表达抗体或抗体类似物的重组克鲁维酵母菌及其构建方法与应用的制作方法

专利名称：表达抗体或抗体类似物的重组克鲁维酵母菌及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及表达抗体或抗体类似物的重组克鲁维酵母菌及其构建方法与应用。
背景技术：
抗体(Antibody, Ab)是一种与抗原特异性结合的糖蛋白。天然抗体约150 000 道尔顿，由两个相同的轻链(Light Chain, L)和两个相同的重链(Heavy Chain, H) 组成。轻链与重链通过一个共价二硫键相连。每条重链由一个可变区(VH)和多个恒 定区组成。每条轻链由一个可变区(VL)和一个恒定区组成；轻链的恒定区与重链的 第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。木瓜蛋白酶消化抗体可产生 两个相同的抗原结合片段(称为"Fab"片段，每个片段有单个抗原结合位点)以及一 个残余的"Fc"片段(可结晶的片段，其分子量大约为50 000)。用胃蛋白酶处理产 生一个F(ab， )2片段，该片段有两个抗原结合位点，并仍能与抗原交联(黄志伟，王 琰.抗体工程.第二版.北京北京医科大学出版社，2002)。
抗体分子的突出特点是其分子结构的双重性识别不同抗原需要结构上的多样性， 与体内效应系统相互作用需要结构的恒定性。这使抗体分子成为体内最复杂的分子， 长期以来一直是人们研究的热点。抗体在生物医学领域中的应用极为广泛，其制备技 术经历了从多克隆抗血清、单克隆抗体到基因工程抗体等三个发展阶段。
近5年来，随着生物技术的发展，人鼠嵌合抗体、人源化抗体和人抗体技术及制 备技术的成熟，基本上克服了鼠源性抗体在人体应用时产生抗抗体的问题；同时由于 在人鼠嵌合抗体、人源化抗体和人抗体中采用人的Fc片段，在人体内的半衰期从鼠源 性抗体的小于20小时到人源化抗体和人抗体的半衰期为数天、甚至到21天之久。同 时.，抗体库的建立和筛选以及多价重组抗体制备技术的发展使人们能够直接获得特异 性强、亲和力高的单克隆抗体，如SLAM法(Selected Lymphocyte Antibody Method) 制备的抗体的亲和力比杂交瘤技术制备的抗体的亲和力提高1000倍。抗体技术的发展 使导向治疗研究走出低谷，并在近几年取得了突破性进展，应用抗体治疗疾病初显曙 光(陈志南，刘民培.抗体分子与肿瘤.北京人民军医出版社，2002)。
但目前对于抗体治疗疾病仍存在着两个难题 一是由于治疗疾病的抗体需要量极 多，目前的生物工程生产比较困难，同时由于需要量极多，要求其产品纯度极高，因 此产品生产成本高、产品价格昂贵。二是对于很多疾病而言，需要抗体长期应用，才能达到治疗疾病的目的。以美国批准上市的治疗肿瘤的人源化抗体Rituxan和 Herc印tin为例，Rituxan—个疗程约需用药l. 2g,Herc印tin—个疗程约需用药0. 88g; 而抗vEGF人源化抗体， 一个病人的最大用药量甚至达到了7.8g，这些抗体类生物制 品比细胞因子类生物制品用药量高出了几万倍(黄志伟，王琰.抗体工程.第二版.北 京北京医科大学出版社，2002)。
在抗体研究中，小分子抗体成为研究的热点。通过保留抗体上的抗原特异性结合 区域，构建获得无Fc段、分子量较小、具抗原结合功能的分子片段的小分子抗体，其 易于穿透血管壁和组织屏障进入病灶，有利于肿瘤的诊断和治疗；免疫原性强，可作 为载体分子偶联多种活性蛋白基因如酶、毒素等用于疾病的导向性治疗，且不需进行 糖基化修饰，可在大肠杆菌中表达。小分子抗体可改善抗体的药代动力学特性，并适 合于临床的应用。这种经改造后的小分子抗体，根据其价数的不同可分为单价及多价 两种。单价小分子抗体根据构建的方法不同，可分为Fab抗体、单链抗体、二硫键抗 体、单域抗体和超变区多肽。在ScFv的基础上，可以把两个或两个以上的ScFv重组 在一起，由此可制备成多价的小分子抗体即微型抗体(简称多价微抗)。其中包括双链 抗体(diabody)，双特异性抗体(bispecific antibody),微型抗体(minibody)，三链 抗体(triabody)及四链抗体(tetrabody)等(李智华.基因工程抗体研究进展.云南医 药，2004， (25)1:74-78)。
但是小分子抗体由于其缺乏Fc段，在体内的半衰期縮短，同时也难以发挥Fc段 介导的靶细胞杀伤和促进细胞吞噬以及诱发生物活性物质释放等生物学效应。构建抗 体融合蛋白，就可利用Fc段所特有的生物学效应功能，将某些具有特异识别及结合功 能的蛋白分子(如细胞膜受体)与抗体Fc段融合。融合蛋白中Fc段可以提供以下主 要功能①增加融合蛋白在血液中的半衰期，如CD4-Fc融合蛋白比相应CD4分子在血 液中的半衰期长200倍；②通过该蛋白分子与其配体的相互作用将Fc的生物学效应引 导到特定目标，包括ADCC、固定补体及调理作用等；③利用Fc段的某些特性，如与 蛋白A结合或与抗Ig结合等，用于融合蛋白的纯化及检测。
克鲁维酵母是一种生产安全、表达水平高、易于进行工业发酵规模的优良表达系 统，例如其中的乳酸克鲁维酵母(Z/w/rero/Hyces 7a"A， ￡ "c"s )表达系统， 与酉良酒酵母(5"acc力3ro/z7yces cereKJ'57'se， 51 cereKZ'57'se)表达系统、巴斯德毕赤酵 母Wc/ i3/ astori5v尸./jaWarz.s)表达系统、汉逊酵母(泡/^朋〃73/ a ，a 7 A3, 《pW/z^r/^a)表达系统并称为"酵母四大表达系统"，它们既具有原核生物易于培 养、培养成本低廉、繁殖快、便于大规模培养和高密度发酵等特性，同时又具有真核生物的蛋白翻译后修饰功能，例如糖基化过程等。克鲁维酵母作为一种应用广泛的外 源基因表达系统，除了具有上述酵母表达系统共有的特点外，还具有以下优点①表
达系统安全(Generally Recognized As Safe, GRAS)，例如￡ 7ac"s已经美国FDA (Food and Drug Administration)确定由其制备的乳糖酶和凝乳酶是安全的，被批准 可以用以食品医药工业；②克鲁维酵母属——乳酸克鲁维酵母全基因组测序已经完成， 基因组序列已公开，遗传背景清楚，有利于遗传操作；③培养成分简单，成本低廉， 易放大，具备良好的工业发酵规模特性，例如用乳酸克鲁维酵母在生产凝乳酶的工业 发酵规模已超过100m、④不同于甲醇营养型酵母(例如巴斯德毕赤酵母尸.pas"n、)， 克鲁维酵母不需要添加甲醇，医药、食品和工业生产用更安全；⑤具有良好的分泌能 力，外源蛋白表达水平高，例如乳酸克鲁维酵母表达人血清白蛋白可达3.3 g/L。但 克鲁维酵母与其他酵母相比，在诸多方面也有所不同，例如受不同的启动子调控，不 同的诱导表达条件，不同程度的翻译后糖基化修饰，不同的发酵条件，不同的遗传背 景及遗传操作性等等，因此克鲁维酵母体系表达载体构建、蛋白表达及优化有着其自 身的特点，需要建立独立而完整的研究体系。
目前利用克鲁维酵母表达的抗体均为小分子抗体，如单链抗体(ScFv)，它们均 不含有Fc片段，如抗Ras单链抗体(Swen画D, ef a丄Secretion of active anti-Ras single-chain Fv antibody by the yeasts y"arrcwj.a h tica and ^7u"aro輝ces iacfj's. Microbiology, 2002,148:41 - 50.)和抗4B2单链抗体(Robin S， a丄 Comparison of three microbial hosts for the expression of an active catalytic scFv. Mol Ifflmunol， 2003,39: 729 - 738.)。而用于含Fc片段的完全抗体和抗体类 似物表达比较成熟和应用最多的系统是哺乳动物细胞表达系统，但哺乳动物细胞表达 系统存在构建周期长、操作烦琐，表达产量相对低，生产成本较高等缺点。而具备成 本低廉、易放大、具备良好的工业发酵规模特性的克鲁维酵母，到目前为止，却没有 用于表达完全抗体及含抗体Fc片段抗体类似物的研究报道。

发明内容
本发明的目的是提供一种表达抗体或抗体类似物的重组克鲁维酵母菌及其构建方 法与应用。
本发明所提供的构建表达抗体或抗体类似物的重组克鲁维酵母菌的方法，是将抗
