专利名称：分枝杆菌噬菌体d29颗粒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分枝杆菌噬菌体D29颗粒及其制备方法和应用。
背景技术：
结核病一直是对人类健康威胁很大的人畜共患传染病，特别是近二、三十年来由于人口流动、广泛耐药和多重耐药结核菌(MDR-TB)传播、艾滋病等因素影响，结核病疫情在全球范围内回升。世界卫生组织(WHO)曾于1993年宣布全球结核病紧急状态；1998年又重申遏制结核行动刻不容缓，并把每年的3月24日定为世界防治结核病日。WHO最新数据表明2009年新增结核病人940万人，死于结核的病人达170万人；2008年新增MDR-TB 病人44万人，死于MDR-TB的则达15万人。我国是全球22个结核病高负担的国家之一，并属于高耐药国家，结核病人数位居全球第二，多重耐药结核病占13.4%。但到目前为止，还没有理想的新型抗多重耐药结核的药物可用于临床。噬菌体(Bacteriophage，phage)是一类细菌病毒，对一些细菌具有高度的专一性，当噬菌体侵染这些细菌时，可在细菌中繁殖并杀死细菌，而它对动植物没有毒性。因此， 噬菌体以其特有的自然特征有望成为较好的抗菌药物。20世纪前叶，噬菌体曾经作为治疗、 预防细菌感染的有效工具，但随着抗生素的发明与广泛应用，许多国家对此未进行深入研究。然而，面对耐药菌感染比例的不断增长，有人预言噬菌体将成为近十年生物制药领域的一大研究热点。噬菌体已经成功地应用于多种动物细菌感染的治疗，如禽类、鱼类、犊牛、羔羊等。 对预防和治疗人的细菌性感染方面也有很多临床研究。Weber-Dabrowska等对20例肿瘤患者和27例细菌感染者使用噬菌体治疗，发现所有患者的化脓、创伤、肺炎等并发现象都很快消失。Bretscher等提出使用噬菌体治疗艾滋病的再度感染，可减缓艾滋病病毒耐多药进化的速度。分枝杆菌噬菌体D29是一种寄生于分枝杆菌的DNA病毒，由蛋白质外壳组成衣壳， 内为DNA，没有独立的代谢体系，必须与宿主菌结合进入胞内，利用宿主菌的代谢酶系进行复制，最终裂解细菌，释放出子代噬菌体。分枝杆菌噬菌体D29的病毒颗粒呈类圆形，大小在75 150nm之间，具有广谱宿主，包括耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌等。宿主在耻垢分枝杆菌中的增殖周期为90 180min，在结核分枝杆菌中的增殖周期为3 6h以上。分枝杆菌噬菌体D29已经普遍应用于结核分枝杆菌的快速检测及结核分枝杆菌耐药性的检测。分枝杆菌噬菌体D29用于抗结核治疗的研究中，体外实验发现分枝杆菌噬菌体D29可以减少体外生长的巨噬细胞内的耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌的活菌数量，具有杀灭巨噬细胞内宿主菌的能力，具有治疗结核病的可能；动物试验也证明分枝杆菌噬菌体D29可减轻结核病豚鼠的脏器病变程度和脏器荷菌量，具有与利福平接近，甚至更好的疗效，且对豚鼠没有副作用，有希望作为新型抗结核药物的开发对象。分枝杆菌噬菌体D29用于结核病治疗有其潜在优势。噬菌体具有高度的宿主特异性，只针对致病菌，不会影响到其他的菌群，因此具有无副作用的优点，同时减少了随之所带来的耐药性问题；噬菌体可以随宿主菌的增殖而增殖，并在细菌感染的整个过程中发挥作用，而不像抗生素那样随着时间的推移疗效逐渐降低。在分枝杆菌噬菌体D29用于结核病治疗的应用中，重点要解决的问题是如何到达作用部位以及以何种形式有效地到达作用部位。分枝杆菌噬菌体D29作为一种微生物，培养获得的产物一般都是包含培养介质的液体。相对于固体而言，液体在储存、运输和使用时存在不方便以及稳定性等问题，因此微生物产品欲制成药物的话，固体化有其优势。微生物制剂采用冷冻干燥对于固化过程中维持其稳定性有利，所以在微生物制剂的保存中通常都采用冷冻干燥法。
发明内容
本发明的目的是提供一种分枝杆菌噬菌体D29颗粒及其制备方法和应用。本发明提供的分枝杆菌噬菌体D29颗粒，它的活性成分由分枝杆菌噬菌体D29和保护剂(兼作稀释剂)组成；所述保护剂为糖和/或蛋白和/或氨基酸和/或醇。所述糖可为蔗糖、乳糖和海藻糖中的至少一种。所述蛋白可为奶粉和牛血清白蛋白中的至少一种。所述氨基酸可为亮氨酸。所述醇可为甘露醇。所述保护剂可为一种糖、也可为多种糖的混合物。所述糖可为蔗糖、乳糖和海藻糖中的至少一种。所述保护剂还可为蛋白，如奶粉(如脱脂奶粉)或牛血清白蛋白。所述保护剂还可为糖和蛋白的混合物，如乳糖和奶粉的混合物，或乳糖和牛血清白蛋白的混合物。 所述保护剂还可为糖和氨基酸的混合物，如乳糖和亮氨酸的混合物。所述保护剂还可为糖和醇的混合物，如乳糖和甘露醇的混合物。