专利名称：一种胡椒果皮脱胶菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种胡椒果皮脱胶菌及其在胡椒果实脱皮 中的应用。
背景技术：
胡椒(Piper nigrum L.)属胡椒科(Piperaceae)胡椒属(Piper)多年生常绿藤 本植物，原产于印度，是世界重要的热带香辛料作物，是人们喜爱的调味品，在镇痛、镇静、 抗炎、抗惊厥、保肝、杀虫、抗癌等多方面存在活性，广泛用于医学工业和食品工业。胡椒的初产品主要为黑胡椒和白胡椒，黑胡椒是由胡椒鲜果直接晒干而成，而传 统的白胡椒生产方法是由胡椒鲜果经浸泡脱皮后晒干而成，白胡椒较之黑胡椒具有香辣味 柔和，色泽淡雅等优势，目前世界市场对于白胡椒的需求正日益增长。目前白胡椒的加工技 术仍以传统的水怄脱皮法为主，造成产品大小不均勻，外观差，不能满足胡椒加工产业化的 发展要求，阻碍了我国胡椒的大规模出口，严重制约了国内胡椒种植业和加工业的可持续 发展。脱皮是胡椒初加工中的关键工序，通常采用水怄脱皮、机械脱皮，酶法脱皮和微生 物法脱皮4种。传统的水怄法脱皮存在着加工周期长、占地面积大、耗水量大、劳动强度大 等缺陷，易造成黑白胡椒粒的混杂和微生物的污染；机械脱皮法存在大量消耗化工原料和 热量、成本高、胡椒受损和脱胶废液难以完全符合国家废水排放标准等问题；酶法脱皮总成 本高，而微生物脱皮法具有“高产、优质、高效、节能、低污染”等特点是胡椒脱皮工艺的发展 方向。目前，专门针对胡椒脱皮进行的微生物筛选报道较少，参见Vaidyanatha LyerThankaman，Raghavan Nair Giridhar. Fermentative production of white pepper using indigenous bacterial isolates.Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2004,9:435-439;以及唐坚，刘四新，谭勇，等.胡椒果皮脱胶菌株的筛选[J].广东农业科 学，2009，7 :194-195.，但其筛选的菌株用于胡椒脱皮需4_5d才能将胡椒果皮脱除干净，还 没有真正实现高效快捷。
发明内容
本发明目的在于针对目前胡椒脱皮周期长的缺陷，提供一种胡椒果皮脱胶菌，利 用本发明所述胡椒果皮脱胶菌培养液的上清浸泡胡椒果实，2天内可将胡椒果皮脱除干净， 方便快捷。本发明所述胡椒果皮脱胶菌WCZC0110是经分离培养基初筛、发酵培养基复筛和 胡椒鲜果脱皮效果实验筛选出的菌株，已于2010年7月20日保藏于中国典型培养物保藏 中心，菌种保藏号=CCTCC M2010184，鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。对菌株WCZC0110进行16S rRNA基因序列分析，结果表明，菌株WCZC0110的16S rRNA基因序列与芽孢杆菌属(Bacillus)同源，其生物学特征为菌体直杆状；大小约为0. 6X3. 6 μ m ；菌株为革兰氏染色反应阳性菌，G+ ；好氧；V-P试验阳性；接触酶阳性；能分解 果胶。本发明所述胡椒果皮脱胶菌WCZC0110在4h后进入对数生长期，12h后进入生长 的稳定期；培养4-52h内产果胶酶量较高，在24h有一个产酶高峰值；在25-40°C下培养均 能产较高活性的果胶酶，最适温度为30°C ；培养液初始pH为6. 0-9. 0时所产果胶酶活性较 高，其最适PH为7. 5。本发明所述胡椒果皮高效脱胶菌WCZC0110，其培养液可用于提高植物果实的 脱皮效率，特别适用于胡椒鲜果的脱皮。其优选的脱皮方法是将胡椒果皮高效脱胶菌 WCZCOl 10进行培养，其培养条件为温度25-40°C，种龄6_12h，培养液初始pH6. 0-9. 0，发酵 4-52h，培养液离心取上清用于胡椒脱皮，2d内可将胡椒果皮脱除干净，作为优选，所述离心 为 15000r/min 离心 5min。与现有技术相比，本发明所述胡椒果皮脱胶菌的培养液离心后的上清在25-40°C 下，浸泡胡椒鲜果，脱皮30-48h，可使胡椒鲜果的果皮腐化；脱皮后的胡椒经漂白、干燥处 理后，即得白胡椒粒。整个过程周期短，操作简单，可在2天以内加工出品质高的白胡椒，解 决了我国在白胡椒加工中存在的周期长、劳动强度大，品质低等难题，为胡椒优质、高效、节 能、低污染型加工技术体系提供技术支撑。生物材料保藏信息保藏日期2010年7月20日；保藏机构保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址武汉大学；菌种保藏号CCTCCM 2010184 ；分类命名芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。
图1示本发明所述胡椒果皮脱胶菌WCZC0110生长曲线；图2示本发明所述胡椒果皮脱胶菌WCZC0110产酶曲线。