体的编码基因或抗体类似物的编码基因导入克鲁维酵母中获得重组菌；所述抗体类似 物为抗体的FC片段与蛋白或蛋白亚基形成融合蛋白；所述抗体的编码基因为抗体的重 链编码基因和轻链编码基因。其中抗体可以为已报道和公开的抗体分子，如01^03^^@ (抗TAG-72)， 0RTH0CL0NE 0KT (抗CD3) ， ReoPro Abciximab (抗GP Ilb/IIIa rec印tor) ， Verluraa T99 nofetumomab merpentan (抗small-cell lung cancer) ， Rituxan Ritiximab (抗 CD20) ， Zenapax daclizumab (抗IL-2R) ， Herc印tin⑧Trastuzumab (抗HER2)， Remicade infliximab (抗TNFa) ， Siroulect (抗CD25)等等。编码各类抗体的轻、 重链的核苷酸序列，及其氨基酸序列均可以从美国国立生物技术信息中心NCBI (http:〃ww. ncbi. nlra. nih. gov/)或者欧洲分子生物实验室EMBL (http:〃www. embl.org)公开的数据库中获得，或者从各种相关文献中获得。轻链或 者重链的编码基因可以用PCR方法(Saiki等，Science. 239: 487-491, 1998) 、 RT-PCR 方法、人工合成的方法或构建筛选cDNA文库等方法获得，用作PCR模板或用于构建 cDNA文库的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织、细胞、及文 库等，也可以用人工合成的方法获得，获得基因的方法可采用本领域周知的分子生物 学方法(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995)。 人工合成时可选用宿主偏爱的密码子，这样往往可以提高产物的表达。若需要，可用 本领域周知的方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入和与其它多聚核苷酸连接等。
轻链编码基因可与酵母表达载体连接、重链编码基因也可与酵母表达载体的连接 或者同时将轻链编码基因和重链编码基因与酵母表达载体进行连接，构建含轻重链编 码基因串联表达盒的重组表达载体。编码抗体轻链的核苷酸序列和(或)编码重链的 核苷酸序列的密码子组成可都适应于给定的克鲁维酵母宿主基因的密码子偏倚。构建 方法采用本领域周知的分子生物学方法(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指 南》第二版，科学出版社，1995)。酵母表达载体可以选用各种酵母表达载体，可以 带有复制位点，筛选标记等，这些载体的构建方法已在许多文献中公开(J.萨姆布鲁 克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995)，也可以从各种公司购得 (如Invitrogen life technologies, carlsbad, California 92008， USA; New England BioLabs， NEB， Ipswich, MA)。优选的载体有pYES2、 pKLACl等(郭葆玉.基因工程 药学.第二军医大学出版社2000)。表达载体可以带有各种诱导型或组成型启动子， 优选诱导型启动子，这样有利于提高表达量。诱导型启动子如LAC4 (Paul A. Colussi et al. Kluyveromyces lactis LAC4 promoter variants that lack function in bacteria but retain full function in yeast. Applied and Environmental Microbiology, 71 (11): 7092 - 7098， 2005) 、 PH05 (Encarnacion Ferminan et al， The K1PH05 gene encoding a r印ressible acid phosphatase in the yeast Kluyveromyceslactis: cloning, sequencing and transcriptional analysis of the gene， and purification and properties of the enzyme. Microbiology, 143: 2615 - 2625， 1997)、 ADH4(Michele Saliola et al. Use of the K1ADH4 promoter for ethanol-dependent production of recombinant human serum albumin in Kluyveromyces lactis. Applied and Environmental Microbiology, 65(1): 53-60， 1999 );组成型启动子如PGK (Gerd Gellissen et al. Application of yeasts in gene expression studies: a comparison of Saccharomyces cerevisiae， Hansenula polymorpha and Kluyveromyces lactis. Gene， 190(1): 87-97， 1997)。表达载体还 需要有该载体整合至酵母基因组染色体上所需要的同源序列，序列的长短以能发生同 源重组为佳。其中实施例1和2以抗HER2单克隆抗体为例，所述抗体的重链编码基因 具体可为序列表中序列l自5'末端第256-1605位，所述抗体的轻链编码基因具体可 为序列表中序列2自5'末端第256-897位。其他抗体的核苷酸序列可以采用本领域 周知的分子生物学方法来替代抗HER2抗体的序列(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克 隆实验指南》第二版，科学出版社，1995)，如利用限制性酶切位点进行替换而获得 相应的抗体表达载体。
抗体类似物为抗体的Fc片段与蛋白或蛋白亚基形成融合蛋白，所述融合蛋白通过 Fc上的二硫键形成类似抗体的二聚体结构的蛋白。构建抗体类似物时可以利用Fc段 所特有的生物学效应功能，将某些具有特异识别及结合功能的蛋白(如细胞膜受体) 与抗体Fc段融合。此融合蛋白中Fc段所提供的功能主要为1)增加融合蛋白在血液 中的半衰期，如CD4-Fc融合蛋白比相应CD4分子在血液中的半衰期长200倍；2)通 过该蛋白分子与其配体的相互作用将Fc的生物学效应引导到特定目标，包括ADCC、 固定补体及调理作用等；3)利用Fc段的某些特性，如与蛋白A结合或与抗Ig结合等， 用于融合蛋白的纯化及检测。所述抗体的Fc片段选自如下任一抗体IgGl、IgG2、IgG3、 IgG4、 IgM、 IgAl、 IgA2、 IgD和IgE。抗体的Fc片段的核苷酸序列，及其氨基酸序列 均可以从美国国立生物技术信息中心NCBI (http:〃www. ncbi.nlm.nih.gov/)或者欧 洲分子生物实验室EMBL (http:〃www. embl.org)公开的数据库中获得，或者从各种 相关文献中获得。与Fc融合的蛋白的多聚核苷酸序列也可以从美国国立生物技术信息 中心NCBI (http:〃www. ncbi.nlm.nih.gov/)或者欧洲分子生物实验室EMBL (http:〃www. embl.org)公开的数据库中获得，或者从各种相关文献中获得。Fc片 段与蛋白或蛋白亚基形成融合蛋白的编码基因可以用PCR方法(Saiki等，Science. 239 487-491， 1998) 、 RT-PCR方法、人工合成的方法或构建筛选cDNA文库等方法获得，用作PCR模板或用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应raRNA或 cDNA的组织、细胞及文库等，可以用人工合成的方法获得。人工合成时可选用宿主偏 爱的密码子，这样往往可以提高产物的表达。若需要，可用本领域周知的方法对多聚 核苷酸进行突变、缺失、插入和与其它多聚核苷酸连接等。编码抗体Fc和与之融合的 蛋白的多聚核苷酸的连接，在保持各自阅读框架不变的前提下，可以用本领域周知的 各种方法，如通过重叠PCR的方法。如果需要可在本发明的编码融合蛋白基因的两侧 引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸可有限制性内切酶识别位点。可用本领域公知的 方法将含编码融合蛋白序列的核酸克隆到各种表达载体中去。所用标准的分子克隆过 程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社， 1995.)的叙述。抗体类似物中Fc段的选择其理论基于抗体Fc段所特有的生物学效应 功能，如某些具有特异识别及结合功能的蛋白分子(如细胞膜受体)与抗体Fc段融合。 转化各种重组构建载体(即全抗体表达载体或者抗体类似物表达载体)至酵母宿主细 胞中去可用通常的方法，如电穿孔，制备感受态的原生质球等。成功转化的细胞， 可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细胞经收集并裂解，提取DNA，然后PCR方法鉴 定。或者，细胞培养上清中或细胞破碎液中的蛋白可用抗IgFc的抗体的ELISA或 Western分析鉴定。
