一种优化有机磷水解酶酵母工程菌及其酶的生产方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种有机磷水解酶的重组酵母表达菌株的构建方法及该工程菌高密 度的发酵方法，属于基因工程和生物技术领域。
【背景技术】：
[0002] 有机磷农药因具有高效、低成本、杀虫广泛等特点，对农业发展和人类粮食供给做 出了巨大的贡献。目前我国生产的农药中，有机磷农药占到了农药总量的70%以上，有机磷 农药的大量不合理使用也使得蔬菜、粮食、瓜果等农产品以及土壤、水体中的有机磷农药残 留严重超标。但由于有机磷农药具有较强的毒性，能抑制中枢神经系统中乙酰胆碱酯酶的 活性，进而导致体内乙酰胆碱的大量聚集而中毒，和不易被降解等特点，农村大量使用有机 磷农药的同时又带来了日益严重的环境污染与人畜健康问题，甚至对农产品出口创汇也造 成了严重影响。
[0003] 有机磷水解酶又称磷酸三酯酶，广泛存在于自然界中的生物体内，它可以降解包 括有机磷神经毒化学战剂和一些广泛使用的农用杀虫剂在内的一大类有机磷化合物，其作 用原理通常为：将有机磷农药分子中的磷酯键断裂，使有机磷农药分解为环境可以接受的 低毒或无毒小分子物质，从而达到降低毒性的目的。自1973年Sethunarhan等从土壤中分 离出乙基对硫磷降解Flavobacterium sp. ATCC 27551以来，农药降解菌研究的序幕被正式 拉开，农药降解菌的筛选及相关基因的研究也成为了国内外科学家的主要研究方向。目前 为止，人们已经筛选出的有机磷农药降解菌近百种，其中包括细菌、真菌、放线菌以及藻类 等。然而，随着环境中有机磷农药释放量的日益增加，天然存在于自然界的这些有机磷农药 降解菌显然已经不能满足人类的降毒要求。所以研究者们利用微生物高效表达系统（如： 大肠杆菌、毕赤酵母表达系统）大量表达了有机磷水解酶，表达量相对原始菌株明显提高。 但在原核表达系统中，因既不能对表达的蛋白进行翻译后的加工，也不能对表达蛋白进行 糖基化修饰，所以经常导致表达的蛋白没有活性；另外，蛋白质的表达量不高，且胞内表达 杂蛋白较多，不易纯化，达不到廉价大规模生产的目的，所以实用性有限。酵母具有微生物 和真核生物的双重特点，它可以对体内表达的异源蛋白进行修饰，当采用酵母信号肽时，蛋 白能被正确折叠和加工，然后分泌到培养基中。相对原核表达系统而言，真核酵母表达系统 表达的酶表达量高且容易纯化，目前已经有多种蛋白利用酵母表达系统进行了大规模工业 化生产。其中毕赤酵母表达系统是目前工业化生产蛋白酶常见的表达系统，毕赤酵母表达 系统主要有以下特点：①具有强有力的乙醇氧化酶（Alochol Oxidase，A0X1)基因启动子， 可严格调控外源蛋白的表达；②作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与 修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；③营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化 生产；④可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达120g/L以上；⑤表达量高，许多 蛋白可达到克级每升以上水平。初晓宇等将假单胞菌来源的有机磷水解酶基因0phc2克隆 并整合到毕赤酵母基因组中，成功实现该酶的异源表达，3L高密度发酵表达量达到5. 5g/ L0
[0004] 随着分子生物学研究的飞速发展，各种基因工程操作技术的迅速出现，如今合成 生物学已经发展成为一门热门学科，并且被应用到科研和工业生产中。Biobricks技术是近 年发展出来的一种广泛应用于合成生物学中的重组DNA的方法，其实质是通过基因片段的 巧妙拼接实现DNA片段重组。本发明中即采用Biobricks技术，将有机磷水解酶基因巧妙 拼接，获得有机磷水解酶基因多拷贝毕赤酵母表达载体，并成功整合至酵母基因组，获得表 达量达到8. lg/L的有机磷水解酶重组菌株，为工业化大规模廉价生产有机磷水解酶奠定 了基础。
【发明内容】
：
[0005] 本发明的目的是首先根据酵母密码子偏爱性，人工优化合成有机磷水解酶基因 (OphcM)，然后构建并筛选多拷贝有机磷水解酶基因毕赤酵母高效表达菌株，最后通过高密 度发酵的方法提高单位体积的有机磷水解酶产量，降低生产成本，为该酶的大规模工业化 生产奠定基础。
[0006] 本发明的步骤为：
[0007] 1、优化合成有机磷水解酶基因（OphcM)