所述保护剂优选为如下⑴至(9)中的任意一种⑴蔗糖；(2)乳糖；(3)海藻糖；⑷乳糖和海藻糖；(5)乳糖和甘露醇；(6)奶粉；(7)乳糖和奶粉；⑶乳糖和牛血清白蛋白；(9)乳糖和亮氨酸。所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒具体可由所述分枝杆菌噬菌体D29、所述保护剂和水组成。所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒中，存活的分枝杆菌噬菌体D29的含量可为 1 X 102PFU/g至1 X 109PFU/g,水分的质量百分含量可为10 %以下；所述分枝杆菌噬菌体D29 颗粒的粒度中位值D50可为20 μ m以下。所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒中，存活的分枝杆菌噬菌体D29的含量优选为 lX104PFU/g至7X10TPFU/g，水分的质量百分含量最优选为至9% ；所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒的粒度中位值D50优选为5. 00 μ m至18. 00 μ m。所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒中，存活的分枝杆菌噬菌体D29的含量最优选为 1.99X 104PFU/g至6. 66X 107PFU/g，水分的质量百分含量最优选为1.23%至8. 30% ；所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒的粒度中位值D50最优选为5. 60 μ m至17. 31 μ m。所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒中，存活的分枝杆菌噬菌体D29的含量可为(2. 72士0. 73) X 104PFU/g 至(3. 10士 1. 12) X 104PFU/g，(3. 10士 1. 12) X IO4PFU/ g 至(1. 29 士 0. 16) X 106PFU/g，(1. 29 士0. 16) X 106PFU/g 至(1. 81 士0. 19) X IO6PFU/ g, (1. 81+0. 19) X 106PFU/g 至(1. 86 + 0. 10) X 106PFU/g, (1. 86 + 0. 10) X IO6PFU/ g 至(2. 06 士 0. 23) X 106PFU/g，(2. 06 士0. 23) X 106PFU/g 至(2. 41 士0. 12) X IO6PFU/g, (2. 41 士0. 12) X IO6PFU/g 至(4. 49 士0. 99) X 106PFU/g，(4. 49 士0. 99) X 106PFU/g 至 (6. 53 士 0. 13) X106PFU/g，或(6. 53 士 0. 13) X 106PFU/g 至(5. 14 士 1. 52) X 107PFU/g。所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒中，水分的质量百分含量可为(1.34士0. 11) %至 (2. 11 士0. 08) (2. 11 士0. 08) %M (2. 30士0. 57) (2. 30士0. 57) %M (2. 50士0. 20)
(2. 50士0. 20) %M (2. 74士0. 04) (2. 74士0. 04) %M (2. 84士0. 57) (2. 84士0. 57) % 至(2. 88 士 0.04) %、(2. 88 士 0.04) % 至(3. 27 士 0. 35) %、(3. 27 士 0. 35) % 至 (5. 08 士 0. 22) %、或(5. 08 士 0. 22) %至(8. 08 士 0. 27) %。所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒的粒度中位值D50可为(5. 65 士 0. 05) μ m 至(7. 49 + 0. 59) μ m、(7. 49 + 0. 59) μ m 至(7. 91 + 0. 39) μ m、(7. 91 + 0. 39) μ m 至(8. 14 + 0. 17) μ m、(8. 14 + 0. 17) μ m 至(8. 69 + 0. 94) μ m、(8. 69 + 0. 94) μ m 至(8. 94 + 0. 29) μ m、(8. 94 + 0. 29) μ m 至(9. 