所述克鲁维酵母菌为乳酸克鲁维酵母(A7w7「ei^^ces^cWs)、脆壁克鲁维酵 母(A7w，ejr。/zi7ces尸r柳7i51)、鹰嘴豆饱克鲁维酵母(A7i/"ero/z7/ces1 c/ce"'印oms) 或马克思克鲁维酵母菌(A7〃，ero,ces鹏m.a加50 。
乳酸克鲁维酵母被认为是一种安全，易于遗传操作，基因组序列清楚，能高效表 达异源蛋白并且具备工业规模的发酵特性，已成为用于食品工业和药用蛋白生产的最 佳宿主酵母之一。因此，本发明中的出发菌株优选乳酸克鲁维酵母菌。
所述克鲁维酵母菌还可为a-l，6-甘露糖转移酶基因(0CH1)或/和a-l，3-甘露 糖转移酶基因(MNN1)灭活的重组克鲁维酵母菌。上述重组克鲁维酵母突变菌表达的 糖蛋白不存在过度糖基化现象，即菌株表达的糖蛋白为低糖基化蛋白，例如抗体(具 体见实施例2)，与野生型克鲁维酵母菌表达的过度糖基化蛋白相比，N-糖链上的糖 基明显减少。该低糖基化糖蛋白避免了过度糖基化引起的高免疫原性、对活性位点的 遮蔽等问题，且消除了不均一性，因而在临床医疗和工业上有更广泛的应用前景。所 述a -1， 6-甘露糖转移酶基因和/或a-1,3-甘露糖转移酶基因灭活的重组克鲁维酵母 菌可以通过敲除其甘露糖转移酶基因的部分编码序列获得。该序列至少大于三个碱基， 较优的是大于100个碱基，更优的是包括50%以上的编码序列，最优的是缺失"F7 80%和扁W 100%编码序列。这种通过敲除甘露糖转移酶基因的部分序列获得的菌株不易
产生回复突变，菌株的稳定性比利用点突变等方法构建的稳定性更高，更有利于应用
于医疗和工业。具体可为乳酸克鲁维酵母a -1, 6-甘露糖转移酶(^E/)缺陷菌(KLGE02， 保藏号为CGMCCNo.2400)，或a -1， 6-甘露糖转移酶和a -1， 3-甘露糖转移酶(MW) 基因双缺陷酵母菌(KLGE03，保藏号为CGMCC No. 2401)。
编码抗体或抗体类似物的核苷酸，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存 在。这些蛋白可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，优选的是从宿主 中分泌出来。分泌所用的信号肽，可以为酵母a交配因子信号肽、人血白蛋白信号肽 或鸡溶菌酶信号肽等，优选的是用酵母a交配因子信号肽。
由所述方法构建的表达抗体或抗体类似物的重组克鲁维酵母菌也属于本发明的保 护范围。
本发明的另 一个目的是提供一种制备抗体或抗体类似物的方法。 本发明所提供的制备抗体及抗体类似物的方法，是培养所述表达抗体或抗体类似 物的重组克鲁维酵母菌生产完全抗体或抗体类似物。
培养所述表达抗体或抗体类似物的重组克鲁维酵母菌，可以用摇瓶或生物反应器 等，生产时优选的为生物反应器，如发酵罐。培养基应能提供菌体(或细胞)生长和 产物表达所需的物质，应包含氮源、碳源、维生素、微量元素、pH缓冲成分等，培养 基配方一般应根据不同培养对象，通过试验获得。培养可以用一阶段培养，即菌体生 长的同时，合成目的蛋白。也可以分两个阶段，第一阶段主要用于菌体的生长，第二 阶段主要用于蛋白合成。所述纯化制备抗体及抗体类似物的方法为液相层析，优选蛋 白A亲和层析。可以用各种蛋白分离的方法分离、纯化抗体或抗体类似物，可以根据 待纯化特定蛋白的性质决定纯化方案。如盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些 技术的组合。其中液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技 术。
实现抗体(包括完全抗体及其类似物)的表达要解决多个难点问题，首要问题在 于解决制备的抗体最终需要形成二聚体结构，这需要利用Fc片段上的二硫键自发装配 组成，其他还包括完全抗体中轻链和重链两个亚基的同时表达，这涉及轻重链的正确 折叠，轻链和重链之间的正确装配，分泌表达过程中抗体恒定区糖基化等翻译后加工 修饰，分泌表达形式，以及最终抗体是否具有良好生物活性等问题。本发明通过构建 完全抗体轻重链双表达盒，及Fc片段融合的抗体类似物表达盒，利用插入方式将表达 盒整合至克鲁维酵母特定染色体区域中并使其得到稳定表达，筛选确定了在克鲁维酵母中高效表达抗体的最佳启动子及分泌信号，最终成功实现抗体及其类似物在克鲁维 酵母中的表达。其中抗体类似物能够通过Fc片段二硫键装配成类似于抗体的二聚体结 构。本发明的一种制备抗体或抗体类似物的方法不仅解决了完全抗体表达时轻链和重
链的分泌表达问题，而且通过还原和非还原SDS-PAGE,以及活性分析结果表明抗体轻 链和重链能够在克鲁维酵母中自发通过二硫键装配成正确的抗体结构，抗体类似物也 能够通过Fc片段上的二硫键装配成类似于抗体的二聚体结构，从而解决了抗体及抗体 类似物在克鲁维酵母中的正确表达、折叠和装配等问题，因而显示出良好的应用前景。 本发明的制备抗体或抗体类似物的方法，是将抗体或抗体类似物的基因导入克鲁 维酵母中获得完全抗体或抗体类似物。其中，克鲁维酵母是单细胞低等真核生物，具
有原核生物易于培养、培养成本低廉、繁殖快、便于大规模培养和高密度发酵等特性， 又具有真核生物的蛋白折叠、糖基化等翻译后修饰过程，还能将外源蛋白分泌到培养
液中，利于纯化的特性。尤其是乳酸克鲁维酵母，它不仅和酿酒酵母一样具有公开的 基因组序列，利用遗传操作的优点，而且又具有毕赤酵母表达水平高，易于工业化生 产的特点，同时乳酸克鲁维酵母工业、医药和食品生产更安全(GRAS)，是一种易于 进行工业发酵规模的优良表达系统。本发明利用所述表达抗体或抗体类似物的重组克 鲁维酵母菌制备抗体及抗体类似物，既可以解决生产抗体比较困难、要求产品纯度高、 数量大等瓶颈，又可以发挥抗体Fc段提供的功能，如增加抗体及抗体类似物在血液中 的半衰期，发挥Fc段介导的靶细胞杀伤和促进细胞吞噬以及诱发生物活性物质释放等 生物学效应，因而具有良好的应用前景。


图1为抗HER2人源化单克隆抗体的轻链基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图 1:轻链(Chain Light, CL)基因(650bp) ; M: DNA分子量标准。 图2为抗HER2人源化单克隆抗体的重链基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图 1:重链(Heavy Light, HL)基因(1200bp) ; M: DNA分子量标准 图3为野生型菌株表达抗HER2人源化单克隆抗体还原SDS-PAGE 1: IgG标准品；2.阴性对照—乳酸克鲁维酵母(空质粒)；3和4:表达的抗HER2 人源化单克隆抗体；M:蛋白分子量标准，自上而下分别为97， 66， 43， 31， 20 KD。 图4为野生型菌株表达抗HER2人源化单克隆抗体非还原SDS-PAGE
1:表达的抗HER2人源化单克隆抗体；2: IgG标准品；M:蛋白分子量标准
图5为野生型菌株表达抗HER2抗体的Western blotting和SDS-PAGE分析
A为抗HER2人源化单克隆抗体的Western blotting分析；B为抗HER2人源化单克隆抗体的SDS-PAGE分析；1: IgG标准品经PNGaseF酶切处理；2: IgG标准品；3: 抗HER2人源化单克隆抗体纯化样品经PNGaseF酶切处理；4:抗HER2人源化单克隆抗 体纯化样品；M:蛋白分子量标准。
图6为野生型菌株表达抗HER2抗体对细胞增殖的抑制作用
A为抗HER2抗体对SKBR3细胞增殖的抑制作用；B为抗HER2抗体对MCF7细胞增 殖的抑制作用。
图7为乳酸克鲁维酵母变构体CGMCC No. 2400表达抗HER2抗体还原SDS-PAGE 1.阴性对照一乳酸克鲁维酵母(转入空质粒)；2、 3和4:抗HER2人源化单克 隆抗体；5: IgG标准品；M:蛋白分子量标准。
图8为乳酸克鲁维酵母变构体CGMCC No. 2401表达抗HER2抗体还原SDS-PAGE
1: IgG标准品；2:抗服R2人源化单克隆抗体；M:蛋白分子量标准
图9为乳酸克鲁维酵母变构体CGMCC No. 2400表达抗HER2抗体非还原SDS-PAGE
1: IgG标准品；2:抗HER2人源化单克隆抗体；M:蛋白分子量标准
图10为乳酸克鲁维酵母变构体CGMCC No. 2401表达抗HER2抗体非还原SDS-PAGE
1: IgG标准品；2:抗HER2人源化单克隆抗体；M:蛋白分子量标准
