一株酵母菌及其在纳米金合成中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一株酵母菌ingens LH-Fl及其在纳米金合成中的应用。
【背景技术】
[0002]纳米材料由于具有独特的力学、热学、声学、光学、电磁学等性质，在传感技术、信息储存、光电催化、生物标记、药物载体、临床治疗等领域中有着重要的潜在应用价值。纳米金颗粒作为纳米材料的一员，其合成与应用一直受到研宄者的广泛关注。然而，传统的物理、化学合成方法存在能耗高、成本高、需要使用有毒材料或试剂等问题。因此，开发绿色环保、经济简便的纳米金合成方法已变得越来越重要。微生物法凭借环境友好、条件温和、绿色低毒等优势已逐渐成为纳米金合成领域的研宄热点。
[0003]目前已报道了多种微生物具有合成纳米金的能力，包括细菌、真菌、放线菌、病毒等，它们可以在胞内或胞外等不同位点合成多种形貌的纳米金颗粒，如球形、三角形、六边形等。与其他微生物相比，真菌合成纳米金具有显著的优势:真菌在流动压力、震荡等不良环境条件下具有较好的稳定性，能够分泌丰富的胞外蛋白/酶用于催化纳米金的合成，得到的纳米颗粒分散性好，形貌多样，下游工艺及分离方法简单，具有工业化应用前景。目前报道的典型的纳米金合成真菌有Aspergillus fumigatus、Penicillium、Rhizopusoryzae > Trichodertm viride、Trichothecium、Vertici 11 iurr^。
[0004]酵母菌，作为一种单细胞真菌，在纳米材料的生物合成中也有着重要的应用，如量子点(MS、金属氧化物T12等，然而在纳米金合成中的报道相对较少。Gericke和Pinches研宄发现毕赤酵母菌Pichia j'at/iflii可以在胞内合成纳米金，其尺寸小于100nm (HydrometalIurgy, 2006, 83: 132-140)。Agnihotri 等研宄发现热带海洋酵母菌Yarrowia Iipolytica NCIM 3589可以合成三角形、六边形等形貌的纳米金(MaterialsLetters, 2009, 63: 1231-1234)。本实验室前期从大连黑石礁近海底泥中分离得到一株酵母菌Magnus1myces ingens LH-FI，其在好氧条件下对多种偶氮染料具有较好脱色能力，如酸性红B、酸性红3R、酸性橙II等(B1resource Technology, 2014, 158:321-328)。然而，目前尚未有研宄报道利用酵母菌进行纳米金的合成。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一株具有纳米金合成能力的酵母菌Magnus1mycesingens LH-FI,以及该菌株在还原HAuCl4合成纳米金颗粒中的应用。
[0006]本发明涉及的酵母菌ingens LH-Fl为前期从大连近海底泥中筛选得到，具有多种偶氮染料好氧脱色的能力。该菌株于2015年I月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.10367。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研宄所。
[0007]菌株LH-Fl在固体培养基中呈乳白色，表面皱褶，边缘不规则，易挑起；菌株在含有 KH2PO4 I g/L，MgS047H20 0.5 g/L，(NH4)2SO4 I g/L，葡萄糖 4 g/L 的培养基中，30°C，150r/min条件下培养32~36小时可生长至稳定期。
[0008]一株酵母菌ingens LH-Fl在纳米金合成中的应用，包含以下步骤:
(1)将酵母菌ingens LH-F1 接种于含有 KH2PO4 I g/L，MgS047H20 0.5g/L, (NH4)2SO4 I g/L，葡萄糖4 g/L的培养基中，好氧培养28~32 h至对数期末期，离心收集菌体，用灭菌的超纯水洗涤并制备菌悬液；
(2)在菌悬液中加入撤11(:14进行生物转化反应制备纳米金颗粒，纳米金的制备条件为:菌悬液OD6J直为2.0-2.5，HAuCl 4浓度为0.5-2.0 mmol/L,反应温度为30°C，摇床转速为150 r/min，反应时间为16-20 h。
[0009]所述酵母菌焊ces ingens LH-Fl制备生成的纳米金颗粒为三角形或六边形，并以三角形为主。
[0010]本发明的有益效果:酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl于2015年I月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.10367。该菌株在30°C下可催化0.5~2.0 mmol/L HAuCl4^成以三角形片状为主要形貌的纳米金颗粒，反应16 h即可达到稳定。酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl为纳米金材料的生物制备提供了一种新的微生物资源，该菌株合成纳米金的反应条件温和，操作简单，反应时间短，成本低，具有潜在的工业化应用前景。
【附图说明】
[0011]图1 为酵母菌 Magnus1myces ingens LH-Fl 的生长曲线。
[0012]图2为酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl合成纳米金过程的紫外_可见光全波长扫描图。
[0013]图3为酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl利用不同浓度HAuCl4合成纳米金的紫外-可见光全波长扫描图。
[0014]图4为酵母菌ingens LH-Fl合成的纳米金的扫描电镜图。
[0015]图5为酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl合成的纳米金的透射电镜图。
【具体实施方式】
[0016]以下结合实施例对本发明作进一步说明。
[0017]实施例1:酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl生长曲线的测定
