一株鲁氏酵母及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株鲁氏酵母及其应用，属于发酵【技术领域】。鲁氏酵母（Zygosaccharomyces?rouxii）已于2013年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.8323。该菌株具有较高的耐渗透压能力，将该菌株应用于蚕豆酱传统发酵生产过程，具有耐高盐、缩短传统发酵豆瓣酱周期的特点。
【专利说明】一株鲁氏酵母及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及ー株鲁氏酵母及其应用，属于发酵【技术领域】。
【背景技术】
[0002]酵母(Yeast)是ー种肉眼看不见的微小单细胞微生物，能将糖发酵成酒精和二氧化碳，是ー种天然发酵剂，分布于整个自然界，它有自己的生命现象，是ー种典型的兼性厌氧微生物，在有氧气和没有氧气存在的条件下都能够存活。多数酵母可以分离于富含糖类的环境中，比如一些水果(葡萄、苹果、桃等)或者植物分泌物(如仙人掌的汁)。ー些酵母在昆虫体内生活。酵母菌是单细胞真核微生物，形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为I~5微米或5~20微米，无鞭毛，不能游动。
[0003]鲁氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)在分类学上属于真核生物原界、真菌界、子囊菌门、酵母亚门、酵母纲、酵母目、酵母科、接合酵母属。鲁氏酵母菌落呈圆形，有光泽，平坦，边缘整齐，在麦芽汁中培养细胞呈小圆形或卵圆形。适宜生长温度为28。。~30°C。最适pH值为4~5，是常见的耐高渗透压酵母菌。鲁氏酵母淀粉酶活力较强，耐高渗透压，是主要传统发酵食品如酱油和甜酱的生产菌，耐盐性強，属于增香酵母。
[0004]蚕豆酱是以蚕豆等为原料发酵酿制而成的保持蚕豆酱原形的半流动粘稠体或半固态调味品。蚕豆酱在我国有着悠久的历史，营养丰富，味道鲜美，有助消化，增进食欲，因此深受广大消费者的欢迎。本发明涉及的鲁氏酵母从蚕豆酱传统发酵酱醅中筛选，鲁氏酵母是蚕豆酱发酵过程中的有益酵母，对酱体风味有着积极而重要的贡献，为蚕豆酱增添特有的香气。筛选传统发酵过程中的鲁氏酵母，为阐明豆瓣酱风味形成机制奠定一定的基础。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一株鲁氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)。
[0006]所述鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii),已于2013年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8323，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0007]本发明所述的鲁氏酵母分离自安徽某知名酱品传统方法酿制的酱醅，该菌株具有典型特征的M13-PCR指纹，即菌株专ー性的特征指纹，如图1所示；测序分析，其ITS序列(基因间隔序列)基因型如SEQ ID N0.1所示，在NCBI网站上进行比对的结果是，该菌与一株接合酵母属酵母Zygosaccharomyces sp.(序列ID: emb IHE984156.11 )有最高匹配度。
[0008]所述鲁氏酵母能够耐受20%盐浓度、缩短传统发酵豆瓣酱发酵周期。
[0009]所述鲁氏酵母为从风味ロ感较佳的传统方法酿制的豆瓣酱酱醅中筛选的酵母菌株，平板菌落计数达到6X 103CFU/g，其保藏条件如下:从生长良好的YEH)培养基平板中取单菌落移入新鲜的液体YEro培养基中，28°C摇床培养24h，取0.75mL移入盛有0.25mL无菌甘油(40%，v/v)的甘油管中，放_70°C冰箱保存。[0010]所述YEro培养基为:蛋白胨2g ?じ1，酵母粉Ig ?じ1，葡萄糖2g ?じ1，pH自然(不另外调整pH)。
[0011]所述鲁氏酵母培养条件为:将甘油管保藏的鲁氏酵母接入YEro液体培养基，在28°C、150rpm摇瓶培养36h至对数中后期，作为种子液。以2% (v/v)接种量将种子液转接至发酵培养基中，28°C 150rpm培养24h至对数期。
[0012]本发明提供了 ー种所述鲁氏酵母的应用，将培养良好的鲁氏酵母在豆瓣酱传统发酵过程的中期添加入酱醅，以缩短豆瓣酱的发酵周期。
[0013]本发明提供了一株鲁氏酵母，应用于高盐浓度传统发酵豆瓣酱，缩短豆瓣酱的发酵周期。
[0014]生物材料保藏
[0015]本发明所提供的鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii),已于2013年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8323，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1R印-PCR(M13_PCR)扩增指纹图谱，M:lkb ladder, 1:样品。
