一种复配菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种复配菌及其应用。本发明公开的一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus?amyloliquefaciens），其保藏编号为CGMCC?No.7364。本发明筛选出对营养条件要求不高的三种净化水质的细菌进行复配使用，克服了调水产品投入水体中由于营养条件不均衡造成投入到水体中的净化水质细菌生长缓慢或者死亡的弊端，从而起到迅速净化水质的作用。
【专利说明】一种复配菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种复配菌及其应用。
【背景技术】
[0002]在水产养殖中后期，由于过量投喂饲料或水质污染造成养殖水体中氨氮和亚硝酸盐含量过高，对养殖动物造成严重危害。而现在市售的一些调节水质的产品见效慢或者没有效果，给养殖户造成不必要的经济损失。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种复配菌及其应用。
[0004]本发明提供的一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其保藏编号为 CGMCC N0.7364。
[0005]一种复配菌也属于本发明的保护范围，由保藏编号为CGMCC N0.7364的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和保藏编号为CGMCC N0.7365的盐田盐单胞菌(Halomonas campisalis)组成。
[0006]—种复配菌也属于本发明的保护范围，由保藏编号为CGMCC N0.7363的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri )、保藏编号为CGMCC N0.7364的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和保藏编号为 CGMCC N0.7365 的盐田盐单胞菌(Halomonascampisalis)组成。
[0007]上述复配菌中，所述保藏编号为CGMCC N0.7363的施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri )、保藏编号为 CGMCC N0.7364 的解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和保藏编号为CGMCC N0.7365的的盐田盐单胞菌(Halomonas campisalis)的数量比为1:1:1。
[0008]一种消除亚硝酸盐的制剂也属于本发明的保护范围，该制剂由上述任一所述的复配菌和碳源组成。
[0009]上述制剂中，所述复配菌中的各菌与所述碳源的比例均为IO1tlCfu:lg。
[0010]上述任一所述的制剂中，所述碳源为葡萄糖。
[0011]上述任一所述的菌、上述任一所述的制剂在降低水体中亚硝酸盐和/或氨氮含量中的应用也属于本发明的保护范围。
[0012] 上述应用中,所述水体为鱼塘水体。
[0013]本发明筛选出对营养条件要求不高的三种净化水质的细菌进行复配使用，克服了调水产品投入水体中由于营养条件不均衡造成投入到水体中的净化水质细菌生长缓慢或者死亡的弊端，从而起到迅速净化水质的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为亚硝酸盐含量检测曲线I。[0015]图2为亚硝酸盐含量检测曲线2。
【具体实施方式】[0016]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0017]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0018]氯化铵缓冲溶液按照如下方法制备:在1000mL容量瓶中加入500mL蒸馏水，加入20mL浓盐酸，混匀，加入50mL氨水，用蒸馏水定容至刻度，调节pH值至9.6-9.7之间。
[0019]60%乙酸溶液按照如下方法制备:将600mL冰乙酸加入1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1L。
[0020]对氨基苯磺酸溶液按照如下方法制备:称取5g对氨基苯磺酸，溶于700mL水和300mL冰乙酸中，置棕色瓶保存，一周内有效。
[0021]N-1萘基乙二胺溶液(lg/L)按照如下方法制备:称取0.1g N-1萘基乙二胺，加少量60%乙酸溶液溶解并用蒸馏水定容至IOOmL,混匀后置棕色瓶中，在冰箱内保存，I周内有效。
[0022]显色剂按照如下方法制备:临用前将N-1萘基乙二胺溶液(lg/L)和对氨基苯磺酸溶液等体积混合。
[0023]亚硝酸钠标准溶液按照如下方法制备:称取250.0mg经115°C士 5°C烘至恒重的亚硝酸钠，加水溶解，将溶液移入500mL容量瓶中，加IOOmL氯化铵缓冲液，加水稀释至刻度，混匀后在4°C避光保存，此溶液每毫升相当于500 μ g亚硝酸钠。
[0024]亚硝酸钠标准工作液:吸取亚硝酸钠标准溶液1.0OmL,置于IOOmL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5.0μ g亚硝酸钠。
[0025]实施例中亚硝酸盐含量检测方法如下:
[0026]一、标准曲线的绘制
[0027]分别吸取亚硝酸钠标准工作液10 μ L、15 μ L、20 μ L、40 μ L、60 μ L、80 μ L、100 μ L加入96孔板，分别在各孔中加入氯化铵缓冲溶液与60%乙酸混合液(体积比2:1) 150 μ L，水90 μ L，显色剂100 μ L，混匀后避光反应25min。采用酶标仪在540nm下测定各反应液的吸光度。以吸光度为横坐标，各溶液中所含亚硝酸钠的质量(μ g)为纵坐标，绘制标准曲线。
[0028]二、样品测定
[0029]取40 μ L离心后的养殖水体样品上清液，加入96孔板中，分别在各孔中加入氯化铵缓冲溶液与60%乙酸混合液(体积比2:1) 150 μ L，水90 μ L，显色剂100 μ L，混匀后避光反应25min。采用酶标仪在540nm下测定反应液的吸光度。
[0030]三、根据公式I进行样品中亚硝酸盐含量计算
[0031]X=mX 1000/40 (公式 I)
[0032]式中:
[0033]X为所测样品中亚硝酸盐的浓度(mg/L)；
[0034]m为将所测样品吸光度带入步骤一的标准曲线中计算得出的40 μ L样品中亚硝酸
盐绝对含量。
[0035]奥尼罗非鱼购自北京市昌平区小汤山奥尼罗非鱼养殖基地。
