一种扣囊复膜酵母及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体来说涉及一种扣囊复膜酵母，同时涉及该扣囊复 膜酵母在产异戊醇中的用途。
[0002]
【背景技术】
[0003] 白酒酿造过程是多种微生物共同参与的过程。酱香型白酒是中国主要香型白酒， 其独特的酿造工艺形成了大曲和酒醅中特殊的微生物区系。研究发现，在白酒酿造过程中， 产生的醇类除乙醇外，产生的高级醇如异戊醇、异丁醇、苯乙醇等属于醇甜和助香剂的主要 物质来源，赋予白酒一定魅力，如果白酒中无高级醇则无传统白酒的固有风味。
[0004] 异戊醇具有苹果白兰地香气，同时也是我国GB2760-86规定为允许使用的食用香 料，主要用以配制苹果和香蕉型香精，因此对形成酒的风味和促使酒体丰满、圆润、口感细 腻柔和起着重要作用。
[0005] 酱香型白酒香味的形成与酵母关系密切，近些年来，从各地优质白酒酒曲、酒醅中 分离出白酒生产功能微生物，并探讨其应用。
[0006]目前用于产异戊醇类的菌株主要为酿酒酵母、鲁氏酵母、生香酵母等，而扣囊腹膜 酵母产异戊醇类物质的研究较少，没有相关的文章或专利。
[0007]
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一株产异戊醇的扣囊复膜酵母FBKL2. 0094。
[0009] 本发明的另一目的在于提供该囊复膜酵母FBKL2. 0094在产异戊醇中的用途 一种囊复膜酵母 FBKL2. 0094/YZwJi供FBKL2. 0094)，其形态 特征：该菌形成的菌落在PDA培养基上，28°C培养2d，菌落直径3~5 mm，菌落圆形堑状， 颜色白色，质地呈短绒毛状，不透明，菌落边缘呈齿蚀状，菌落易挑起。细胞为卵圆形，细胞 2. 35~3. 97 μ m，长4. 66~5. 42 μ m，能形成假菌丝及产子囊孢子。
[0010] 该菌种已于2015年6月17日保藏到中国典型培养物保藏中心(地 址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCC NO :M 2015382,名称：扣囊复膜酵母 FBKL2. ^^\{Saccharomycopsis fibuligera FBKL2. 0094) 〇
[0011] 本发明的一种扣囊复膜酵母 FBKL2. 0094 /YZwJi供ra FBKL2. 0094)的分离，包括以下步骤： (一）对扣囊复膜酵母 FBKL2. 0094 /YZwJi供FBKL2. 0094)的分 离： 从贵州某酒厂酒曲中，称取20g大曲及糟醅样品放入盛180ml无菌水并带有玻璃珠的 三角烧瓶中，振荡约30min。取Iml样品悬液进行10倍梯度稀释分别由10-4、10-5、10-6 和10-7稀释度的样品悬液中各取0. 2ml涂布于分离培养基上，28°C静止培养2d，挑取单 菌落进一步分离筛选纯化，斜面培养基上保藏。
[0012] (二）培养基： 鉴定培养基：孟加拉红培养基，蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾lg，硫酸镁 (MgSO4 · 7Η20)(λ 5g，琼脂 20g，氯霉素 (λ lg，1/3000 孟加拉红溶液 100mL，蒸馏水 1000mL。
[0013] 保藏培养基：麦芽汁琼脂培养基，麦芽膏粉130g/L，氯霉素0. lg/L，琼脂15/ L, PH5. 8-6. 2 〇
[0014] 固体发酵培养基：高粱麦粒培养基 小麦1:1粉碎，高粱3:1粉碎，高粱：小麦质量比为1:1混料；90°C热水润粮4h (加水 量40% - 50%);烧杯盛装放入灭菌锅内121°C蒸煮20min ;待混料冷却到60°C左右加入糖化 酶（200u/g)，调节pH4 - 4. 5,在60°C水浴锅糖化4h ;装瓶，灭菌。
[0015] (三）菌种的保种和传代： 1.菌种保藏培养基： (1)麦芽汁琼脂培养基：麦芽膏粉130g/L，氯霉素0· lg/L，琼脂15g/L，PH5. 8 - 6. 2， 115°C灭菌 20min。
[0016] (2)YEro (YPD)培养基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水 1000ml，ρΗ6· 0, 115Γ 灭菌 20min。
