专利名称：鹰嘴豆克鲁维酵母表达系统及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及鹰嘴豆克鲁维酵母表达系统及其用途，包括基因工程菌株构建所需要的载体系统、宿主菌株和转化方法等。
鹰嘴豆克鲁维酵母(Kluyveromyces cicerispours)菌株具有无毒、生长快、分泌蛋白量大且组分单一等优点，因此具有被发展成为非常规酵母高表达系统而进行大量表达外源蛋白的表达宿主的潜在价值。
虽然在克鲁维酵母的某些种中已经建立了高效的转化系统，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces.Lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces.marxianus)和壁脆克鲁维酵母(Kluyveromyces.fragilis)等。但是利用鹰嘴豆克鲁维酵母构建转化系统却未见有报道，这主要有以下几个原因1、由于该菌株的遗传背景很不清楚，因此利用该菌株进行遗传操作的工作很少，这就造成了极大的困难。2、没有可用于转化系统的宿主菌，因为以该菌株为材料的科学研究工作很少，因此没有人构建可用于转化的宿主菌。3、缺乏理想的载体。4、缺乏有效的选择性标记。5未建立适于该菌株的转化方法。
本发明提出的鹰嘴豆克鲁维酵母表达系统，包括宿主菌鹰嘴豆克鲁维酵母，将外源基因导入宿主的多核苷酸载体，将带有外源基因表达单元的多核苷酸载体转入宿主菌的转化方法，以及构建的带有外源基因的鹰嘴豆克鲁维酵母基因工程菌株。
本发明的具体内容包括克隆宿主菌株的特定基因，包括营养缺陷型基因；应用营养缺陷型基因作为选择标记；构建宿主工程菌；构建适宜的载体；和适当的转化方法。
本发明中，所述的宿主菌带有特定选择标记，其特征是容易筛选转化子，包括营养缺陷型、抗生素抗性或者其他反选择标记。
上述营养缺陷型标记包括，营养缺陷型基因URA3、组氨酸缺陷型基因HIS3、LEU2、HIS4、TRP1、ADE2等。
上述抗生素抗性选择标记包括G418抗性基因、卡那霉素抗性基因、Zeocin抗性基因等。
上述反选择标记包括URA3、SacB基因等。
本发明还提出了所述的选择标记与温度敏感等性质结合选择转化子的方法。
本发明中，所述的表达系统的游离型载体为pUK1和pKSUKD，包括果蝇克鲁维中自主复制序列pKD1和在乳酸克鲁维酵母中的pK1序列，选择标记是鹰嘴豆克鲁维酵母的营养缺陷型基因URA3(SEQ1)。
本发明中，所述表达系统的宿主可以是鹰嘴豆克鲁维酵母的变异菌株Y179U-，具体为在其URA3基因的93位密码子点突变，一个T变成了G，丝氨酸变成了精氨酸，导致了该菌株的URA3基因被破坏，乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶便丧失功能，该菌株的表型为ura缺陷的菌株，在不含尿嘧啶的基础培养基上不能生长，只能在富集培养基或者是加了尿嘧啶的基础培养基上才能生长。
本发明中，所述的基因工程菌，其带有特定的外源基因，包括编码乙型肝炎病毒表面抗原，肿瘤坏死因子及其受体，淋巴毒素，人干扰素等。
本发明中，多核苷酸载体转入宿主菌的转化方法，包括以下步骤a.接单菌落到YEPD培养基中，30℃振荡过夜培养；b.将过夜培养液按1％接种量接种到50mlYEPD液体培养基中，30℃培养到O.D600为1.2-1.3左右。以下所有操作应在冰上进行；c.5K 5min 4℃离心收集菌体；d.用等体积的冰水洗一次，5K 5min 4℃离心收集菌体；e.用1/2体积的冰水再洗一次，5K 5min 4℃离心收集菌体；f.用10ml 1M山梨醇洗一次5K 5min 4℃离心收集菌体，用10ml 1M山梨醇再洗一次5K 5min 4℃离心收集菌体，悬浮细胞到800ul 1M山梨醇中，取80ul细胞和小于5ul的DNA混合，加入到电极杯中；g.1.5kv 200Ω 25uF电击；h.立即加入1ml1M山梨醇，30℃温浴1h；i.离心后涂SD平板。