34 + 0. 40) μ m、(9. 34 + 0. 40) μ m 至 (10. 94 士 0. 45) μ m、(10. 94 士 0. 45) μ m 至(10. 56 士 0. 65) μ m、或(10. 56 士 0. 65) μ m 全 (15. 66 士 1. 65) μ mo本发明还保护所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒的制备方法，是将所述分枝杆菌噬菌体D29与所述保护剂作为原料一起进行固体化(固化)，得到分枝杆菌噬菌体D29颗粒。所述保护剂为乳糖和海藻糖时，所述乳糖和所述海藻糖作为原料的质量比优选为 1 1。所述保护剂为乳糖和奶粉时，所述乳糖和所述奶粉作为原料的质量比优选为1 5。 所述保护剂为乳糖和牛血清白蛋白时，所述乳糖和所述牛血清白蛋白作为原料的质量比优选为1 1。所述保护剂为乳糖和亮氨酸时，所述乳糖和所述亮氨酸作为原料的质量比优选为5 1。所述保护剂为乳糖和甘露醇时，所述乳糖和所述甘露醇作为原料的质量比优选为
1 Io所述保护剂与所述分枝杆菌噬菌体D29作为原料的配比可为Ig (IXlO4PFU 至1X1012PFU)。所述保护剂与所述分枝杆菌噬菌体D29作为原料的配比具体可为 Ig (IX IO6PFU至IX IOiqPFU)。所述保护剂与所述分枝杆菌噬菌体D29作为原料的配比具体优选为 Ig (1. 88 X IO6PFU 至 5. 16 X IO9PFU)。所述保护剂与所述分枝杆菌噬菌体D29作为原料的配比可为 Ig (2. 68士0. 80) XlO6PFU 至(0. 74士0. 40) X 108PFU、Ig (0. 74士0. 40) X IO8PFU 至(0. 96士0. 09) X IO8PFUUg (0. 96士0. 09) X IO8PFU 至(1. 08 士0. 27) X 108PFU、 Ig (1. 08士0. 27) XlO8PFU 至(1. 30士0. 33) X 108PFU、Ig (1. 30士0. 33) X IO8PFU 至(1. 86士0. 78) XlO8PFUUg (1. 86士0. 78) X IO8PFU 至(2. 78士0. 15) X IO8PFU、或 Ig (2. 78士0. 15) X IO8PFU 至(4. 4士0. 76) X IO9PFU。所述固体化的方法具体可为喷雾干燥法。应用喷雾干燥法进行所述固体化时，所述喷雾干燥法的参数具体可为入口温度80°C至120°C (如80°C至100°C、100°C至120°C)、 气流速度 90L/min 至 150L/min (如 90L/min 至 120L/minU20L/min 至 150L/min)、喷雾速率40%至100% (如40%至60%、60%至80%、80%至100% )、喷头盖孔径为4. 0 μ m至 7. 0 μ m (如4. 0 μ m至5. 5 μ m、5. 5 μ m至7. 0 μ m)。所述喷雾干燥所用的仪器具体可为瑞士 BUCHI B-90纳米喷雾干燥机。用于所述固体化的原料中，所述保护剂具体可以以水溶液的形式加入。所述固体化的原料优选为无菌的原料。
本发明通过采用合适的保护剂、合适的仪器设备、优化的工艺参数后，可以获得适合于吸入给药的分枝杆菌噬菌体D29颗粒物(干粉吸入剂)且分枝杆菌噬菌体D29活性保留值非常高。如果不使用保护剂，或保护剂选用不当，分枝杆菌噬菌体D29在喷雾干燥过程中，绝大部分(>95%)将失活，失去了其固体化的意义。本发明发现糖类、蛋白类、氨基酸类和醇类中的一种或几种可以作为分枝杆菌噬菌体D29固体化的保护剂，采用糖类混合物作为保护剂使分枝杆菌噬菌体D29活性保留达到70%以上(见实施例5)，采用糖类与氨基酸蛋白质类的混合物作为保护剂，则可以使分枝杆菌噬菌体D29活性保留达到80%左右 (见实施例9、10)，甚至90%以上(见实施例8)。常规的喷雾干燥，其所获得颗粒的大小通常在数十微米甚至100微米以上，这样大小的颗粒无法吸入进入下呼吸道，因此不适合肺部吸入给药。本发明探索了喷雾干燥工艺对所获得颗粒物大小的影响，适合于吸入给药的颗粒。本发明提供的分枝杆菌噬菌体D29颗粒，存活的分枝杆菌噬菌体D29的含量可为lX102PFU/g至lX109PFU/g，水分的质量百分含量可为10%以下，粒度中位值D50可为 20 μ m以下。本发明采用纳米喷雾干燥技术制备获得了可吸入颗粒物，并在喷雾干燥中采用了独特的稳定化技术，从而解决了分枝杆菌噬菌体D29干粉吸入剂制备过程中的技术难点； 采用吸入给药可以更好的发挥分枝杆菌噬菌体D29在临床肺结核病中的治疗效果，解决了分枝杆菌噬菌体D29应用中的技术难点。最终为分枝杆菌噬菌体D29发展成为一个药物提供可能。