图11为CGMCC No. 2400菌株表达抗HER2抗体对SKBR3细胞增殖的抑制作用 图12为CGMCC No. 2401菌株表达抗HER2抗体对SKBR3细胞增殖的抑制作用 图13为人sTNFRII和IgGFc基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图 1: DNA分子量标准；2:人IgGFc基因(约700bp) ; 3:人sTNFRII基因(约700bp) 图14为人sTNFRII和IgGFc融合基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图 1: DNA分子量标准；2 :人sTNFRII和IgGFc的融合基因片段(约1. 4 kb) 图15为pKLACl-sTNFRII-IgGFc质粒结构示意图。 图16为抗体类似物sTNFRII-IgGFc融合蛋白的还原和非还原SDS-PAGE 1:还原电泳；2:非还原电泳；M:蛋白中分子量标准。 图17为抗体类似物sTNFRII-IgGFc融合蛋白纯度扫描分析。 图18为抗体类似物sTNFRII-IgGFc融合蛋白对TNF-a活性的抑制作用。 图19为乳酸克鲁维酵母变构体高效表达抗体类似物sTNFRII-IgGFc融合蛋白还原 SDS-PAGE
1:乳酸克鲁维酵母变构体高效表达抗体类似物sTNFRII-IgGFc; 2:乳酸克鲁维 酵母野生型ATCC8585高效表达抗体类似物sTNFRII-IgGFc; M.蛋白分子量标准。 图20为乳酸克鲁维酵母变构体CGMCC No. 2400抗体类似物sTNFRII-IgGFc融合蛋白对TNF-a活性的抑制作用。
图21为乳酸克鲁维酵母变构体CGMCCNo. 2401抗体类似物sTNFRII-IgGFc融合蛋 白对TNF-a活性的抑制作用。
具体实施例方式
本发明中使用的Pyrobest酶、LATaq酶、dNTPs、限制性内切酶、T4连接酶等购 自大连宝生物工程有限公司，pfu酶、试剂盒、DH5a感受态细胞、引物合成、测序等 由上海生工生物工程技术服务有限公司提供和北京博大泰克生物基因技术有限公司提 供，PNGF糖苷酶、pKLACl质粒等购自New England BioLabs (NEB， Ipswich, MA)。
抗HER2人源化单克隆抗体是一种可与HER2受体胞外区特异性结合、抑制肿瘤细 胞生长，使过量表达HER2受体的肿瘤细胞对细胞毒性因子更敏感的单克隆抗体，可用 于治疗过量表达HER2受体的肿瘤。
实施例1、抗HER2人源化单克隆抗体在乳酸克鲁维酵母中的表达
1. 抗HER2人源化单克隆抗体全基因的获得
按照Genbank上报道的抗HER2人源化单克隆抗体轻重链序列(Genbank: AAB49171.4和AAB48814. 1)以及酵母偏爱密码子，同义突变掉常用酶切位点。利用全 基因合成方式， 一步PCR方法获得抗体轻链基因(Light chain) L片段(序列表中的 序列2)和重链基因H (Heavy chain)片段(序列表中的序列1)，且带有a交配因 子信号肽。
一步PCR方法参见J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》(第二版，科学出版 社，1995) 。 PCR扩增条件如下:94。C变性5min后，按照94。C变性30sec、 60。C复性 30sec、 72。C延伸40sec进行55次循环，最后72。C延伸10min;抗HER2人源化单克隆 抗体的轻重链基因目的片段大小分别为650bp和1200bp。 PCR扩增的产物用0. 8 %的 琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1和图2)，目的片段切胶后用DNA片段纯化回收试剂盒回 收(购自鼎国生物技术有限公司，北京)。
2. 抗体轻重链表达载体的构建
(1)含表达框、整合位点的抗体轻链表达载体的构建 用玻璃珠制备法(A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000) 提取乳酸克鲁维酵母ATCC8585 (American Type Culture Collection,美国典型微生 物菌种保藏中心，Manassas, VA 20108 USA)的基因组DNA，以该基因组DNA为模板 扩增a -1， 6-甘露糖转移酶(汉W7)基因两侧的同源臂，作为抗体轻链表达载体在染 色体上的整合位点，^7氾两侧的同源区分别为2kb。扩增"氾上游侧翼区同源臂(^F75'同源臂)所用的引物为KLOCH01和KLOCH02,引物序列分别为:
5' -ACTGCTAGCATGTGGAAGTGATCTGTGGAGA-3'(划线部分为yV力el识别位点)和
5' -ATCTAGGTACCTGAGAGCTCGTTGGAAAGACTGAAGATGAAAGCA-3';扩增^r氾下游侧翼区
同源臂(沉F7 3'同源臂)所用的引物为KLOCH03和KLOCH04，引物序列分别为
5' -CCAACGAGCTCTCAGGTACCTAGATCCATCAAATGATCACCGT-3'和
5' -GATACGCGTGTCACATACCGATTGATCGATAC-3'(划线部分为恵〃1识别位点)。两个同源 臂的PCR扩增条件如下94。C变性5min后，按照94。C变性30sec、 55。C复性30sec、 72。C延伸2min30sec进行30次循环，最后72。C延伸10min;目的片段大小在2kb左右。 将PCR产物用DNA回收纯化试剂盒纯化回收(购自鼎国生物技术有限公司，北京)。 利用重叠延伸PCR的方法融合沉F7 5'同源臂和3'同源臂(参见丄萨姆布鲁克等， 《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995)，以6^W5'同源臂和3'同源 臂PCR产物为模板，以KL0CH01/04为引物，PCR扩增条件如下:94。C变性5rain后， 按照94。C变性lmin、 55。C复性lmin、 72。C延伸4min30sec进行30次循环，最后72°C 延伸10min;目的片段大小在4 kb左右。PCR产物用DNA回收纯化试剂盒纯化回收。 M/el/i/7wI双酶切(宝生物工程有限公司，大连)嵌合体片段，酶切后的嵌合体片段 插入同样双酶切处理的载体pYES2 (购自Invitrogen Corp. USA)中，T4连接酶16°C 连接过夜，转化大肠杆菌DH5a，在含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB平板上筛选阳 性克隆。用M eI/#_/wI双酶切鉴定阳性克隆，将顺el和必wl酶切得到4000bp左右和 3000bp左右片段的重组载体命名为pYES2-ochl。
在重组载体pYES2-ochl基础上，以质粒pKLACl (New England BioLabs (NEB， Ipswich, MA)为模板扩增LAC4启动子，约1. 1 kb，及终止子片段，约700 bp，两端 带有iZ^I和5"aJI酶切位点。该启动子可以用半乳糖进行诱导表达，属于强诱导型启 动子。通过PCR方法融合了这两个片段，从而获得约1.8 kb LAC4表达盒。LAC4启动 子和终止子之间带有一个多克隆位点6^el-A^I-W"I，以利于分泌信号和目的基因的 插入和替换。
扩增LAC4启动子所用的引物为PLAC4-01和PLAC4-02,引物序列分别为 5' -TGCTCTAGACGGATGAAAGGGGAATCGTAT-3'(划线部分为i7 al识别位点)和 5' -CCACTAGTCTCGATGAGTATGTGTGTTTA-3'(划线部分为Spel识别位点)。
扩增LAC4终止子所用的引物为PLAC4-03和PLAC4-04，引物序列分别为 5' -TAAACACACATACTCATCGAGACTAGTACGGCGCGCCTGCGGCCGCTT-3'(划线部分分别为 Spel-^scl-iVotl识别位点)和5' -TATGAGCTCTCCCGATGTATGGGTTTGGTTGCCA-3'(划线部分为fed识别位点)。
PCR扩增启动子条件如下95。C预变性5 min，然后25个循环(94"变性30 s， 55。C复性30 s， 72。C延伸1 min 30 s) ， 72。C延伸10 min， 4 。C保存。
PCR扩增终止子条件如下95。C预变性5 min，然后25个循环(94"C变性30 s， 55。C复性30 s， 72。C延伸1 min) ， 72。C延伸10 min， 4 。C保存。
1%琼脂糖进行电泳回收(购自鼎国生物技术有限公司，北京)。