具体实施例方式本发明公开了保藏编号为CCTCC M 201018的胡椒果皮脱胶菌WCZCOl 10及其在胡 椒果实脱皮中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需 要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为 包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在 不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。以下结合阐述实施例，进一步阐述本发明。实施例1 菌株的分离纯化从海南文昌、琼海、海口、万宁等地的胡椒种植区采集土样及胡椒怄液样品，各称 取20g或吸取20mL样品，置于含IOOmL无菌水的500mL三角瓶中，于30°C摇床中100r/min 振荡培养Id ；取上清或混合液ImL移入50mL富集培养基中富集培养ld，取ImL混合液加入盛有9ml无菌水的25mL试管中充分混勻，制成稀释度10—1，10_2，10_3，10_4、10_5、10_6的悬液； 然后对10_4、10_5、ΙΟ"6三个梯度各取0. ImL涂牛肉膏蛋白胨平板，每个稀释度各做3块平板， 30°C下培养3d。挑取平板上形态不同的菌落，在牛肉膏蛋白胨平板上划线纯化；将纯化后 的菌转接至牛肉膏蛋白胨斜面上，30°C下培养3d，4°C下保存备用。所述富集培养基配制方法各组分含量(g/L) (NH4)2SCM 6. 0，KH2PO4 4. 5，K2HPO4 10. 5，酵母粉3. 0，果胶2. 0，用蒸馏水定容，调节pH值为7. 5，121°C灭菌20min。实施例2 菌株初筛将实施例1中分离的菌落，点种于分离培养基上，选择在分离培养基上产生较大 黄色变色圈的菌株。由于分离培养基中加入了 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液作为pH指示剂，果 胶酶产生菌降解培养基中的果胶产生D-半乳糖醛酸，培养基即由原来的紫色变为黄色，产 生变色圈。经过初筛，共筛选出菌株20株。所述分离培养基配制方法各组分含量(g/L) (NH4)2SO4 6. 0，KH2PO4 4. 5，K2HPO4 10. 5，酵母粉1. 5，果胶2. 0，琼脂20. 0，用蒸馏水定容至IOOOmL,调节pH值至7. 0，加1. 6% 溴甲酚紫乙醇溶液3mL，121°C灭菌20min。实施例3 菌株复筛将实施例2中筛选的菌株20株，接种于种子培养基中，30°C培养18h，然后以3% 的量接种于发酵培养基中，30°C、200r/min培养2_3d后，15000r/min离心5min，取上清，测 定果胶酶活力，结果见表1。表1菌株复筛酶活力测定结果 由表1可知，果胶酶活力较强的5株菌株分别是QHOO17，WCZCO110，HK0041，QH0002 和HK0036，其中菌株WCZCOl 10所产果胶酶活力最强，达466. 3U/mL。种子培养基为本领域中众所周知的牛肉膏蛋白胨培养基；果胶酶活力的测定方法 是利用本领域的已知方法(参见王小敏，吴文龙，闾连飞，等.分光光度计法测定果胶酶活 力的方法研究[J].食品工业科技，2007，28 (5) :227-229.)。所述发酵培养基配制方法各 组分含量(g/L)硫酸铵10. 0、酵母粉5. 0、果胶2. O.NaCl 2. 0、MgS04 · 7H20 1. 0，用蒸馏水 定容至IOOOmL,调节pH值至7. 0，121°C灭菌20min。实施例4 胡椒鲜果脱皮效果实验将实施例3 中筛选出的 5 株菌 QH0017，WCZCOl 10，HK0041，QH0002 和 HK0036，接入 种子培养基，30°C、200r/min培养ld，按3%的接种量接种于含IOOmL发酵培养基的500mL 三角瓶中，30°C、200r/min好氧培养24h ；培养液经1，5000r/min离心5min ；取上清各5mL， 加入到装有25g胡椒的250mL三角瓶中，各瓶中加蒸馏水lOOmL，30°C下静置脱皮，每隔6h 取出观察脱皮效果，结果见表3。胡椒的选择应符合《胡椒栽培技术规程》(NY-T 969-2006)的成熟果穗，即至少有 2-4粒果变红或整穗果变黄的果穗。胡椒鲜果脱皮程度分5级0级不脱皮；1级少量脱皮；2级半脱皮；3级大部分脱 皮；4级完全脱皮。胡椒经脱胶菌所产酶液脱皮后，清洗、护色、晾晒后得白胡椒产品，对其 进行感官评价，评价标准见表2。表2.感官评价表 表3.胡椒鲜果脱皮实验结果 由表2、3可知，采用对照组CK方法(传统水怄法脱皮)脱皮，周期长，脱皮程度 低，为3级，感官评价为中，且白胡椒比例低；而菌株WCZC0110，HK0041和QH0002不仅脱皮 完全，均达4级，而且白胡椒比例高；从脱皮时间看，WCZC0110最短为2d，感官评价最好，达 到优等。综合上述实验结果，确定菌株WCZCOl 10为高效胡椒果皮脱胶菌。菌株WCZC0110已于2010年7月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏 号CCTCC M 201018，鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。