[0017] 2.保存方法有4种： (1)传代培养酵母菌种保存法：将酵母接种于麦芽汁琼脂斜面培养基上，置温箱28°C 培养2d后，将橡胶塞用灭菌固体石蜡熔封，移至4°C冰箱保存，一般酵母在4°C冰箱内可以 保存一个月，需定期移植。（2)砂土管酵母菌种保存法：取清洁的海沙，用lmol/L的氢氧 化钠溶液清洗，然后再用lmol/L的盐酸溶液清洗，在后用流水冲洗。分装试管，约2-3厘米 深，干热灭菌，加入酵母培养液ImL左右与砂土混匀，置真空干燥管内干燥，待完全干燥后 熔封保存。
[0018] (3)真空冷冻干燥酵母菌种保存法：将待保存的微生物细胞或者孢子悬浮在合适 的保护剂中，预先将细胞冷冻，使水冻结，然后在真空条件下，使冰升华以除去大部分水，残 留的一些不冻结的水分，再通过蒸发从细胞中除去。
[0019] (4)液体石蜡法：亦称矿物油保藏法，将酵母菌种接种在适宜的斜面培养基上，最 适条件下培养至待得到健壮的菌体后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放 置于低温（4~6°C)干燥处进行保存的一种菌种保藏方法，是定期移植保藏法的辅助方法。
[0020] (四）菌种的生态特征： 该菌形成的菌落在PDA培养基上，28°C培养2d，菌落直径3~5 mm，菌落圆形堑状， 颜色白色，质地呈短绒毛状，不透明，菌落边缘呈齿蚀状，菌落易挑起。细胞为卵圆形，细胞 2. 35~3. 97 μ m，长4. 66~5. 42 μ m，能形成假菌丝及产子囊孢子。PDA培养基上，培养一 周后，菌丝白色，菌落平坦，绳状，边缘羊毛状，两周后菌丝变为象牙黄，有水果香味。显微镜 观察发现菌丝容易染色，生殖菌丝直径2-4um，菌丝有隔膜，且多分支，菌丝系统为一体系至 二体系，生殖菌丝具简单分隔，显微镜观察，菌丝着色深，均匀，且分支多，呈网状，有隔膜， 且所有菌丝在Melzer试剂中无变色反应，在棉蓝试剂中厚壁菌丝有中度嗜蓝反应，菌丝均 匀，分支多，呈网状，粗壮；而在CA培养基上，菌丝稀疏，白色，质地呈绳状，无味。
[0021] (五）菌种的培养特性 (1) 培养温度20°C~30°C，最适温度28°C~30°C ; (2) 培养pH 3~L 5,最佳范围为4. 5~5.0。
[0022] 细胞为卵圆形，细胞2. 35~3.97 μπι，长4. 66~5.42 μπι，有假菌丝及产子囊 孢子，根据《酵母菌的特征及鉴定手册》，从样品中经筛菌、分离、纯化、镜检、生理生化 以及采用16S rDNA测序，将测得序列在DNAMN软件中进行序列反转，在NCBI中进行 BLAST比对，再用MEGA5软件建立所分离菌株的系统发育树，确定所分离的菌株为扣囊腹 膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera)，故将命名为 FBKL2. fibuligera FBKL2. 0094)〇
[0023] 本发明的扣囊复膜酵母菌 FBKL2. 0094 /YZwJigera FBKL2. 0094)对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，对不良环境的耐受力强，容易培养 和保存及工业化生产，生产成本低，不污染环境，不破坏生态平衡。
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【具体实施方式】
[0025] -种扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera)的分离方法，包括以下步 骤： a、菌种的分离：从贵州珍酒酿酒有限公司的酒曲中，称取20g大曲样品放入盛180ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振荡约30min。取Iml样品悬液进行10倍梯度稀释分 别由10-4、10-5、10-6和10-7稀释度的样品悬液中各取0. 2ml涂布于分离培养基上，28°C 静止培养2d，挑取单菌落进一步筛选，斜面培养基上保藏。