图1为实施例1以蔗賴■作为保护剂时的电镜照片
图2为实施例3以海藻糖作为保护剂时的电镜照片
图3为实施例4以乳賴■作为保护剂时的电镜照片
图4为实施例5以乳賴■和海藻糖作为保护剂时的电镜照片
图5为实施例6以乳賴■和甘露醇作为保护剂时的电镜照片
图6为实施例7以脱脂奶粉作为保护剂时的电镜照片
图7为实施例8以乳賴■和脱脂奶粉作为保护剂时的电镜照片
图8为实施例9以乳賴■和牛血清白蛋白作为保护剂时的电镜照片
图9为实施例10以乳瞎和亮氨酸作为保护剂时的电镜照片
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。CFU即菌落形成单位，PFU即空斑形成单位。7H9培养基美国BD公司(产品原厂编号271310)。分枝杆菌噬菌体D29 参考文献为彭丽，罗永艾，陈保文等.噬菌体D29对感染敏感株结核分枝杆菌豚鼠的疗效.中国人兽共患病学报.2009，25 (8) :733-736。
实施例中所用的耻垢分枝杆菌均为耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis) ATCC607 参考文献刘克洋，杜茜，温占波等.分枝杆菌噬菌体D29气溶胶的喷雾和采样介质的初步研究.军事医学科学院院刊，2010，34(4) :347-350。收率的计算方法如下(收获的分枝杆菌噬菌体D29颗粒的质量/作为原料添加的保护剂的质量)X 100%。含水量的计算方法如下取洗净晾干的称量瓶(直径约45mm)，于100°C 士2°C烘干2h，放至室温后精密称重(Wtl)；将约Ig分枝杆菌噬菌体D29颗粒平铺于称量瓶中，精密称重(W1)；将称量瓶转移至烘箱中，打开瓶盖进行烘干处理(保护剂为糖类时在115°C 士2°C 条件下烘干20h ；保护剂含蛋白类时在80°C 士2°C条件下烘干20h)，然后盖好瓶盖，取出于室温(相对湿度低于60% )条件下放置lOmin，精密称重(W2)；含水量(％ ) = [(W1-W2)/ (W1-W0)] X 100%。分枝杆菌噬菌体D29颗粒的粒度测定方法如下本专利的实施例中采用LS908 (A) 激光粒度分析仪(珠海欧美克仪器有限公司)测定，具体方法为(1)在静态样品池中加入 7mL介质(油酸乙酯)，放入仪器测量系统中，待仪器自动对中、清零后，仪器进入待测状态； (2)采用分散介质(油酸乙酯)将分枝杆菌噬菌体D29颗粒制成约5mg/mL的均勻悬液后， 取3滴悬液(0. ImL-O. 2mL)加入到静态样品池的介质中，吹散均勻，放入仪器测量系统中， 待光柱稳定后，即可进行粒度测定，以粒度中位值D50来表示颗粒的大小。也可采用其他商业可获得的粒度仪，具体步骤需根据所使用仪器的操作规程作相应调整。分枝杆菌噬菌体D29颗粒的电镜测定方法将分枝杆菌噬菌体D29颗粒均勻地铺在样品托上，用日立E-1010离子溅射仪喷金后，日立S-3400N扫描电镜下观察、照相。采用其他商业可获得的扫描电镜也可获得电镜照片，具体步骤需根据所使用仪器的操作规程作相应调整。分枝杆菌噬菌体D29颗粒中的噬菌体存活率的计算方法如下将分枝杆菌噬菌体 D29颗粒用SM液溶解后，再用SM液进行10倍梯度稀释；分别取0. ImL稀释液至不同的7H9 底层培养基平板(Φ90πιπι)上，用“L”棒涂布均勻；按照3mL菌液/50mL培养基的比例向加热到约60°C的7H9上层培养基中加入浓度为107CFU/mL的耻垢分枝杆菌菌液，轻轻摇勻后向上述每个涂布了噬菌体D29的7H9底层培养基平皿中倒入5mL含耻垢分枝杆菌的7H9上层培养基；待上层培养基完全凝固后，将平皿放置于恒温培养箱中37°C正置培养2天，观察、 统计平板上的PFU(10 300的结果为可信区间)；根据稀释度计算分枝杆菌噬菌体D29颗粒中的存活噬菌体个数；每个稀释度的样品涂布3个平皿，结果取平均值；存活率=(最终得到的分枝杆菌噬菌体D29颗粒中的存活噬菌体个数/喷雾干燥时加入的噬菌体个数/收率)X100%oSM 液称取 2. 9g NaCl 禾口 1. Og MgSO4. 7H20，加入 25ml lmol/L Tris-Cl (pH 7. 5) 和2. 5ml 2% (g/100ml)明胶水溶液，加水至500ml，混勻后于121°C灭菌30min，放至室温即得SM液。7H9底层培养基称取1. 6g 7H9培养基、5. 6g琼脂粉，加水315mL，混勻后121°C灭菌30min，然后45 50°C时无菌操作加入小牛血清复合物溶液(0ADC溶液)35ml，混勻后制成平板(12ml/平皿)；放至室温凝固后，4°C冰箱保存。7H9上层培养基称取1. 