由此可见，本发明，1、克隆了该菌株的营养缺陷型基因URA3，应用营养缺陷型作为选择标记，而避免了应用一些抗药性的显性标记。2、构建了可用于转化的宿主菌。3、构建了新型的多核苷酸载体。4、建立了高效的转化Y179菌株的方法。
图2 游离型载体pKSUKD。
图3 两种转化方法的转化效率对照图。其中，上为对照，左为pKSUKD转化子，右为pUK1转化子。电转化的方法可以获得较高的转化效率，达到104个/μg DNA，利用完整转化方法对Y179菌株转化时所获得的转化效率也达到103个/μg DNA。
一、URA3基因的克隆用一个酵母-大肠的穿梭质粒pRS424构建Y179菌株的基因文库，并将该基因文库转化酿酒酵母菌株W303-1B通过推测Y179 URA3基因与酿酒酵母菌株的ura3在功能上可以互补，筛选到Y179菌株的URA3基因(SEQ.1)。该基因编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶，其编码区为801个，共编码267个氨基酸。与酿酒酵母的核苷酸序列同源性为80％，氨基酸同源性为87％。
二、Y179ura-菌株的构建我们利用现代分子遗传学方法对鹰嘴豆克鲁维酵母的典型菌株(Kluyveromycescicerispours Y179)进行了突变改造，得到了鹰嘴豆克鲁维酵母的变异菌株Y179ura-(保藏号为CCTCC NOM202031)。该菌株的遗传特点是在其URA3基因的93个密码子上发生了点突变，一个T变成了G，这样使得丝氨酸变成了精氨酸，导致了该菌株的URA3基因被破坏，因此它的乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶便偿失功能，该菌株的表型为URA缺陷的菌株，即在不含尿嘧啶的基础培养基上不能生长，而只能在富集培养基或者是加了尿嘧啶的基础培养基上才能生长。这样我们就首次在鹰嘴豆克鲁维酵母中构建了一个营养缺陷型菌株，利用该菌株可以很简便、有效的在基础培养基上利用基因功能互补的作用来筛选转化子。该菌株的建立为整个转化系统的构建奠定了重要的基础。
三、重组多核苷酸载体的构建用于转化的载体主要是由复制系统、选择标记和一些可用于克隆的限制性核酸内切酶位点构成，一般含有大肠杆菌和酵母菌两种不同的复制系统，因而能在不同的宿主中复制。按照其复制方式不同又可分为游离型和整合型载体，其中游离型的载体含有在宿主细胞中可以自主复制的序列，而整合型载体则是含有和宿主细胞中的同源序列，能够通过同源重组整合到染色体DNA上，并随着染色体DNA一起复制。由于两种载体各有利弊，如游离型载体拷贝数多，但是不稳定，而整合型载体虽然稳定，但是整合的拷贝数低。鉴于此我们构建了游离型载体。
四、游离型载体的构建由于我们没有发现在Y179菌株中有类似于酿酒酵母中2μ质粒的自主复制序列，因此推想在其他种属的克鲁维酵母中发现的自主复制序列能否在该菌株中进行复制，我们选用了在果蝇克鲁维中自主复制序列pKD1和在乳酸克鲁维酵母中的pK1序列构建了游离型载体pUK1和pKSUKD，质粒构建方法见参考文献[5]。这两个载体除了含有自主复制序列外，还带有鹰嘴豆克鲁维酵母URA3基因作为选择标记，避免了选用抗药性基因作为选择标记。使得在筛选转化子时更为便利。实验结果表明这两个载体所含有的自主复制序列均可以在Y179ura-菌株中进行自主复制。载体图谱见附
图1。
五、Y179菌株高效转化方法的建立目前可用于酵母菌转化的方法主要有原生质体转化法、电转化法和完整细胞转化法。这几种方法各有利弊，其中原生质体转化方法是最经典的转化方法，但是由于这种方法需用特殊的酶处理酵母细胞壁形成原生质体，然后在含有金属离子的试剂下促使细胞摄取外源DNA。该方法的优点是转化效率高，但是操作步骤烦琐，而且形成原生质体的时间很难控制。电转化方法是最近发展的一种转化方法，该方法通过给细胞提供瞬时高压后可促使细胞摄取外源DNA，这种方法的优点是简便省时，转化效率也挺高，但是电转化的方法需要提供特殊的仪器，另外对于细胞的预处和电击条件要求也很严格。相比以上两种转化方法目前最简便有效的方法是完整细胞转化方法，它既不需要用酶解方法也不需要特殊的仪器，但是完整细胞转化方法的转化效率往往没有前两种高。