[0026] b、菌种的保种和传代： 1.菌种保藏培养基： (1)麦芽汁琼脂培养基：麦芽膏粉130g/L，氯霉素0· lg/L，琼脂15g/L，PH5. 8 - 6. 2， 115°C灭菌 20min。
[0027] (2) YEro (YPD)培养基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水 1000ml，ρΗ6· 0, 115Γ 灭菌 20min。
[0028] 2.保存方法： (1)传代培养酵母菌种保存法：将酵母接种于麦芽汁琼脂斜面培养基上，置温箱28°c 培养2d后，将橡胶塞用灭菌固体石蜡熔封，移至4°C冰箱保存，一般酵母在4°C冰箱内可以 保存一个月，需定期移植。（2)砂土管酵母菌种保存法：取清洁的海沙，用lmol/L的氢氧 化钠溶液清洗，然后再用lmol/L的盐酸溶液清洗，在后用流水冲洗。分装试管，约2-3厘米 深，干热灭菌，加入酵母培养液ImL左右与砂土混匀，置真空干燥管内干燥，待完全干燥后 熔封保存。
[0029] (3)真空冷冻干燥酵母菌种保存法：将待保存的微生物细胞或者孢子悬浮在合适 的保护剂中，预先将细胞冷冻，使水冻结，然后在真空条件下，使冰升华以除去大部分水，残 留的一些不冻结的水分，再通过蒸发从细胞中除去。
[0030] (4)液体石蜡法：亦称矿物油保藏法，将酵母菌种接种在适宜的斜面培养基上，最 适条件下培养至待得到健壮的菌体后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放 置于低温（4~6°C)干燥处进行保存的一种菌种保藏方法，是定期移植保藏法的辅助方法。
[0031] c、产香能力测定： (1) 种子液制备：配制液体培养基，三角瓶盛装，115°c灭菌20min，然后在超净工作台 接入活化的菌种到液体培养基中，在28°C摇床上培养48h，得种子液； (2) 三角瓶固态发酵：采用高粱麦粒培养基，小麦1:1粉碎，高粱3:1粉碎，再以高粱： 小麦质量比为1:1混料；接着90°C热水润粮4h，其中加水量50% ;将培养基盛装放入灭菌锅 内121°C蒸煮20min ;待培养基冷却到60°C加入糖化酶（250u/g)，调节pH4. 0-4. 5,在60°C 水浴锅糖化4h ;装瓶，灭菌；灭菌完成待培养基冷却至40°C后，往三角瓶中接入质量百分比 为8%的种子液，搅拌均勾，在28"€下丨旦温培养7d，以后每隔12h扣瓶一次； (3) 产香分析：发酵结束进行感官评定，香味较浓，可接受性高，再通过气质（GC-MS)联 用仪，以上述用扣囊腹膜酵母发酵出的发酵样品做气质分析样品，并对其中的易挥发性物 质进行分析，得出峰图，结果表明其中异戊醇类物质含量为16. 3% (见表1)。
[0032] 表1发酵样品GC-MS成分分析
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未 脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等 同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
【主权项】
1. 一种扣囊复膜酵母FBKL2. 0094，其特征在于所述菌种的保藏号为CCTCC NO :M 2015382,名称：扣囊复膜酵母 FBKL2. 0094 /iAWigera 2. 0094)。2. 如权利要求1所述的囊复膜酵母FBKL2. 0094在产异戊醇中的用途。
【专利摘要】本发明公开了一种扣囊复膜酵母及其用途，其形态特征：该菌形成的菌落在PDA培养基上，28℃培养2d，菌落直径3～5mm，菌落圆形埑状，颜色白色，质地呈短绒毛状，不透明，菌落边缘呈齿蚀状，菌落易挑起。细胞为卵圆形，细胞2.35～3.97μm，长4.66～5.42μm，能形成假菌丝及产子囊孢子。本发明能在酱香型白酒中产异戊醇。CCTCC NO：M201538220150617
【IPC分类】C12R1/645, C12P7/04, C12N1/16
【公开号】CN105062904
【申请号】CN201510636469
【发明人】王晓丹, 周鸿翔, 邱树毅, 罗小叶
【申请人】贵州大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月30日