利用重叠延伸PCR的方法融合LAC4启动子和终止子(参见J.萨姆布鲁克等，《分 子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995)，以LAC4启动子和LAC4终止子PCR 产物为模板，以PLAC4-01/04为引物，PCR扩增条件如下95"C预变性5min后，按照 94。C变性30 s、 55。C复性30 s、 72。C延伸2min，进行25次循环，最后72。C延伸10min; 目的片段大小在2 kb左右。PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。Jte7/^c/ 双酶切嵌合体片段，酶切后的嵌合体片段插入同样双酶切处理的载体pYES2-ochl中， T4连接酶16。C连接过夜，转化大肠杆菌DH5a，在含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB 平板上筛选阳性克隆。用^;sl/&cl双酶切鉴定阳性克隆，将i^3l/5"acl酶切得到 7000bp左右和2000bp左右片段的重组载体命名为pYES2-ochl-LAC4。
^el/vV"I双酶切抗体轻链基因(Light chain) L片段(其核苷酸序列为序列表 中序列1)，酶切后的抗体轻链L片段插入同样双酶切处理的重组载体pYES2-ochl-LAC4 中，T4连接酶16。C连接过夜，转化大肠杆菌DH5a，在含氨苄青霉素(100yg/ml) 的LB平板上筛选阳性克隆。用5^el/y^tl双酶切鉴定阳性克隆，将6"pel/7fetl酶切得 到9000bp左右和700bp左右片段的重组载体命名为pYES2-ochl-LAC4-CL。 (2)含表达框、整合位点的抗体重链表达载体的构建
用玻璃珠制备法(A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000) 提取乳酸克鲁维酵母ATCC8585 (American Type Culture Collection,美国典型微生 物菌种保藏中心，Manassas, VA 20108 USA)的基因组DNA，以该基因组DNA为模板 扩增URA3基因两侧的同源臂，作为抗体重链表达载体在染色体上的整合位点，URA3 两侧的同源区分别为0.8 kb。扩增URA3上游侧翼区同源臂(URA35'同源臂)所用的 引物为KLURA3-1和KLURA3-2，引物序列分别为
5' —atc§g^￡^agcagtagcagcacccacaag—3'(戈'J线部分为j^777识另廿位点)禾口 5' -atagagctcaaatctagagtgcaactaattgacgggagt-3'(划线部分为5"acJ禾口 JT^g/识另寸 位点)；扩增URA3下游侧翼区同源臂(URA3 3'同源臂)所用的引物为KLURA3-3和 KLURA3-4，弓l物序歹!j分另U为5' -tctagatttgagctctatgagaatcagcgctccccatt-3'(戈U线部分为，a/禾口 Sac/识另lJ位点)禾口 5' -at服tcgacggcaatgaaatgcaaacc111cta-3' (划线部分为5^7J识别位点)。两个同源臂的PCR扩增条件如下94"C变性5min后， 按照94。C变性30sec、 55。C复性30sec、 72。C延伸lmin进行30次循环，最后72°。延 伸10min;目的片段大小在0. 8 kb左右。将PCR产物用DNA回收纯化试剂盒纯化回收 (购自鼎国生物技术有限公司，北京)。利用重叠延伸PCR的方法融合URA3 5'同源 臂和3'同源臂(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版 社，1995)，以URA3 5'同源臂和3'同源臂PCR产物为模板，以KLURA3-1和URA3-4 为引物，PCR扩增条件如下:94t变性5min后，按照94。C变性lmin、 55'C复性lmin、 72'C延伸2min30sec进行30次循环，最后72'C延伸10min;目的片段大小在1. 6 kb 左右。PCR产物用DNA回收纯化试剂盒纯化回收。^^J/A5k/J双酶切(宝生物工程有 限公司，大连)嵌合体片段，酶切后的嵌合体片段插入同样双酶切处理的pPICZaA(购 自Invitrogen Corp. USA)中，T4连接酶16。C连接过夜，转化大肠杆菌DH5 a ，在含 零霉素(Zeocin 25u g/ml，购自Invitrogen Corp. USA)的LB平板上筛选阳性克隆。 用^^iT/5^/双酶切鉴定阳性克隆，将^^7/J和5"a7/酶切得到约1500bp左右和2200bp 左右片段的重组载体命名为pPICZ a A-URA3。
在重组载体pPICZ a A- URA3基础上，以质粒pKLACl (New England BioLabs (NEB， Ipswich, MA)为模板扩增LAC4启动子，约1. 1 kb，及终止子片段，约700 bp，两端 带有/Z^I和&7I酶切位点。该启动子可以用半乳糖进行诱导表达，属于强诱导型启 动子。通过PCR方法融合了这两个片段，从而获得约1.8 kb LAC4表达盒。LAC4启动 子和终止子之间带有一个多克隆位点5^el-Ascl-#"1，以利于分泌信号和目的基因的 插入和替换。
扩增LAC4启动子所用的引物为PLAC4-01和PLAC4-02，引物序列分别为 5' -TGCTCTAGACGGATGAAAGGGGAATCGTAT-3'(划线部分为识别位点)和 5' -CCACTAGTCTCGATGAGTATGTGTGTTTA-3'(划线部分为Spel识别位点)。
扩增LAC4终止子所用的引物为PLAC4-03和PLAC4-04，引物序列分别为 5' -TAAACACACATACTCATCGAGACTAGTACGGCGCGCCTGCGGCCGCTT-3'(划线部分分别为 Spel-识别位点)和5' -TATGAGCTCTCCCGATGTATGGGTTTGGTTGCCA-3'(划线 部分为^cl识别位点)。
PCR扩增启动子条件如下95T:预变性5 min，然后25个循环(94。C变性30 s， 55。C复性30 s， 72。C延伸1 min 30 s) ， 72。C延伸10 min， 4 。C保存。
PCR扩增终止子条件如下95。C预变性5 min，然后25个循环(94。C变性30 s，55。C复性30 s， 72。C延伸1 min) ， 72。C延伸10 min， 4 。C保存。
1%琼脂糖进行电泳回收(购自鼎国生物技术有限公司，北京)。
利用重叠延伸PCR的方法融合LAC4启动子和终止子(参见J.萨姆布鲁克等，《分 子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995)，以LAC4启动子和LAC4终止子PCR 产物为模板，以PLAC4-01/04为引物，PCR扩增条件如下95'C预变性5min后，按照 94。C变性30 s、 55。C复性30 s、 72。C延伸2min，进行25次循环，最后72。C延伸l(Mn; 目的片段大小在2 kb左右。PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。/力s7/5"3c/ 双酶切嵌合体片段，酶切后的嵌合体片段插入同样双酶切处理的载体pYES2-ochl中， T4连接酶16。C连接过夜，转化大肠杆菌DH5a ，在含零霉素(Zeocin 25y g/ml)的 LB平板上筛选阳性克隆。用ItelAfecI双酶切鉴定阳性克隆，将Z&lAfecI酶切得到 4000bp左右和2000bp左右片段的重组载体命名为pPICZa A- URA3-LAC4。
^pel/yfefl双酶切抗体重链基因H片段(其核苷酸序列为序列表中序列2)，酶切 后的抗体重链基因H片段插入同样双酶切处理的重组载体pPICZ a A- URA3-LAC4中， T4连接酶16。C连接过夜，转化大肠杆菌DH5a，在含Zeocin (100ixg/ml)的LB平板 上筛选阳性克隆。用&eI/7V^I双酶切鉴定阳性克隆，将^elAV"I酶切得到6000bp 左右和1500bp左右片段的重组载体命名为pPICZ a A-ura3-LAC4-H。
3.抗HER2单克隆抗体在乳酸克鲁维酵母中的表达
采用电转化法将重组载体pYES2-ochl-LAC4-CL和pPICZ a A-ura3-LAC4-H转化入 乳酸克鲁维酵母ATCC8585中，电转化的方法为本领域所共知(如A.亚当斯等，《酵 母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)。电转化前，将上述表达载体 pYES2-ochl-LAC4-L和pPICZ a A-ura3-LAC4-H用5Val进行线性化。。