6g 7H9培养基、2. 8g琼脂粉，加水315mL，混勻后121°C灭菌30min，无菌密封条件下置于4°C保存。OADC溶液将8. 5g NaCl、50g BSA(小牛血清白蛋白V因子)、20g葡萄糖用900mL 水充分溶解，得试剂A ；将1. 28g油酸、6mL 0. IM NaOH溶液和54mL水，充分溶解混合，得试剂B ；将37. 5mg生物素和12. 5mg维生素B6用IOmL水溶解，取ImL与25mg过氧化氢酶和 59mL水后振摇，使充分溶解，得试剂C ；将800mL试剂A、50mL试剂B和50mL试剂C混合，得到OADC原液；OADC原液用无菌滤膜过滤后(过滤装置下层为0. 22μπι滤膜，上层为0. 45 μ m 滤膜)即为OADC溶液(加盖后-20°C保存备用)。实施例1、喷雾干燥法制备分枝杆菌噬菌体D29颗粒一、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的制备1、称取20g蔗糖(即作为原料添加的保护剂的质量为20g)，加入到930g水中搅拌溶解，在生物安全柜中用0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，得到滤液。2、向滤液中加入50g分枝杆菌噬菌体D29菌液[浓度为(1. 07士0. 32) X IO6PFU/ g]，混合均勻后采用瑞士 BUCHI B-90型纳米喷雾干燥机喷雾干燥，得到分枝杆菌噬菌体 D29颗粒。仪器参数设定为入口温度10(TC、气流速度120L/min、喷雾速率40%、喷头盖 7. 0 μ m ；回流液收集至无菌烧瓶内。二、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征数据如下收率为(83. 56士2. 15) %，含水量为(2. 84士0.57) % ；球形(见图1)，大小在数微米至十几微米间；粒谱测定显示D50为 (10. 56 士 0. 65) μ m ；噬菌体存活率为(42. 47 士 11. 43) % ；所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒中， 存活的分枝杆菌噬菌体D29的含量为(2. 72士0. 73) X 104PFU/g。实施例2、喷雾干燥法制备分枝杆菌噬菌体D29颗粒一、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的制备用乳糖代替蔗糖，其它完全同实施例1的步骤一。二、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征数据如下收率为(78. 72士 1.41) %，含水量为(5. 08 士 0.22) % ；类球形，大小在数微米至数十微米间；粒谱测定显示D50为 (15. 66士 1. 65) μ m ；噬菌体存活率为(45. 58士 16. 50) % ；所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒中， 存活的分枝杆菌噬菌体D29的含量为(3. 10士 1. 12) X104PFU/g。实施例3、喷雾干燥法制备分枝杆菌噬菌体D29颗粒一、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的制备1、称取50g海藻糖(即作为原料添加的保护剂的质量为50g)，加入到150g水中搅拌溶解，在生物安全柜中用0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，得到滤液。2、向滤液中加入50g分枝杆菌噬菌体D29菌液[(1. 30士0. 33) X 108PFU/g]，混合均勻后采用瑞士 BUCHI B-90型纳米喷雾干燥机喷雾干燥，得到分枝杆菌噬菌体D29颗粒。 仪器参数设定为入口温度80°C、气流速度90L/min、喷雾速率60%、喷头盖5. 5μ m ；回流液收集至无菌烧瓶内。二、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征数据如下收率为(72. 57士2.49) % ；含水量为(8. 08士0.27) % ；球形(见图2)，大小在数微米至十几微米；粒谱测定显示D50为(8. 69 士 0. 94) μ m ；噬菌体存活率为(50. 40 士 5. 22) % ；所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒中，存活的分枝杆菌噬菌体D29的含量为(1. 81 士0. 