，热稳定性佳，在降解有机磷农药领域具有很好的应用前景。
【IPC分类】C12N15/63, B09C1/10, C12N15/55, C12N9/16
【公开号】CN105255846
【申请号】CN201510679218
【发明人】许建和, 罗晓晶, 潘江
【申请人】华东理工大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月19日