将酵母菌焊ces ingens LH-Fl按照体积百分比5%的接种量接入100 mL培养基中，在30°C，150 r/min条件下振荡培养48 h，每隔4 h取样米用紫外-可见分光光度计测量600 nm处的吸光度((?_值)。结果表明(图1)，菌株LH-Fl生长较快，培养8 h后进入对数生长期，培养32~36 h后进入稳定生长期。
[0018]上述所用培养基的成分为:KH2PO4I g/L，MgS047H20 0.5 g/L，(NH4)2SO4 I g/L，葡萄糖4 g/L ο所用培养基均在115°C下灭菌15 min后使用。
[0019]实施例2:酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl合成纳米金的应用步骤1:根据实施例1的方法，培养酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl至对数期末期，于10000 g下离心10 min，去除上清，收集菌体，用灭菌的超纯水洗涤2次，并用超纯水制备菌悬液，调节OD_值为2.0-2.5。
[0020]步骤2:取2 mL步骤I中制备的菌悬液于5 mL离心管中，加入HAuCl4使其终浓度为1.0 mmol/L，将培养液于150 r/min, 30°C摇床中振荡孵育16~20 h，合成纳米金颗粒。
[0021]在反应过程不同时间取样，于3000 g下离心5 min，取上清液利用紫外-可见分光光度计进行全波长扫描。结果如图2所示，在反应前8 h时，紫外-可见全波长扫描图中没有明显的吸收峰；反应10 h后，在550 nm处出现了纳米金颗粒的特征吸收峰，且随着反应时间的延长，特征峰强度逐渐增加，反应16 h后基本趋于稳定。与之对应的实验现象是，培养液颜色由最开始的淡黄色(HAuCl4的颜色)逐渐变为紫色(纳米金颗粒的颜色)，并且紫色程度逐渐加深，在反应16 h后紫色程度基本一致，说明生成的纳米金颗粒主要为紫色物质。
[0022]实施例3:酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl利用不同浓度的撤11(^14合成纳米金
根据实施例2步骤I制备酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl菌悬液(00_为
2.0-2.5)，取2 mL菌悬液于5 mL离心管中，分别加入HAuCl4使其终浓度为0.1,0.5,1.0、
2.0和5.0 mmol/L，将培养液于150 r/min, 30°C摇床中振荡孵育16~20 h，然后将培养液在3000 g下离心5 min，取上清液利用紫外-可见分光光度计进行全波长扫描。结果如图3所示，当HAuCl4浓度为0.1 mmol/L时，紫外-可见全波长扫描图中没有明显的吸收峰，生成的纳米金含量很低；当HAuC14&度大于0.5 mmol/L时，紫外-可见全波长扫描图中有明显的纳米金特征峰，且峰强度随HAuCl4浓度的升高而增加；而当HAuCl 4浓度为5.0 mmol/L时，紫外-可见全波长扫描图中没有明显的吸收峰，说明过高浓度的HAuCl4对纳米金的合成具有一定的抑制作用。
[0023]实施例4:酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl合成纳米金的扫描电镜与透射电镜表征
根据实施例2的方法制备的纳米金颗粒，将得到的产物进行扫描电镜与透射电镜表征，结果如图4和图5所示。酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl催化HAuCl4^成的纳米金颗粒大多呈现片状形貌，包括三角形、六边形等，其中以三角形为主；生成的纳米片大小不一，粒径尺度为50~400 nm。
【主权项】
1.一株酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl，其特征在于:所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.10367，保藏日期为2015年I月19日。
2.根据权利要求1所述的一株酵母菌Magnus1mycesingens LH-Fl在纳米金合成中的应用，其特征在于包含以下步骤: (1)将酵母菌ingensLH-F1 接种于含有KH2PO4 I g/L，MgSO4.7Η20 0.5g/L，(NH4)2SO4 I g/L，葡萄糖4 g/L的培养基中，好氧培养28~32 h至对数期末期，离心收集菌体，用灭菌的超纯水洗涤并制备菌悬液； (2)在菌悬液中加入撤11(:14进行生物转化反应制备纳米金颗粒，纳米金的制备条件为:菌悬液OD6J直为2.0-2.5，HAuCl 4浓度为0.5-2.0 mmol/L,反应温度为30°C，摇床转速为150 r/min，反应时间为16-20 h。
3.根据权利要求2所述的一株酵母菌Magnus1mycesingens LH-Fl在纳米金合成中的应用，其特征在于:所述酵母菌Magmis1myces ingens LH-Fl制备生成的纳米金颗粒为三角形或六边形。
【专利摘要】本发明公开一株酵母菌及其在纳米金合成中的应用，属于生物技术领域。该酵母菌为Magnusiomyces ingens LH-F1，于2015年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 10367。该菌株在30℃下可催化0.5~2.0 mmol/L HAuCl4合成以三角形片状为主要形貌的纳米金颗粒，反应16 h即可达到稳定。该菌株合成纳米金反应条件温和，操作简单，反应时间短，成本低，具有潜在的工业化应用前景。CGMCC No. 1036720150119
【IPC分类】C12R1-645, C12P3-00, C12N1-16
【公开号】CN104762221
【申请号】CN201510180584
【发明人】曲媛媛, 张照婧, 张旭旺, 沈文丽, 李会杰, 厉舒帧, 马桥, 周集体
【申请人】大连理工大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月17日