19) X 106PFU/g。实施例4、喷雾干燥法制备分枝杆菌噬菌体D29颗粒一、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的制备1、称取50g乳糖(即作为原料添加的保护剂的质量为50g)，加入到400g水中搅拌溶解，在生物安全柜中用0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，得到滤液。2、向滤液中加入50g分枝杆菌噬菌体D29菌液[(4. 4士0. 76) X 109PFU/g]，混合均勻后采用瑞士 BUCHI B-90型纳米喷雾干燥机喷雾干燥，得到分枝杆菌噬菌体D29颗粒。仪器参数设定为入口温度120°C、气流速度150L/min、喷雾速率100%、喷头盖4. 0 μ m ；回流液收集至无菌烧瓶内。二、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征数据如下收率为(71. 05士0.22)% ；含水量为 (3. 27士0. 35)% ；球形、部分颗粒表面有凹陷(见图3)，颗粒大小在数微米；粒谱测定显示 D50为(5. 65 士 0.05) μ m;噬菌体存活率为(41. 50 士 12. 30) % ；所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒中，存活的分枝杆菌噬菌体D29的含量为(5. 14士 1. 52) X 107PFU/g。实施例5、喷雾干燥法制备分枝杆菌噬菌体D29颗粒一、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的制备1、称取25g乳糖和25g海藻糖(即作为原料添加的保护剂的质量为50g)，加入到 400g水中搅拌溶解，在生物安全柜中用0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，得到滤液。2、向滤液中加入50g分枝杆菌噬菌体D29溶液[(0. 74士0. 40) X 108PFU/g]，混合均勻后采用瑞士 BUCHI B-90型纳米喷雾干燥机喷雾干燥，得到分枝杆菌噬菌体D29颗粒。 仪器参数设定为入口温度120°C、气流速度120L/min、喷雾速率80%、喷头盖5. 5μπι;回流液收集至无菌烧瓶内。二、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征数据如下收率为(84. 99士0. 62) % ；含水量为 (2. 88士0.04)% ；类球形，部分颗粒表面有皱折、凹陷(见图4)，颗粒大小在数微米至十几微米间；粒谱测定显示D50为(10. 94士0. 45) μ m ；噬菌体存活率为(73. 80士9. 05) % ；所述
分枝杆菌噬菌体D29颗粒中，存活的分枝杆菌噬菌体D29的含量为(1. 29士0. 16) X IO6PFU/ g° 实施例6、喷雾干燥法制备分枝杆菌噬菌体D29颗粒一、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的制备1、称取25g乳糖和25g甘露醇(即作为原料添加的保护剂的质量为50g)，加入到 400g水中搅拌溶解，在生物安全柜中用0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，得到滤液。2、向滤液中加入50g分枝杆菌噬菌体D29溶液[(0. 96士0. 62) X 108PFU/g]，混合均勻后，采用瑞士 BUCHI B-90型纳米喷雾干燥机喷雾干燥，得到分枝杆菌噬菌体D29颗粒。 仪器参数设定为入口温度120°C、气流速度120L/min、喷雾速率80%、喷头盖5. 5μπι;回流液收集至无菌烧瓶内。二、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征数据如下收率为(57. 16士3. 57)% ；含水量为(1. 34士0. 11) 球形并有一定粘连(见图5)，显微观察颗粒大小在数微米至十几微米；粒谱测定显示D50为(8. 94 士 0. 29) μ m ；噬菌体存活率为(71. 60 士 3. 68) % ；所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒中，存活的分枝杆菌噬菌体D29的含量为(2. 41 士0. 12) X 106PFU/g。