专利名称：一种微囊化酵母菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可在肠道内生长代谢并分泌基因工程药物的微囊化酵母菌。
本发明还涉及上述微囊化酵母菌在治疗疾病中的应用。
背景技术：
基因工程药物使许多疾病如肿瘤、免疫缺陷性疾病、遗传基因缺陷疾病等的治愈成为可能[文献1Pennisi E.Breakthrough of the year.Genomics comes of age.Science，2000，290(5500)2220-2221]、[文献2Peltonen L，McKusick VA.McKusick.Genomics and medicine.Dissectinghuman disease in the postgenomic era.Science，2001，291(5507)1224-1229]。但目前基因工程药物的使用尚存在一些问题，如基因工程药物多从基因工程菌(大肠杆菌或酵母菌)的代谢产物中提取，药物制备的分离纯化工艺复杂，成本高；基因工程药物目前的用药途径为注射给药。因此，降低药物生产成本及改变用药途径是目前国际有关基因工程药物的主要研究方向。
针对上述问题，加拿大Chang TMS[文献3S.Prakash，T.M.S.Chang.Invitro and in vivo uric acid lowering by artificial cells containingmicroencapsulated genetically engineered E.coli DH5 cells.The internationaljournal of artificial organs，2000，23(7)429-435]、[文献4Chang ThomasM.S.，Prakash Satya.Microencapsulated genetically engineeredmicroorganisms for clinical application.United States Patent 6,217,859，April17，2001]等将代谢尿素的脲激酶基因转入大肠杆菌，并将其包埋在海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-polylysine-alginate，APA)微胶囊中，直接口服微胶囊达到治疗尿毒症目的。本专利申请人[文献5付颖丽，雄鹰，刘袖洞，于炜婷，马小军。壳聚糖/海藻酸钠微胶囊固定化大肠杆菌的研究。生物工程学报，2002，18(2)239-241]研究表明海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(alginate-chitosan-alginate，ACA)微胶囊包埋的大肠杆菌口服后可通过肠道回收。
上述研究有以下不足之处第一，在菌种的选择上，大肠杆菌作为肠道细胞微反应器的宿主菌限制了微反应器的应用范围。因为①大肠杆菌是原核细胞，表达的蛋白产物多以包含体的形式聚集在细胞质内，无法分泌到细胞外；②大肠杆菌表达的蛋白产物不能进行转录后的修饰加工，常常没有生物活性；③大肠杆菌作为基因工程菌的宿主细胞无法表达长基因片段；④大肠杆菌作为口服剂型由于有臭味而很难被患者接受；⑤大肠杆菌多为条件致病菌，其毒理问题尚需考察。
第二，作为微反应器的载体材料-聚赖氨酸，价格昂贵($345/g)。
第三，单独使用壳聚糖作为成膜材料制备ACA微胶囊降低了的生产成本，但机械强度没有使用聚赖氨酸制备的APA微胶囊理想。
除上述文献的报道外，尚未见有聚赖氨酸亲小肠黏附性能的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微囊化酵母菌，口服后其可在肠道内生产基因工程药物，其优点是第一，克服了大肠杆菌的不足，扩展了肠道细胞微反应器的应用范围。第二，通过在成膜材料中壳聚糖的加入减少了聚赖氨酸的用量，从而综合了聚赖氨酸的成膜强度、壳聚糖的价格及原材料制备技术优势。
为实现上述目的，本发明采用海藻酸钠、聚赖氨酸、壳聚糖(alginate-poly-lysine/chitosan-alginate，APCA)复合材料制备微胶囊并包埋有基因工程酵母菌。该微囊化的酵母菌经直接口服，作为肠道内细胞微反应器，使微胶囊内的酵母细胞在肠道内生长代谢，分泌目标产物达到治疗目的。本发明采用的酵母菌为基因工程酵母菌，包括各种组成型或诱导型分泌表达药用生物活性蛋白的基因工程酵母菌。
