马克思克鲁维酵母菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酵母菌，尤其涉及一种具有高分泌性能和高生物量的马克思克鲁 维酵母菌、及其应用。
【背景技术】
[0002] 目前已知的酶制剂有100多种，常用的有30多种，广泛用于食品、发酵、制革、纺 织、日用化工、医药等工业。在我国规定可用于食品工业的有15种。
[0003] 工业酶制剂来源于生物，但因通常使用的不是酶的纯品，制品中的有关组分（如 微生物的某些代谢产物，甚至是有害的物质）有可能在使用时随着食品而被带入，从而影 响人体健康。美国、加拿大、欧盟、澳大利亚、新西兰、日本等国均规定酶制剂必须经过严格 的安全性评价，批准后才能生产销售。因此，利用微生物生产酶制剂时，其生产方法和培养 条件都应保证是在受控条件下发酵，以保证所用的微生物不致成为有毒物质和其他有害物 质的来源。
[0004] 酵母（或：酵母菌）是一类单细胞真核生物，具有生长旺盛、培养简单和其独有的 一些特性，它已被发展成为表达外源基因的重组表达系统。酵母作为单细胞生物一方面在 操作和生产上具有细菌表达系统的特点，另一方面又具有真核细胞对翻译后蛋白的加工及 修饰过程。如：二硫键的正确形成、前体蛋白的水解加工、糖基化作用等。
[0005] 利用酵母表达系统表达外源蛋白的宿主包括：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维亚酵母（KluyveromycesIactis)、粟酒裂殖糖酵母 (Schizosaccharomycespombe)、解脂耶罗维亚酵母（YarrowiaIipolytica)、西方许旺氏 酵母（Schwanuiomycesoccidentalis)、多形汉逊酵母（Hansenulapolymorpha)和巴氏毕 赤酉孝母（Pichiapastoris) 〇
[0006] 克鲁维酵母安全不产生内毒素，营养要求极其简单、生长旺盛、生物量大、生长温 度适应范围广（25 - 46°C)等优点，是用于发酵工业的重要微生物。
【发明内容】
[0007] 本申请提供了一种具有高分泌性能和高生物量的马克思克鲁维酵母菌。
[0008] 本发明提供的马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus;K.marxianus)， 保藏号为CGMCCNo. 10621(在本发明下述内容中，也可以称为马克斯克鲁维酵母F頂-1、 K.marxianusFIM-1 或KluyveromycesmarxianusFIM-1)〇
[0009] 本发明所述的马克思克鲁维酵母菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所； 保藏日期为2015年3月13日。
[0010] 本发明马克思克鲁维酵母菌，株菌落为圆形，呈乳白色，边缘整齐；酵母菌呈椭圆 形，大小约为4-8ym，出芽生殖，单个、两个或多个系成串粘连。
[0011] 本发明马克思克鲁维酵母菌，发酵分泌内切菊粉酶，并且在以葡萄糖为碳源条件 下菊粉酶产量大于葡萄糖、菊粉混合碳源条件下的产量。
[0012] 本发明第二个方面是提供一种马克思克鲁维酵母菌发酵方法，包括：
[0013] 提供马克思克鲁维酵母菌CGMCCNo. 10621;
[0014] 在氮源和碳源存在条件下进行发酵；
[0015] 收集菊粉酶。
[0016] 其中，在所述发酵生产菊粉酶方法中，所述碳源优选为至少包括葡萄糖。
[0017] 其中，在所述发酵生产菊粉酶方法中，所述氮源优选为至少包括酵母提取物。
[0018] 其中，在所述发酵生产菊粉酶方法中，发酵时间优选为48-96小时。
[0019] 其中，在所述发酵生产菊粉酶方法中，发酵温度优选为25-38 °C，更优选为 28-37 °C，更优选为30-36 °C，更优选为33-35 °C。
[0020] 其中，在所述发酵生产菊粉酶方法中，菌株接种量优选为0. 05 % -5 %，更优选为 0? 1% -4. 5%，更优选为 0? 5% -4%，更优选为 1% -3%，如L5%、2%。
[0021] 其中，所述方法可以是用于马克思克鲁维酵母菌的高生物量发酵。
[0022] 其中，所述方法可以是用于生产菊粉酶。
[0023] 本发明所提供的马克思克鲁维酵母菌，相比于ATCC8585、ATCC26548等现有克鲁 维酵母，具有更高的分泌蛋白的能力和更高的生物量，可用于生产酶制剂，并且可以用来构 建重组蛋白表达系统。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明马克思克鲁维酵母菌分泌蛋白能力，泳道I:K.marxianusFIM-I;泳 道2 :K.marxianusATCC26548 ;泳道3 :K.IactisATCC8585 ;泳道M;蛋白Marker;泳道4-8 为那曲酸奶分离的不同的K.marxianus酵母菌株；
[0025] 图2为本发明马克思克鲁维酵母菌细胞形态；
[0026]图3为本发明马克思克鲁维酵母菌高生物量发酵结果；
[0027] 图4为葡萄糖为碳源的条件下（A)、葡萄糖和菊粉混合物为碳源条件下（B)， K.marxianusF頂-1分泌的菊粉酶产量对比，通道1-7依次为发酵24、48、72、96、120、144、 168小时条件下的菊粉酶产量；
[0028]图5为本发明马克思克鲁维酵母菌发酵罐发酵菊粉酶的产量变化曲线；
[0029]图6为本发明马克思克鲁维酵母菌发酵罐发酵菊粉酶的蛋白电泳分析，通道1-7 依次为发酵10、23、27、32、36、48、57小时条件下的菊粉酶产量。
【具体实施方式】
[0030] 样品采集和酵母分离:
[0031] 2014年8月从西藏那曲地区采集不同的酸奶样本。
[0032] 取酸奶样本lg，用50ml的无菌水稀释，然后用无菌水进行10倍、100倍、1000倍 和10000倍稀释，取100y1稀释液涂布于酵母固体培养基YNB(无氨基酵母氮源；Yeast NitrogenBasewithoutAminoAcids)+1 %菊粉平板上，30°C培养 3-4 天后形成克隆。
[0033]
[0034] 将酸奶样本中分离到的酵母菌以及从ATCC购买两株克鲁维酵母菌株 KluyveromycesIactis(保藏号：ATCC8585)和K.marxianus(保藏号：ATCC26548)，在含 1%酵母提取物（YeastExtract)和2%的葡萄糖液体培养基中，30°C发酵培养120h后离心 收集发酵上清，然后采用蛋白质电泳技术-SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)检测各株 酵母分泌蛋白的能力。
[0035] 其中发现：一株酵母Fm-I具有高分泌蛋白能力（如图1所示），分泌蛋白的大小 约90kDa左右。
[0036]菌株鉴宙
[0037] 酵母菌F頂-1的菌种的鉴定采用了18srDNA方法。
[0038]通过 18SrDNA通用引物NSl(GTAGTCATATGCTTGTCTC)和 NS8(TCCGCAGGTTCACCTACGGA)，以提取酵母菌F頂-1的基因组为模板，进行PCR扩增与测序， 获得了 18srDNA序列如SEQIDNO. 1所示，与GenBank中的已知序列进行比对后，发现获 得的酵母菌FIM-1的18srDNA序列与K.marxianusNBRC1777的序列相似度为100%