实施例7、喷雾干燥法制备分枝杆菌噬菌体D29颗粒一、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的制备1、称取50g市售脱脂奶粉(内蒙古伊利实业集团股份有限公司)(即作为原料添加的保护剂的质量为50g)，加入到400g水中搅拌溶解，在生物安全柜中用0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，得到滤液。2、向滤液中加入50g分枝杆菌噬菌体D29溶液[(0. 96士0. 09) X 108PFU/g]，混合均勻后，采用瑞士 BUCHI B-90型纳米喷雾干燥机喷雾干燥，得到分枝杆菌噬菌体D29颗粒。 仪器参数设定为入口温度120°C、气流速度120L/min、喷雾速率80%、喷头盖5. 5μπι;回流液收集至无菌烧瓶内。二、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征数据如下收率为(83. 40士2. 90) % ；含水量为 (2. 50 士 0. 20)% ；球形，部分颗粒表面凹陷(见图6)，显微观察颗粒大小在数微米；粒谱测定显示D50为(7. 91 士 0. 39) μ m ；噬菌体存活率为(80. 71 士 4. 34) % ；所述分枝杆菌噬菌体 D29颗粒中，存活的分枝杆菌噬菌体D29的含量为(1. 86士0. 10) X 106PFU/g。实施例8、喷雾干燥法制备分枝杆菌噬菌体D29颗粒一、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的制备1、称取5g乳糖和25g市售脱脂奶粉(内蒙古伊利实业集团股份有限公司)(即作为原料添加的保护剂的质量为30g)，加入到400g水中搅拌溶解后，在生物安全柜中用 0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，得到滤液。2、向滤液中加入50g分枝杆菌噬菌体D29溶液[(1. 67士0. 09) X 108PFU/g]，混合均勻后，采用瑞士 BUCHI B-90型纳米喷雾干燥机喷雾干燥，得到分枝杆菌噬菌体D29颗粒。 仪器参数设定为入口温度120°C、气流速度120L/min、喷雾速率80%、喷头盖5. 5μπι;回流液收集至无菌烧瓶内。二、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征数据如下收率为(81. 10士3. 76) % ；含水量为(2. 11 士0.08)% ；类球形，部分颗粒表面内凹甚至呈不规则形(见图7)，显微观察颗粒大小在数微米至二十微米间；粒谱测定显示D50为(7. 49士0. 59) μ m ；噬菌体存活率为 (95. 10士 1. 88) % ；所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒中，存活的分枝杆菌噬菌体D29的含量为 (6. 53 士 0. 13) X 106PFU/g。实施例9、喷雾干燥法制备分枝杆菌噬菌体D29颗粒一、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的制备1、称取25g乳糖和25g牛血清白蛋白(即作为原料添加的保护剂的质量为50g)， 加入到400g水中搅拌溶解，在生物安全柜中用0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，得到滤液。2、向滤液中加入50g分枝杆菌噬菌体D29溶液[(1. 86士0. 78) X 108PFU/g]，混合均勻后，采用瑞士 BUCHI B-90型纳米喷雾干燥机喷雾干燥，得到分枝杆菌噬菌体D29颗粒。 仪器参数设定为入口温度120°C、气流速度120L/min、喷雾速率80%、喷头盖5. 5μπι;回流液收集至无菌烧瓶内。二、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征数据如下收率为(70. 58士 1. 09) % ；含水量为 (2. 74士0. 04) % ；球形，少量颗粒表面有皱折(见图8)，显微观察颗粒大小在数微米至十几微米间；粒谱测定显示D50为(8. 14士0. 17) μ m ；噬菌体存活率为(85. 10士 18. 95) % ；所述