由于对不同的菌株适合的方法总是有所区别的。本发明通过查阅参考文献，针对转化中影响转化的因素对Y179菌株进行了实验，利用电转化的方法可以获得较高的转化效率，达到104个/μg DNA(转化结果见图3)，利用完整转化方法对Y179菌株转化时所获得的转化效率没有电击法高只有103个/μg DNA，但是由于其使用的方法简便，因此也很值得使用。
(一)完整细胞转化方法
1、接种单菌落到3mlYEPD中30℃振荡培养过夜。
2、将过夜培养物稀释到50mlYEPD(可做10管)中使起始浓度为O.D600＝0.08，置30℃振荡培养4.5h到O.D600＝0.32。(起始浓度和培养时间对于转化效率的高低影响很大。)3、5K，5min离心收集菌体4、弃培养液，加入无菌水5K，5min离心收集菌体。
5、用无菌水再洗一次，5K，5min离心收集菌体。
6、加入10ml 0.1M LiAC 30℃水浴10min，将细胞分装到1.5ml离心管中，每管1ml。
7、高速离心细胞，弃上清。
8、在每管中加入如下溶液50ul 0.1M LiAC10ul 5mg/ml ssDNA10ul转化DNA340ul PEG(50％w/v)/LiAC/H2O(8∶1∶1)9、轻轻混匀细胞，至于30℃水浴30分钟，然后42℃热击25分钟。
10、高速离心收集菌体，弃上清，加100ul无菌水涂SD平板。
(二)电转化方法1、接单菌落到YEPD培养基中，30℃振荡过夜培养。
2、将过夜培养液按1％接种量接种到50mlYEPD液体培养基中，30℃培养到O.D600为1.2-1.3左右。以下所有操作应在冰上进行。
3、5K 5min 4℃离心收集菌体。
4、用等体积的冰水洗一次，5K 5min 4℃离心收集菌体。
5、用1/2体积的冰水再洗一次，5K 5min 4℃离心收集菌体。
6、用10ml 1M山梨醇洗一次5K 5min 4℃离心收集菌体。
7、用10ml 1M山梨醇再洗一次5K 5min 4℃离心收集菌体。
8、悬浮细胞到800ul 1M山梨醇中。
9、取80ul细胞和小于5ul的DNA混合，加入到电极杯中。
10、1.5kv 200Ω 25uF电击。
11、立即加入1ml1M山梨醇，30℃温浴1h。
12、离心后涂SD平板。
本发明涉及的URA3基因序列如下序列特征长度801bp，类型核酸，链数双链几何结构线形分子类型DNA(基因组)来源克隆鹰嘴豆克鲁维酵母乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶序列描述SEQ 1atgtcgacta agagttactc ggaaagagca gctgctcata gaagtccagt tgctgccaag 60cttttaaact tgatggaaga gaagaagtca aacttatgtg cttctcttga tgttcgtaaa 120acagcagagt tgttaagatt agttgaggtt ttgggtccat atatctgtct attgaagaca 180catgtagata tcttggagga tttcagcttt gagaatacca ttgtgccgtt gaagcaatta 240gcagagaaac acaagttttt gatatttgaa gacaggaagt ttgccgacat tgggaacact 300gttaaattac aatacacgtc tggtgtatac cgtatcgccg aatggtctga tatcaccaat 360gcacacggtg tgactggtgc gggcattgtt gctggtttga agcaaggtgc cgaggaagtt 420acaaaagaac ctagagggtt gttaatgctt