[0036]0.85%的氯化钠水溶液按照如下方法配制:称取0.85g氯化钠，用蒸馏水溶解并定容至100ml。
[0037]P/oBTB酒精溶液按照如下方法制备:lg麝香草酚溶于IOOmL无水乙醇中。
[0038]BTB选择性培养基按照如下方法制备:KN03lg/L、KH2PO4lg/L, CaCl20.2g/L、MgS04lg/L、琥珀酸钠(丁二酸钠)8.5g/L，每升固体培养基另外加1%BTB酒精溶液1ml，调PH6.8-7.0。将上述成分按相应浓度用蒸馏水溶解并定容配制成IL溶液，作为备用培养基。
[0039]维氏盐溶液:K2HP045g/L、MgS042.5g/L、NaC12.5g/L、FeSO4.7H200.05g/L、MnSO4.4H200.05g/L，余量为水。
[0040]氨氮培养基按照如下方法制备=NH4Cl0.4g/L、琥珀酸钠2.17g/L、维氏盐溶液50mL，将上述成分按相应浓度或体积用蒸馏水溶解并定容配制成IL溶液。
[0041]实施例1、菌的筛选及鉴定
[0042]一、施氏假单胞菌150-2[0043](一)从北京昌平养殖区、周边县市养殖水体和种植农作物的土样中采集的436株好氧反硝化菌中筛选出施氏假单胞菌150-2
[0044]该种菌株可用LB培养基培养，培养基成分如下:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、蒸馏水1000mL,配制成IL液体培养基，pH7.0。37°C恒温震荡培养。
[0045]该菌的筛选过程如下:将从水样和土样中得到的436株细菌在BTB选择性培养基中分离培养24h，挑取特异性单菌落，接入氨氮培养基驯化，然后用氨氮培养基扩大培养，离心测定氨氮、硝酸氮、亚硝酸氮含量等指标，选取降解氨氮、亚硝酸氮能力较好的菌株。
[0046]150-2具有较高的反硝化能力，在以多种氮作为氮源时无亚硝酸盐及氨氮的积累，在多种碳源下均具有良好的去除亚硝酸盐能力，同时在50L鱼池模拟应用试验中对亚硝酸盐的控制能力较好。
[0047](二)150-2经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心鉴定并保藏
[0048]鉴定方法为16SDNA序列分析:以提取的150-2基因组DNA为模板，以扩增细菌16SrDNA的通用引物为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物测序，并将测序结果在GenBank数据库中进行 BLAST (http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源性比对,确定其种属。
[0049]150-2经鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri),该菌株于2013年03月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，其保藏编号为CGMCC N0.7363。
[0050]二、解淀粉芽孢杆菌150-4
[0051](一)从北京市昌平区某畜禽养殖场养殖动物的粪便中分离得到的406株芽孢杆菌中筛选出解淀粉芽孢杆菌150-4
[0052]150-4来源于北京市昌平区某畜禽养殖场养殖动物的粪便。
[0053]该种菌株可用LB培养基培养，培养基成分如下:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠log、蒸馏水1000mL,配制成IL液体培养基，pH7.0。37°C恒温震荡培养。
[0054]该菌的筛选过程如下:将从北京市昌平区某畜禽养殖场养殖动物的粪便中分离得到的406株芽孢杆菌在BTB选择性培养基中分离培养24h，挑取特异性单菌落，接入氨氮培养基驯化，后用氨氮培养基扩大培养，离心测定氨氮、硝酸氮、亚硝氮含量等指标，选取降解氨氮、亚硝酸氮能力较好的菌株。
[0055]1、芽孢杆菌的初筛[0056]采用养鱼废水作为培养基，对上述406株芽孢杆菌在养殖废水中作用时间为48h，每隔6h取水样检测亚硝酸盐及氨氮含量，进行初步筛选。
[0057]使亚硝酸盐浓度降低的菌株共119株，其中亚硝酸盐去除率100%的有95株，而同时具有100%去除亚硝酸盐的去除率及氨氮去除能力的菌株为19株，如表1所示。
[0058]表1芽孢杆菌的初筛
[0059]
【权利要求】
1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其保藏编号为CGMCCN0.7364。
2.一种复配菌，由保藏编号为CGMCC N0.7364的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和保藏编号为 CGMCC N0.7365 的盐田盐单胞菌(Halomonascampisalis)组成。
3.一种复配菌，由保藏编号为CGMCC N0.7363的施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri )、保藏编号为 CGMCC N0.7364 的解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和保藏编号为CGMCC N0.7365的盐田盐单胞菌(Halomonas campisalis)组成。
4.根据权利要求3所述的复配菌，其特征在于:所述复配菌中保藏编号为CGMCCN0.7363的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、保藏编号为CGMCC N0.7364的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和保藏编号为CGMCC N0.7365的的盐田盐单胞菌(Halomonascampisalis)的数量比为 1:1:1。
5.一种消除亚硝酸盐的制剂，该制剂由权利要求3或4所述的复配菌和碳源组成。
6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于:所述复配菌中的各菌与所述碳源的比例均为 IO10Cfu:lg。
7.根据权利要求5或6所述的制剂，其特征在于:所述碳源为葡萄糖。
8.权利要求1-4任一所述的菌、权利要求5-7任一所述的制剂在降低水体中亚硝酸盐和/或氨氮含量中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述水体为鱼塘水体。
【文档编号】C02F3/34GK103667122SQ201310613192
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】谯仕彦, 丁修良, 王炜宏, 郑玉琦 申请人:北京龙科方舟生物工程技术有限公司