[0008] 将来源于Pseudomonas pseudoalcaligenes 的有机憐水解酶基因 0phc2 (Genebank ID :AJ605330. 1，其中，基因长度为906bp，编码301个氨基酸）进行改造，在不改变原氨基 酸编码序列的原则下，按照酵母密码子偏爱性对其进行优化，采用套叠 PCR的方法进行基 因合成，优化改造的基因序列见图1，命名为OphcM。优化后的核酸序列与原始核酸序列相 比，253个核酸发生改变，改造前后核苷酸序列相比，同源性为72. 08%，同时为了使有机磷 水解酶在毕赤酵母中高效稳定地分泌表达，优化后的有机磷水解酶基因去掉了编码5'端信 号肽序列的22氨基酸（详见图2的第2至23)。
[0009] 2、多拷贝有机磷水解酶毕赤酵母表达载体的构建过程
[0010] 将有机磷水解酶基因 OphcM两端引入酶切位点Cop I和Not I，并克隆到毕 赤酵母高效表达载体PHBM905BDM(专利公开号CN103555749A)中，获得单拷贝表达载 体BDM-OphcM-IC ;然后采用传统的基因工程操作技术，分别通过限制酶EcoR I、Xba I、Spe I和BamH I的酶切，先后获得多拷贝表达载体BDM-〇phcM-2C、BDM-〇phcM-3C、 BDM-0phcM-4C。载体构建具体过程如图4。
[0011] 3、构建多拷贝有机磷水解酶基因毕赤酵母表达重组菌株
[0012] 将上述多拷贝表达载体BDM-〇phcM-2C、BDM-〇phcM-3C、BDM-0phcM-4C采用化学转 化法，分别转化到Pichia pastoris GS115Mut+中，通过在MD平板上生长，并采用菌落PCR 的方法进行验证，然后摇瓶发酵，具体方法为：将转化后重组菌株接种到BMGY培养基中在 28°C培养48h后，离心去上清将细胞转移到BMMY培养基中，每24h取样并用1 %的甲醇进 行诱导。样品离心去除沉淀，用上清跑SDS-PAGE电泳检测目的蛋白表达情况，并用上清与 底物甲基对硫磷反应，检测表达产物是否有活性。通过以上筛选方法分别获得单拷贝、二 拷贝、三拷贝、四拷贝的重组菌株，分别命名为Pichia pastoris OphcMUPichia pastoris 0phcM2、Pichia pastoris 0phcM3、Pichia pastoris 0phcM4〇
[0013] 4、将筛选到的多种重组菌株，分别进行摇瓶发酵，在相同的培养条件下，保证菌体 量基本一致的前提下，通过多次摇瓶试验，比较1-4拷贝的重组酵母表达量和酶活，其中， Pichia pastoris OphcM2菌株的表达量和活性最高，如图6所示。
[0014] 5、将重组酵母高密度发酵，制备生产有机磷水解酶；其中包括种子培养、菌体生长 阶段、碳源饲喂阶段和甲醇诱导表达阶段等四个常规发酵生产酶的步骤。
[0015] 使用本发明将重组酵母Pichia pastoris 0phcM2菌株在5升发酵罐发酵144小 时表达量达8. 1克/升，在发酵96小时，酶比活达到12. 85U/mL，均明显高出目前现有技术 数据。
[0016] 所述Pichia pastoris 0phcM2菌株于2015年03月20号保藏于武汉大学中国 典型培养物保藏中心，名称为毕赤巴斯德酵母工程菌Pichia pastoris/0phcM2,保藏号： CCTCC N0:M2015140,以下简称 0phcM2。
[0017] 0phcM2菌株的菌学特性：
[0018] A、形态特征：毕赤酵母属菌种细胞呈球形、椭圆形、拉长形，偶尔呈锥形，但不形成 尖顶。菌落颜色为乳白色或奶油色。无性繁殖方式为多边芽殖。
[0019] B、生理生化特征：毕赤酵母能利用甲醇，石油，铵盐等特殊物质生长，最适生长温 度为28°C -30°C。0phcM2除了具有毕赤酵母的生理生化外，其染色体上整合了有机磷水解 酶基因，在甲醇诱导条件下，能够严格调控并高效分泌表达有机磷水解酶基因。（见背景技 术里的介绍）
【附图说明】：
[0020] 图1人工合成序列OphcM与原始序列0phc2对比图，其中灰色区域代表同源序列
[0021] 图2优化的氨基酸序列与原始序列对比图，其中灰色区域代表同源区
[0022] 图3重组载体BDM-OphcM 1-4拷贝装配及构建过程
[0023] 图4毕赤酵母高效表达载体pHBM905BDM物理图谱及重组载体构建过程
[0024] 图5 BDM-OphcM 1-4拷贝重组表达载体多拷贝验证，其中图A所示为1-4拷贝质 粒，图B为所示为EcoR I和BamH I双酶切验证
[0025] 图6 BDM-0phcMl-4拷贝表达量的SDS-PAGE电泳，其中，M为蛋白质预染marker， 1-2 泳道依次为 Pichia pastoris OphcMU Pichia pastoris 0phcM2、Pichia pastoris 0phcM3、Pichia pastoris 0phcM4 摇瓶 6 天的上清
[0026] 图7 Pichia pastoris 0phcM2菌株发酵的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白质预 染marker，1-8泳道依次为发酵12h，24