gccgagttat cgtccaaggg gtctctagcg 480cacggtgaat acactcgtgg gaccgtggaa attgccaaga gtgataagga ctttgttatt 540ggatttattg ctcaaaacga tatgggtgga agagaagagg gctacgattg gttgatcatg 600acgccaggtg ttggtcttga tgacaaaggt gatgctttgg gacaacaata cagaactgtg 660gatgaagttg ttgccggtgg atcagacatc attattgttg gtagaggtct tttcgcaaag 720ggaagagatc ctgtagtgga aggtgagaga tacagaaagg cgggatggga cgcttacttg 780aagagagtag gcagatccgc ttaa 80权利要求
1.鹰嘴豆克鲁维酵母表达系统，其特征是包括宿主菌鹰嘴豆克鲁维酵母，将外源基因导入宿主的多核苷酸载体，将带有外源基因表达单元的多核苷酸载体转入宿主菌的转化方法，以及构建的带有外源基因的鹰嘴豆克鲁维酵母基因工程菌株。
2.根据权利要求1所述的表达系统，其特征是所说的宿主菌带有特定选择标记，且容易筛选转化子，包括营养缺陷型、抗生素抗性或者其他反选择标记。
3.根据权利要求2所述的表达系统，其特征是所说的营养缺陷型标记包括，营养缺陷型基因URA3、组氨酸缺陷型基因HIS3、LEU2、HIS4、TRP1、ADE2。
4.根据权利要求2所述的表达系统，其特征是所说的抗生素抗性选择标记包括G418抗性基因、卡那霉素抗性基因、Zeocin抗性基因等。
5.根据权利要求2所述的反选择标记包括URA3、SacB基因。
6.根据权利要求2、3、4或5所述的表达系统，其特征是提供了选择标记与温度敏感等性质结合选择转化子的方法。
7.根据权利要求1所述的表达系统，其特征是所说的载体为游离型载体pUK1和pKSUKD，包括果蝇克鲁维中自主复制序列pKD1和在乳酸克鲁维酵母中的pK1序列，选择标记是鹰嘴豆克鲁维酵母的营养缺陷型基因URA3(SEQ1)。
8.根据权利要求1所述的表达系统，其特征是所说的宿主是鹰嘴豆克鲁维酵母的变异菌株Y179U-，在其URA3基因的93位密码子点突变，一个T变成了G，丝氨酸变成了精氨酸，该菌株的表型为ura缺陷的菌株。
9.根据权利要求1所述的表达系统，其特征是所说的基因工程菌带有特定的外源基因，包括编码乙型肝炎病毒表面抗原，肿瘤坏死因子及其受体，淋巴毒素，人干扰素。
10.根据权利要求1所述的表达系统，其特征是所说的转化方法包括以下步骤a.接单菌落到YEPD培养基中，30℃振荡过夜培养；b.将过夜培养液按1％接种量接种到YEPD液体培养基中，30℃培养到O.D600为1.2-1.3左右；以下所有操作应在冰上进行；c.5K 5min 4℃离心收集菌体；d.用等体积的冰水洗一次，5K 5min 4℃离心收集菌体；e.用1/2体积的冰水再洗一次，5K 5min 4℃离心收集菌体；f.用10ml 1M山梨醇洗一次5K 5min 4℃离心收集菌体，用10ml 1M山梨醇再洗一次5K 5min 4℃离心收集菌体，悬浮细胞到800ul 1M山梨醇中，取80ul细胞和小于5ul的DNA混合，加入到电极杯中；g.1.5kv 200Ω 25uF电击；h.立即加入1ml1M山梨醇，30℃温浴1h。i.离心后涂SD平板。
全文摘要
本发明提供了可用基因工程宿主菌的营养缺陷型鹰嘴豆克鲁维酵母，利用该菌株的URA3基因构建的多核苷酸载体，将外源基因转入宿主菌的化学与电转化方法，以及所获得的带有特定外源基因的基因工程鹰嘴豆克鲁维酵母菌株。
文档编号C12N15/12GK1408876SQ02137040
公开日2003年4月9日 申请日期2002年9月18日 优先权日2002年9月18日
发明者李育阳, 张晋, 徐帆洪, 文铁桥, 邸玉君, 霍克克 申请人:复旦大学