[0017]图2鲁氏酵母盐度耐受性柱形图。
【具体实施方式】
[0018]实施例1鲁氏酵母筛选
[0019]从传统发酵豆瓣酱88天酱醅中取Ig样品加入到9mL无菌水中，轻微振荡制成悬浊液，将悬浊液梯度稀释，涂布于YAP平板，28°C培养6天。挑取乳白色单菌落反复进行平板划线分离，重复三次得到纯化的单菌落，供下一步鉴定用。
[0020]所述YAP培养基为:蛋白胨Igじ1，酵母粉0.5gじ1，葡萄糖Igじ1，丙酸钠1%，琼脂2%，pH自然。灭菌条件:115°C，15min。待冷却至45°C左右加入过滤除菌的青霉素钠，添加量为2%0。
[0021]鉴定主要通过:1)菌落特征观察:用肉眼直接观察，挑选菌落直径在2.0mm左右，圆形，表面光滑，乳白色等符合酵母菌菌落特征的菌株。2)个体形态观察:用光学显微镜观察，挑选卵圆形，大小(1-5) UmX (5-30) iim，视野中有明显出芽细胞的菌株。将满足鉴定条件的菌株挑出甘油管保藏。
[0022]以2%接种量取-70°C甘油贮存液接种于YEH)培养基中，28°C、150转/分钟培养24h。取适量培养液离心2min (4000rpm，4°C )，弃尽上清液，得到适量菌体，用酵母基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。用酵母ITS通用引物对正向引物EF4 (5’-GGAAGGG(G/A)TGTAITTATTAG-3’)、反向引物 EF3(5’ -TCCT (A/C) TAAATGACCAAGTTTG-3’ )扩增基因组 DNA，反应条件为:94°C预变性5min后进入以下循环:94°C变性480s，55°C退火40s，72°C延伸60s，35个循环；72°C延伸lOmin。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果良好。将扩增产物寄送上海华大基因测序，结果如SEQ ID N0.1所示，在NCBI网站上进行BLAST序列比对，确定为鲁氏酵母。
[0023]实施例2NaCl耐受性实验[0024]鲁氏酵母NaCl耐受性实验所使用的培养基为不同NaCl终浓度的YETO培养基。YEro培养基为:蛋白胨2g/L，酵母粉lg/L，葡萄糖2g/L，pH自然(即，不对pH另行调整)。115°C灭菌15分钟。
[0025]以2%接种量取-70°C甘油贮存液接种于YEH)培养基中，28°C，150转/分钟培养36h。以2%接种量转接至不同NaCl终浓度的YEH)培养基中，28°C，150转/分钟培养20天，如图2所示，鲁氏酵母在NaCl终浓度10%、12%、14%、16%、18%、20% (%:g/100mL)条件下均能生长，其中NaCl终浓度10%、12%条件下生长速度较快，NaCl终浓度14%、16%、18%条件下生长速度次之，NaCl终浓度20%条件也能生长，但生长速度相对缓慢。
[0026]实施例3应用于高盐浓度传统发酵蚕豆酱
[0027]CGMCC N0.8323Zygosaccharomyces rouxii LBST-Y1 菌株在 YEF1D 液体培养基中培养2天，作为种子液。将种子液接种至盐度为14%的酱醅，对照为未接种种子液的盐度为14%的酱醅，发酵周期有较明显的变化，未接种鲁氏酵母的酱体在约110天后成熟，而接种鲁氏酵母的酱体在约95天后成熟，且接种鲁氏酵母的酱体较未接种鲁氏酵母的酱体风味更加饱满,香气更为醇厚。[0028]可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
【权利要求】
1.一株鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii),于2013年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8323，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.如权利要求1所述的鲁氏酵母，其特征在于耐受20%NaCl。
3.如权利要求1所述的鲁氏酵母，其特征在于缩短传统发酵豆瓣酱发酵周期。
4.培养权利要求1-3任一所述鲁氏酵母的方法，是将甘油管保藏的鲁氏酵母接入YEH)液体培养基，在28°C、150rpm摇瓶培养36h至对数中后期，作为种子液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述YEH)液体培养基为:蛋白胨2g/L，酵母粉lg/L，葡萄糖2g/L，pH自然。
6.权利要求1-3任一所述鲁氏酵母应用于传统发酵豆瓣酱，是将鲁氏酵母种子液在豆瓣酱传统发酵过程的中期添加入·到酱醅中。
【文档编号】C12R1/645GK103589653SQ201310612630
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月26日 优先权日:2013年11月26日
【发明者】李崎, 蒯辉, 朱林江, 王金晶, 田金凤, 李永仙 申请人:江南大学