分枝杆菌噬菌体D29颗粒中，存活的分枝杆菌噬菌体D29的含量为(4. 49 士 0. 99) X IO6PFU/ g°实施例10、喷雾干燥法制备分枝杆菌噬菌体D29颗粒一、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的制备1、称取25g乳糖和5g亮氨酸(即作为原料添加的保护剂的质量为30g)，加入到 400g水中搅拌溶解，在生物安全柜中用0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，得到滤液。2、向滤液中加入50g分枝杆菌噬菌体D29溶液[(0. 65士0. 16) X 108PFU/g]，混合均勻后，采用瑞士 BUCHI B-90型纳米喷雾干燥机喷雾干燥，得到分枝杆菌噬菌体D29颗粒。 仪器参数设定为入口温度120°C、气流速度120L/min、喷雾速率80%、喷头盖5. 5μπι;回流液收集至无菌烧瓶内。二、分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征分枝杆菌噬菌体D29颗粒的表征数据如下收率为(82. 85士0. 16) % ；含水量为 (2. 30士0. 57) % ；类球形，或不规则类球形(见图9)，显微观察颗粒大小在数微米至二十微米间；粒谱测定显示D50为(9. 34士0. 40) μ m ；噬菌体存活率为(78. 70士8. 91) % ；所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒中，存活的分枝杆菌噬菌体D29的含量为(2. 06士0. 23) X 106PFU/g。
权利要求
1.一种分枝杆菌噬菌体D29颗粒，它的活性成分由分枝杆菌噬菌体D29和保护剂组成； 所述保护剂为糖和/或蛋白和/或氨基酸和/或醇。
2.如权利要求1所述的分枝杆菌噬菌体D29颗粒，其特征在于所述糖为蔗糖、乳糖和海藻糖中的至少一种；所述蛋白为奶粉和牛血清白蛋白中的至少一种；所述氨基酸为亮氨酸；所述醇为甘露醇。
3.如权利要求1或2所述的颗粒，其特征在于所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒中，存活的分枝杆菌噬菌体D29的含量为lX102PFU/g至lX109PFU/g，水分的质量百分含量为10% 以下；所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒的粒度中位值D50为20 μ m以下。
4.权利要求1或2或3所述分枝杆菌噬菌体D29颗粒的制备方法，是将所述分枝杆菌噬菌体D29与所述保护剂作为原料一起进行固体化，得到分枝杆菌噬菌体D29颗粒。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述保护剂为如下(1)至(9)中的任意一种⑴蔗糖；⑵乳糖；⑶海藻糖；⑷乳糖和海藻糖；(5)乳糖和甘露醇；(6)奶粉；(7) 乳糖和奶粉；(8)乳糖和牛血清白蛋白；(9)乳糖和亮氨酸。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述保护剂与所述分枝杆菌噬菌体D29 作为原料的配比为Ig IX IO4PFU至1X1012PFU。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述保护剂与所述分枝杆菌噬菌体D29作为原料的配比为 Ig 1.88X IO6PFU 至 5. 16XlO9PFUt5
8.如权利要求4至7中任一所述的方法，其特征在于所述固体化的方法为喷雾干燥法。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述喷雾干燥法的参数为入口温度80°C 至120°C、气流速度90L/min至150L/min、喷雾速率40%至100%、喷头盖孔径为4. 0 μ m至 7. 0 μ m0
10.如权利要求4至9中任一所述的方法，其特征在于所述固体化的原料为无菌的。
全文摘要
本发明公开了一种分枝杆菌噬菌体D29颗粒及其制备方法和应用。本发明提供的分枝杆菌噬菌体D29颗粒的活性成分由分枝杆菌噬菌体D29和保护剂组成；所述保护剂为糖和/或蛋白和/或氨基酸和/或醇。本发明采用纳米喷雾干燥技术制备获得了可吸入颗粒物，并在喷雾干燥中采用了独特的稳定化技术，从而解决了分枝杆菌噬菌体D29干粉吸入剂制备过程中的技术难点；采用吸入给药可以更好的发挥分枝杆菌噬菌体D29在临床结核病中的治疗效果，解决了分枝杆菌噬菌体D29应用中的技术难点，最终为分枝杆菌噬菌体D29发展成为一个药物提供可能。
文档编号A61K9/16GK102296056SQ20111025274
公开日2011年12月28日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者刘秋焕, 李京京, 王静, 程洪亮, 邹红霞, 陆兵, 陈芳 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所