pYES2-ochl-LAC4-CL先电转入制备好的乳酸克鲁维酵母ATCC8585感受态细胞中， 涂布于MD培养基(YNB 1. 34g/100mL，生物素4X 1(Tg/100mL，葡萄糖2g/100mL，琼 脂1.5g/100mL)平板上。3(TC培养3-5天，待培养基上长出克隆后，随机挑取几个转 化子提取基因组DNA进行阳性克隆鉴定，再次制备该阳性克隆感受态细胞，将线性化 后的pPICZ a A-ura3-LAC4-H转入制备好的整合有抗体轻链片段的感受态细胞中，涂布 于YPDS/Zeocin培养基(lg/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，2g/100ml葡萄糖， 1M山梨醇，25ug/ml Zeocin)平板上，3(TC培养3-5天，待培养基上长出克隆后， 随机挑选的20个克隆进行诱导表达，含有整合表达片段的每一个菌株培养物，用无菌 枪头刮取约2 mm2的单克隆细胞，置于2ml YPGal培养液(lg/100ml酵母提取物， 2g/100ml蛋白胨，2g/100ml半乳糖)中重悬，30。C振荡培养(250-300rpm)，诱导72小时后离心取上清，用于融合蛋白的表达分析。以pYES2空载体和pPICZ a A空载 体共同转化的乳酸克鲁维酵母ATCC8585为阴性对照。 培养上清进行12%的还原型SDS-PAGE电泳。
SDS-PAGE电泳结果如图3所示，经考马斯亮蓝染色后，转入重组载体 pYES2-ochl-LAC4-CL和pPICZ a A-ura3-LAC4-H的乳酸克鲁维酵母ATCC8585的培养上 清在50KD和30KD处可看到明显的表达带，与阳性对照正常人血清IgG的条带大小相 似，与其理论分子量相符，pYES2空载体和pPICZciA空载体共同转化的乳酸克鲁维酵 母ATCC8585在50KD和30KD处无表达带。
4. 表达上清中抗体的纯化
取100ml转入重组载体pYES2-ochl-LAC4-CL和pPICZ a A-ura3-LAC4-H的乳酸克 鲁维酵母ATCC8585的培养上清调pH至7. 0后，用HiTrap rProteinA FF亲合柱(购 自GE Healthcare Life Science, USA, 17-5079-02)进行纯化层析柱先用20mM， pH7. 0 的磷酸钠缓冲液平衡，以lmL/min的流速上样，上样结束后，用5'倍柱体积的20mM， PH7.0的磷酸钠缓冲液洗柱，然后再用0. 1M柠檬酸溶液(pH3.0)进行洗脱，洗脱液 pH值用1M Tris-HC1 (pH9.0)调至中性。纯化样品分别进行还原及非还原SDS-PAGE 分析。
还原及非还原SDS-PAGE分析结果如图3和图4所示，从蛋白条带的位置来看，还 原的纯化样品中轻重链的大小与对照IgG中轻重链的相对分子量基本上一致，在理论 值55KD附近(略高于IgG标准品)。同时，还存在重链的降解带和一条分子量大于重 链的蛋白条带。非还原的纯化蛋白相对分子量大于96kD，与非还原的对照IgG的相对 分子量一致。还原电泳结果显示纯化样品中分别含有抗体的轻重链，而非还原电泳结 果表明，纯化样品中含有完整的抗体分子，这证明酵母表达的轻重链能够自发通过分 子间二硫键正确装配成完整的抗体分子。
5. 纯化样品的PNGF酶苷酶分析
取纯化样品90uL，加入lOuL的IOX变性缓冲液，IO(TC水浴10 min，冷却至 室温后加入10%NP-40、 10XG7缓冲液和PNGaseF酶，37。C反应2h，将酶切产物进行 SDS-PAGE分析。酶切反应体系如下90 uL蛋白溶液，10 u L 10XDenaturing Buffer, 15 uL 10XNP-40， 15 uL 10XG7 Buffer, 1 p L PNGaseF， 19 n L ddH20，总体积 150 uL。用PNGF这种专一性切割N-连接糖链的糖苷酶切割蛋白后，在蛋白电泳34KD 处可看到PNGF酶的蛋白条带，而纯化抗体中重链的分子量略有下降(图5)，说明重 链与预期一致，发生了N-糖基化修饰，使得抗体(属糖蛋白)在克鲁维酵母中完成了蛋白翻译后糖基化修饰过程。
6. 纯化样品的Western Blotting分析
Western Blotting方法参照汪家政、范明主编《蛋白质技术手册》(科学出版 社，2000年)。纯化样品经PNGase F糖苷酶处理，切除N-糖链后，对样品进行还原 SDS-PAGE,然后Western blotting分析，Western blotting分析所用抗体为羊抗人 IgG(Fc)(华美生物工程公司，洛阳)。Western blotting分析结果如图5所示，由 克鲁维酵母分泌的抗体与正常人IgG具有相同的抗原性。由于羊抗人IgG(Fc)与抗体 的Fc片段特异结合，所以Western blotting结果上只显示带有Fc片段的抗体重链蛋 白以及重链降解蛋白。
7. 蛋白的N端氨基酸测序
纯化样品经12%SDS-PAGE电泳，然后通过电转移的方法将蛋白转移到PVDF膜上。 PVDF膜经考马斯亮蓝染色和脱色，送至军事医学科学脘仪器中心实验室对重链的蛋白 条带进行N-末端氨基酸残基序列分析(方法参照汪家政、范明主编《蛋白质技术手 册》(科学出版社，2000年))。
利用N-端测序的方式来验证该蛋白条带的氨基酸序列，测序结果表明，该蛋白的 N末端五个氨基酸的序列为谷氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、缬氨酸，同抗体 重链N末端的氨基酸序列一致，说明它是抗体的重链。
8. 酵母表达抗体的活性测定
用MTT比色法检测酵母表达抗体分别对高表达pl85^2的乳腺癌细胞系SKBR3 (购 自中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库)和低表达P185ertB2的乳腺癌细胞系 MCF7 (购自中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库)生长的作用。用0.25%胰 酶(GIBC0)将生长良好的SKBR3和MCF7细胞消化2min，倒去消化液，用DMEM培养 基(GIBC0)分散细胞，用细胞计数板计数后，将细胞用含10。^FBS的DMEM培养基稀 释至lX107ml;取无菌洁净的96孔细胞培养板，每孔加入100ul细胞悬液，放置于 37°C、 5XC02水汽饱和的细胞培养箱中培养至细胞贴壁(约24h)。用含10%FBS的DMEM 培养基稀释纯化后的酵母表达抗体至终浓度为g/ml，然后用含10%FBS的DMEM培 养基在96孔板上依次进行融合蛋白样品的梯度稀释，起始为原液浓度的1/10，然后 依次进行1/2稀释，共稀释七次，每个点设三个复孔。同时做阴性和空白对照，阴性 孔为含相同浓度的正常人血清IgG，空白对照不加任何样品。将上述配制好的梯度样 品转移至96孔板，盖好盖后放回细胞培养箱中继续培养一定时间(SKBR3细胞培养72h， MCF7细胞培养30h)，每孔加入20uL细胞测活溶液MTT (5 mg/mL) ， 37。C继续培养4h，每孔加入80uL终止液(20%SDS， 0. 1NHC1) ， 37'C继续培养过夜，使结晶物充 分溶解；在酶联免疫检测仪上570nm处测定各孔光吸收度值，记录结果。
MTT比色法检测结果如图6所示，说明乳酸克鲁维酵母表达的抗HER2人源化单克 隆抗体对高表达pl85"^的SKBR3细胞有抑制作用，纯化抗体与SKBR3和MCF7细胞作 用一定时间后，MTT比色检测发现，纯化抗体对高表达pl85^2的SKBR3细胞有明显的 生长抑制作用，而对低表达P185ertB2的MCF7细胞无明显生长抑制作用。
实施例2、抗服R2人源化单克隆抗体在乳酸克鲁维酵母变构体中的表达
按照实施例1所述的方法将重组载体pYES2-ochl-LAC4-CL和 pPICZ a A-ura3-LAC4-H转化入乳酸克鲁维酵母KLGE02 CGMCC No. 2400中，将重组载 体pYES2-ochl-LAC4-CL和pPICZ a A-ura3-LAC4-H转化入乳酸克鲁维酵母KLGE03 CGMCC No. 2401中。抗HER2单克隆抗体在乳酸克鲁维酵母KLGE02 CGMCC No. 2400和 乳酸克鲁维酵母KLGE03 CGMCC No. 2401中表达。按照实施例1中4的方法获得纯化样 品HER2-l和HER2-2。纯化样品经12%SDS-PAGE电泳，并送至军事医学科学院仪器中 心实验室对重链的蛋白条带进行N-末端氨基酸残基序列分析(方法参照汪家政、范明 主编《蛋白质技术手册》(科学出版社，2000年))，测序结果表明，该蛋白的N末端 五个氨基酸的序列为谷氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、缬氨酸)，同抗体重链N 末端的氨基酸序列一致，说明它是抗体的重链。HER2-1和HER2-2分别进行还原及非 还原SDS-PAGE分析。还原电泳结果显示纯化样品服R2-1和HER2-2中分别含有抗体的 轻重链(图7和图8)，其中重链由于乳酸克鲁维酵母KLGE02 CGMCC No. 2400和KLGE03 CGMCC No. 2401中a-1， 6-甘露糖转移酶和a -1， 3-甘露糖转移酶的缺陷，表观分子量 略有下移，即糖基化现象有所减少(实施例1中已经证明乳酸克鲁维酵母表达的抗体 经糖苷酶切后，重链分子量改变并回归到标准品IgG的位置，提示分子量的变化是由 于糖基引起)，而非还原电泳结果表明，纯化样品中含有完整的抗体分子(图9和图 10)。蛋白的N端氨基酸测序的序列为谷氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、缬氨酸， 同抗体重链N末端的氨基酸序列一致，说明它是抗体的重链。酵母表达抗体的活性测 定结果图11和图12所示。