实施例5 对菌株WCZCOl 10进行16S rRNA基因序列分析对菌株WCZCOl 10进行16S rRNA基因序列分析，结果表明，WCZCO110的16S rRNA 基因序列与芽孢杆菌属(Bacillus)同源性达99%，结合生理生化特性实验，将WCZC0110 鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，其主要生物学特征为菌体直杆状；大小约为 0. 6X3. 6 μ m ；革兰氏染色反应阳性；好氧；V-P试验阳性；接触酶阳性；能分解果胶。实施例6 菌株WCZC0110生长曲线的确定挑取单菌落接种于IOmL的种子培养基中，在30°C下，200r/min培养，每隔2h，用 723分光光度计测定600nm下的吸光度值。结果如图1，菌株WCZCOl 10在4h后进入对数生 长期，在6-12h为其对数生长期末期，12h后进入生长的稳定期。在菌株WCZC0110处于对数 生长期的中后期接种，有利于缩短发酵周期和较高的接种量，因而确定其种龄为6-12h，可 为其在胡椒鲜果脱皮工艺中的应用提供依据。实施例7 菌株WCZC0110产酶曲线的确定 按照实施例6所确定的种龄，按照3%的接种量接种于IOOmL发酵培养基中，30°C、 200r/min培养，利用本领域的已知方法每隔4h测定果胶酶的活性，果胶酶活力的测定方法 参见(王小敏，吴文龙，闾连飞，等.分光光度计法测定果胶酶活力的方法研究[J].食品工 业科技，2007，28 (5) :227-229.)。结果如图2所示，菌株WCZCOl 10的产酶曲线为先上升后 下降，在4-52h范围内产酶量较高，在24h有一个产酶高峰值，可为其在胡椒鲜果脱皮工艺 中的应用提供依据。实施例8 温度对菌株WCZCOl 10产酶活性的影响设定发酵温度分别为4°C，15°C，200C，25°C，30°C，35°C，40°C，45°C，按照实施例 6 所确定的种龄，种子液按照3%的接种量接种于IOOmL发酵培养基中，在200r/min培养，发 酵24h后，分别测定果胶酶的活性，研究温度对菌株WCZC0110产酶活性的影响。结果显示，
7菌株WCZC0110在25-40°C下均能产较高活性的果胶酶，最适温度为30°C，可为其在胡椒鲜 果脱皮工艺中的应用提供依据。。实施例9 初始pH值对WCZCOl 10产酶活性的影响设定培养液初始pH 值分别为 4. 0，4. 5，5. 0，5. 5，6. 0，6. 5，7. 0，7. 5，8. 0，8. 5，9. 0，
9. 5，按照实施例6所确定的种龄，种子液按照3%的接种量接种于IOOmL发酵培养基中， 在30°C，200r/min下培养，发酵40h后，分别测定果胶酶的活性，研究初始pH值对菌株 WCZCOl 10产酶活性的影响。结果显示，菌株WCZCOl 10在培养液初始pH为6. 0-9. 0均能产 较高活性的果胶酶，产果胶酶的最适PH为7. 5，可为其在胡椒鲜果脱皮工艺中的应用提供 依据。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
权利要求
一种胡椒果皮脱胶菌，保藏编号为CCTCC M 2010184。
2.根据权利要求1所述胡椒果皮脱胶菌在胡椒果实脱皮中的应用。
3.一种胡椒果实脱皮的方法，其特征在于，取处于对数生长期的胡椒果皮脱胶菌CCTCC M 2010184在初始pH为6. 0-9. 0的发酵培养基中25_40°C培养4_52h，取培养液离心，取上 清液浸泡胡椒果实30-48h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养温度为30°C。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基初始pH值为7.5。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养时间为24h。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述离心为15000r/min离心5min。
全文摘要
本发明涉及微生物技术领域，公开了一种胡椒果皮脱胶菌，其保藏编号为CCTCC No.M2010184，分类命名为芽孢杆菌。本发明还提供所述胡椒果皮脱胶菌在胡椒果实脱皮中的应用。将所述胡椒果皮脱胶菌培养4-52h后，将其培养液离心后，取上清液浸泡胡椒果实，2天内可将胡椒果皮脱除干净。利用本发明所述胡椒果皮脱胶菌进行胡椒果实脱皮高效、节能、低污染，具有广泛的推广价值。
文档编号C12N1/20GK101892184SQ20101024177
公开日2010年11月24日 申请日期2010年8月2日 优先权日2010年8月2日
发明者万祝宁, 何艾, 冯建成, 崔璐, 张容鹄, 窦志浩, 谢辉, 谭勇 申请人:海南省农业科学院农产品加工设计研究所