其制备方法是在原有海藻酸盐固定化细胞的基础上，通过大功率微胶囊制备仪，使均匀混合有酵母细胞的海藻酸钠溶液在高压静电场作用下，形成粒径在100-1000μm可控、分布均匀的液滴，与钙溶液固化形成微胶珠，并在微胶珠表面通过离子络合反应瞬间形成一层聚赖氨酸/壳聚糖微胶囊膜，再用柠檬酸钠溶液置换出海藻酸钙凝胶中的钙，使微胶囊内液化成液体环境，得到包埋有酵母菌的海藻酸钠-聚赖氨酸-壳聚糖微胶囊(APCA微胶囊)，该微胶囊中酵母菌含量为106-1010个/ml。APCA微胶囊膜本身对分子量在1-15万Da的蛋白药物有明显控释作用，增强了药物的生物利用度。由于本发明的微囊化酵母菌是在生理条件下制备，pH6.0-7.0，20-37℃，1个大气压，无震荡及剪切，制备过程中对酵母菌活性没有损害。
关于本发明的制备过程不是本发明所要讨论的重点，而且微囊化的制备技术已较普遍，本领域的技术人员很容易理解和掌握，所以本发明对此不作详细描述。有关制备过程请参见图1。
本发明提供的包埋酵母菌的APCA微胶囊在胃肠道内无破损，特异性粘附小肠黏膜10小时以上。本发明的微囊化酵母菌在肠道内与游离酵母菌相比，细胞存活率提高200倍以上。
本发明提供的微囊化酵母菌在肠道内生长代谢并分泌基因工程药物，可用于治疗尿毒症、肝功衰竭、苯丙酮酸尿症、内分泌性疾病、神经变性疾病、遗传性疾病及恶性肿瘤等疾病。
本发明提供的包埋有酵母菌的APCA微胶囊在肠道内生产基因工程药物的原理请参见图2。
图1为本发明微胶囊制备示意图。
图2为本发明包埋有酵母菌的APCA微胶囊在肠道内生产基因工程药物的原理。
图3a为40倍显微镜下的本发明APCA微囊化saccharomycete GS115细胞。
图3b是该细胞在模拟胃液中的形态变化。
图3c是该细胞在模拟肠液中的形态变化。
具体实施例方式
例1在生理条件下制备出含有酵母菌的APCA微胶囊，制备过程中酵母菌存活率100％，酵母菌含量108个/ml微胶囊，微胶囊粒径在100-1000μm精确可控。
例2含有酵母菌的APCA微胶囊经模拟胃、肠液处理后，微胶囊形态保持完整，没有破损(见图3)。
例3含有酵母菌的APCA微胶囊经模拟胃、肠液处理后，生理破囊液溶解微胶囊，释放出酵母菌，用稀释平板法测定存活的酵母菌数，与未处理前相比计算酵母菌存活率，与游离酵母菌相比其囊内细胞存活率提高200倍以上。
例4将含有酪氨酸羟化酶基因的基因工程酵母菌包埋在APCA微胶囊中给帕金森模型鼠口服后，酵母菌在小鼠肠道内以内源性酪氨酸为底物，在酪氨酸羟化酶的作用下，生成多巴胺，经肠道吸收入血，可以纠正帕金森模型鼠的震颤行为。
权利要求
1.一种微囊化酵母菌，为包埋有酵母菌的海藻酸钠-聚赖氨酸-壳聚糖微胶囊，其粒径为100-1000μm，表面为一层聚赖氨酸/壳聚糖微胶囊膜，该微胶囊内为液体环境，其中酵母菌含量为106-1010个/ml。
2.如权利要求1所述的微囊化酵母菌，其特征在于，所述酵母菌为基因工程酵母菌，包括各种组成型或诱导型分泌表达药用生物活性蛋白的基因工程酵母菌。
3.如权利要求1所述的微囊化酵母菌，其特征在于，所述酵母菌由微胶囊的保护，在肠道内继续存活，生长代谢分泌蛋白多肽类药物。
4.如权利要求1所述的微囊化酵母菌，其特征在于，包埋有酵母菌的微胶囊在胃肠道内无破损，特异粘附在小肠黏膜10小时以上，
5.如权利要求1所述的微囊化酵母菌，其特征在于，所述微胶囊膜对分子量在1-15万Da的蛋白药物有控释作用。
6.如上述任一项权利要求所述的微囊化酵母菌在治疗尿毒症、肝功衰竭、苯丙酮酸尿症、内分泌性疾病、神经变性疾病、遗传性疾病及恶性肿瘤的应用。
全文摘要
一种微囊化酵母菌，为包埋有基因工程酵母菌的海藻酸钠－聚赖氨酸－壳聚糖微胶囊，其粒径为100－1000μm，表面为一层聚赖氨酸/壳聚糖微胶囊膜，该微胶囊内为液体环境，其中酵母菌含量为10
文档编号A61K9/50GK1589777SQ03155728
公开日2005年3月9日 申请日期2003年9月1日 优先权日2003年9月1日
发明者马小军, 于炜婷, 雄鹰 申请人:中国科学院大连化学物理研究所