MTT比色法(方法与实施例1相同)检测结果如图11和图12所示，说明乳酸克 鲁维酵母突变型菌株表达的抗HER2人源化单克隆抗体对高表达pl85"bB2的SKBR3细胞 有抑制作用，而对低表达pl85一2的MCF7细胞无明显生长抑制作用。
实施例3、抗体类似物sr7WW/J-7^^b在乳酸克鲁维酵母中的表达
1. sTNFRII基因和IgGFc基因的钓取取健康人的酸性柠檬酸葡萄糖(ACD)抗凝静脉血，Hanks'平衡盐液(Invitrogen Corp. USA)稀释后，用淋巴细胞分离液离心获得淋巴细胞(上海卓康生物科技有限公 司)，用含10%胎牛血清的(Hyclone公司，USA)的1640培养基(GIBC0， USA)调 细胞数为5X106个/mL，置于细胞培养箱温育2h后换用含脂多糖(LPS, 20ug/mL) (Sigma)和10%胎牛血清的1640的新鲜培养基，继续培养5h后离心富集细胞;TRIzol (上海生工生物工程技术服务有限公司)法提取总RNA(按照TRIzol说明书进行操作)； 总RNA经RT-PCR后得到cDNA (按照RT-PCR试剂盒说明进行操作)，然后以cDNA为 模板，扩增人s7M^T基因和人/^^b基因。
扩增人sTM^7/基因所用引物为sTNFR-Ol和sTNFR-02 (引物序列分别为 5， -ATCTCGAGAAAAGAGCCTTGCCCGCCCAGG TGGCAT-3，和
5， -GTCGCCAGTGCTCCCTTCAGC-3，)，使s7M^iT的C端带上含有T^6^c的N端部分的 序列。
PCR方法为:50uL反应体系中加入反转录产物lu L， dNTP(2. 5raM)5nL， 10Xpfu Buffer5uL，弓|物sTNFR-01 (10 u M) 2uL，弓|物sTNFR-02 (10 y M) 2itL， pf u DNA 聚合酶O. 5uL， ddH20 34. 5uL (dNTP、 pfu DNA聚合酶均为上海生物工程技术服务有 限公司产品)。使用Perk-Elmer公司的9600PCR仪，PCR条件为94°〇预变性5min， 94。C变性30sec， 55。C退火30sec， 72。C延伸lmin 30sec，循环30次；最后72。C延伸 10min。 PCR扩增产物用0.8y。的琼脂糖凝胶电泳(8V/cm， 15min)分离，预期条带片段 大小为0.7 kb， PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收(图13)。
扩增人/g6尸c基因所用引物为i"gC(^01: 5， -GAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC-3，和 T^6"/^02: 5， -ACGMTTCTTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3,，使i^C尸c的N端带上含 有sTM^J/的C端部分的序列。
PCR方法为50uL反应体系中加入反转录产物luL， dNTP(2. 5mM)5uL， 10Xpfu Buffer5uL，弓l物sTNFR-Ol (10tiM) 2 u L，弓|物sTNFR-02 (10 n M) 2uL，pfuDNA 聚合酶0.5uL， ddH20 34. 5uL (dNTP、 pfu DNA聚合酶均为上海生物工程技术服务有 限公司产品)。使用Perk-Elmer公司的9600PCR仪，PCR条件为94。C预变性5min， 94。C变性30sec， 55。C退火30sec， 72。C延伸lmin30sec，循环30次；最后72。C延伸 10min。 PCR扩增产物用0.8。/。的琼脂糖凝胶电泳(8V/cm， 15min)分离，预期条带片段 大小为0.7 kb， PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收(图13)。
2. sTNFRII基因和IgGFc基因的融合
利用重叠延伸PCR方法进行体外拼接，以带有接头的上述两个基因片段为模板，以人sTM^J/基因的上游引物、T^^c基因的下游引物为上下游引物(引物sTNFR-Ol 和T^6"尸c"02，弓I物序列分别为引物sTNFR-01:5， -ATCTCGAGAAAAGAGCCTTGCCCGCCCAGG TGGCAT-3，和i^d02: 5， -ACGAATTCTTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3，)，用pfu 聚合酶，PCR融合s7M^/7基因和/g6Fc基因。PCR反应体系50uL反应体系中加入 s7)W^i7基因回收产物0. lii L， dNTP(2. 5mM)5 u L， 10Xpfu Buffer 5 u L，弓|物sTNFR-Ol 2uL，引物/gf尸cK)2 2pL， pfu DNA聚合酶0:5y L， ddH20 35. 4yL。 PCR条件为 94。C预变性5min， 94。C变性30sec， 55。C退火30sec， 72。C延伸2min30sec，循环30 次；最后72'C延伸10min。 PCR扩增产物用0. 8%的琼脂糖凝胶电泳(8V/cm， 15min) 分离，预期条带片段大小为1.4kb， PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收(图 14)。基因序列经BLAST比对，结果显示sTNFRII部分(l 708bp)和IgGFc部分(709 1407bp)分别与Genbank中的报道一致，其基因号(gi)分别为23312365和18999464， 其核苷酸序列为序列表中的序列3。
3. sTNFRII-IgGFc表达载体的构建
获得嵌合体基因s77lK /J-7^Fc后，将其进行J力oI/^boRI (本试验所用的限制性 内切酶均购自宝生物工程有限公司，大连)双酶切，酶切后的嵌合体基因插入同样双 酶切处理的质粒pKLACl (购自NEB)中，构建成乳酸克鲁维酵母分泌表达载体 pKLACl-sTNFRII-IgGFc(简写为pKLAC1-TF，图15)。
4. sTNFRII /Fc在乳酸克鲁维酵母中高效表达
制备乳酸克鲁维酵母ATCC8585的感受态细胞，将表达载体pKLACl-TF和质粒 pKLACl (购自New England BioLabs (NEB， Ipswich, MA))以线性化后分别 电转入乳酸克鲁维酵母ATCC8585的感受态细胞中，将电击后的菌液涂布于含有5 ramol/L乙酰胺YCB琼脂培养基(lmol/L磷酸钠，1. 17g/100ml YCB， 2g/100ml琼月旨， 5ramol/L乙酰胺，其中YCB为酵母基本碳源培养基，以上均购自北京欣经科生物技术 有限公司)平板上，3(TC翻转培养3-4天直至克隆出现。用无菌枪头刮取约2mr^的单 克隆细胞，置于2ml YPGal培养液(lg/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，2g/100ml 半乳糖)中重悬，30。C振荡培养(250-300rpm)，诱导72小时后离心取上清。
5. 乳酸克鲁维酵母表达sTNFRII /Fc的阳性克隆筛选
用ELISA筛选阳性克隆(方法参照汪家政、范明主编《蛋白质技术手册》(科学 出版社，2000年)):上清用抗原包被液(0. 15g/100ml Na2C03， 0. 293 g/100ml Na跳， pH9.6)稀释至原来的1/625，然后各取100uL样品加入酶联板中，4X:包被过夜，抗 体为羊抗人IgG-服P (1:500)(华美生物工程公司，洛阳)，每孔各加100uL显色液(1.84%Na2HP04.12H20， 0. 5%柠檬酸，临用前再加0. 04% OPD和0. 15% H202) ， 37°C 避光温育15min，最后每孔加20 n L终止液(2M H2S0J以终止显色，于492咖处比色。 其中阳性克隆孔内呈现一定的颜色变化，空白及阴性孔内没有明显的颜色变化。阳性克 隆的上清用于如下实验。
6. 阳性克隆的上清的Western blotting鉴定
阳性克隆的上清同TCA沉淀，沉淀物进行还原和非还原性10XSDS-PAGE后，再转 移至硝酸纤维素膜，用羊抗人IgG-HRP检测，通过ECL显色。结果表明，还原的样品 中，在分子量66kD附近位置，有一特异性条带，比融合蛋白单体的理论分子量56kD 稍大；在非还原样品中该单体条带消失，而在分子量大于97kD处出现一特异性条带。
7. 阳性克隆的上清的纯化
将阳性克隆的上清调pH至7.0后，用HiTraprProteinAFF亲合柱进行纯化层 析柱先用20mM、 pH7.0的磷酸钠缓冲液平衡，以lmL/min的流速上样，上样结束后， 先用5倍柱体积的20mM、 pH7.0的磷酸钠缓冲液洗柱，然后再用0. 1M柠檬酸溶液 (pH3.0)进行洗脱，洗脱液pH值用1M Tris-HC1 (pH9.0)调至中性。纯化后的蛋白 浓度采用Bradford蛋白定量试剂盒进行测定，纯化后的的蛋白即为sTNFRII-IgGFc融 合蛋白，浓度约为O. lmg/mL上清。
经Protein A亲和柱再一次纯化后的s7力M77-7"^^b融合蛋白进行10%SDS-PAGE, 蛋白质的SDS-PAGE方法为本领域所共知的(如D. R.马歇克等，《蛋白质纯化与鉴定 实验指南》，科学出版社，1999)。考马斯亮蓝染色结果如图16所示，从蛋白条带的 位置来看，还原的融合蛋白大小在66kD与80kD之间，而非还原的融合蛋白大小小于 116kD，说明该融合蛋白为通过分子间二硫键连接形成的二聚体。SDS-PAGE纯度扫描 分析结果如图17所示，纯度达90%左右。
8. 融合蛋白^^/^///^抑制7,-a细胞毒的活性分析
将生长良好的L929细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)用 含10X胎牛血清的1640培养基稀释至2X10VM1，每孔加入100uL细胞悬液，放置 于37。C、 5XC02水汽饱和的细胞培养箱中培养24h。
用10%胎牛血清的1640培养基(含2ug/mL放线菌素D)稀释TNF-a (ProSci Incorporated, USA, XW-RP3118)至终浓度为50U/niL，然后在96孔板上依次进行融合 蛋白s7^/W/J/尸c样品的梯度稀释，起始为原液浓度的1/10，然后依次进行l/4稀释。 吸弃96孔板中的细胞培养上清，将上述配制好的梯度样品转移至96孔板，继续培养 24h，培养时间以阳性对照细胞基本死亡为准；每孔加入20uLMTT，在酶联免疫检测仪上570nm处测定各孔光吸收度值，记录结果。
MTT实验结果如图18所示，纯化后的^M^7T-i^^b融合蛋白能较好的抑制 TNF- a对L929细胞的杀伤作用。
实施例4、抗体类似物s7M^/J-7^Fc在乳酸克鲁维酵母变构体中的表达
表达载体pKLACl-TF和质粒pKLACl以^stZI线性化后分别电转入乳酸克鲁维酵母 KLGE02 CGMCC No. 2400和KLGE03 CGMCC No. 2401。获得了乳酸克鲁维酵母KLGE02 CGMCC No. 2400和KLGE03 CGMCC No. 2401表达的融合蛋白s7M^77/尸c7禾卩s7M^iT/尸c么融 合蛋白s7M^7T/尸c7和srvW^/7/尸c2用HiTrap rProteinA FF亲合柱进行纯化后的蛋 白浓度采用Bradford蛋白定量试剂盒进行测定，sTNFRII/Fcl浓度约为0. 15mg/mL上 清，sTNFRII/Fc2浓度约为0. 15mg/mL上清。
经Protein A亲和柱纯化的^TM^/7/尸c7禾n s7M^77/尸c^进行10%SDS-PAGE分析。 考马斯亮蓝染色结果如图19所示，乳酸克鲁维酵母ATCC8585表达的57^^//-/^ /^ 在分子量在66kD与80kD之间，乳酸克鲁维酵母KLGE02 CGMCC No. 2400和KLGE03 CGMCC No. 2401表达的s7M^iT/尸c7和s7MWiT/尸c^分子量明显低于s7M^//-/^^b，大约为 66KD。说明其过度糖基化程度得到了明显的改善。而且对变构体表达的融合蛋白 s7M7 /J/尸c抑制TNF-a细胞毒的活性进行分析，MTT实验结果如图20和21所示，变 构体表达并纯化后的s7M^/7-7"gCc融合蛋白能较好的抑制TNF- a对L929细胞的杀 伤作用。序列表
<110〉
中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所
<120〉
表达抗体或抗体类似物的重组克鲁维酵母菌及其构建方法与应用
<130>
CGGNARL81974
<160> 3
<210〉 1
〈211〉 1605
<212〉 DNA <213>
〈400〉 1
atgagattcccatctattttcactgctgttttgttcgctgcttcttctgctttggctgct60
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agcctctccctgtctccgggta^tga140权利要求
1、构建表达抗体或抗体类似物的重组克鲁维酵母菌的方法，是将抗体的编码基因或抗体类似物的编码基因导入克鲁维酵母中获得重组菌；所述抗体类似物为抗体的Fc片段与蛋白或蛋白亚基形成的融合蛋白；所述抗体的编码基因为抗体的重链编码基因和轻链编码基因。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述抗体的Fc片段选自如下任一 抗体IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgAl、 IgA2、 IgD和IgE。
3、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述抗体的编码基因或抗体 类似物的编码基因的5'末端连接有编码信号肽的序列；所述信号肽为酵母a交配因 子信号肽、人血白蛋白信号肽或鸡溶菌酶信号肽。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述克鲁维酵母菌为乳酸克鲁维 酵母(A7〃，r,ce5" Zac"s )、脆壁克鲁维酵母(A7i/，er啤ces尸r柳7is)、 鹰嘴豆饱克鲁维酵母(A7w/Kero/^ces cicew'邵o/7/s)或马克思克鲁维酵母菌
5、 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述克鲁维酵母菌为a-1，6-甘露 糖转移酶基因或/和a -1， 3-甘露糖转移酶基因灭活的重组克鲁维酵母菌。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述克鲁维酵母菌为乳酸克鲁维 酵母CGMCC No. 2400或乳酸克鲁维酵母CGMCC No. 2401。
7、 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述抗体的重链编码基因为序列 表中序列1自5'末端第256-1605位，所述抗体的轻链编码基因为序列表中序列2自 5'末端第256-897位。
8、 由权利要求1至7中任一所述的方法构建的重组克鲁维酵母菌。
9、 一种制备抗体或抗体类似物的方法，是培养权利要求8所述的重组克鲁维酵 母菌生产完全抗体或抗体类似物。
10、 由权利要求9所述方法生产的抗体或抗体类似物。
全文摘要
本发明公开了一种表达抗体或抗体类似物的重组克鲁维酵母菌及其应用。本发明首先提供了构建表达抗体或抗体类似物的重组克鲁维酵母菌的方法，是将抗体的编码基因或抗体类似物的编码基因导入克鲁维酵母中获得重组菌；所述抗体类似物为抗体的Fc片段与蛋白或蛋白亚基形成的融合蛋白；所述抗体的编码基因为抗体的重链编码基因和轻链编码基因。培养用所述方法获得表达抗体或抗体类似物的重组克鲁维酵母菌可生产完全抗体或抗体类似物。本发明利用克鲁维酵母菌制备抗体及抗体类似物初步解决了生产抗体比较困难、要求产品纯度高、数量大的困难，具有良好的应用前景。
文档编号C12N15/13GK101413002SQ200810227780
公开日2009年4月22日 申请日期2008年12月3日 优先权日2008年12月3日
发明者波 刘, 军 吴, 唱韶红, 新 巩, 马清钧 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所