治疗和预防癌症耐药性的方法与流程

本申请要求2014年6月13日提交的美国临时申请号62/011,854的权益，该临时申请的公开内容整体以引用方式并入本文中。

领域

本文提供使用FGFR信号传导拮抗剂来治疗诸如癌症的病理状况的联合治疗。

背景

癌症仍然是对人类健康的最致命威胁中的一种。在美国，癌症每年影响近130万新患者，而且是位列心脏病之后的第二大死因，占4例死亡中的大约1例。例如，乳腺癌是癌症中的第二常见的形式，且为美国女性中的第二大癌症杀手。另据预测，癌症会在5年内超过心血管疾病成为头号致死原因。实体瘤导致这些死亡中的大部分死亡。虽然在某些癌症的医学治疗中已有明显的进展，但是所有癌症的总体5年生存率在过去20年中仅提高了约10％。癌症或恶性肿瘤以不受控制的方式转移并快速生长，使得及时检出和治疗非常困难。

对癌症药物抗性的相对快速获得仍然是成功的癌症疗法的一个主要障碍。大量用来阐明此类耐药性的分子基础的努力已经揭示了多种机制，包括药物外排、靶标的药物结合缺陷型突变体的获得、占用备选的存活途径和表观遗传改变。例如，RAF抑制剂用于靶向具有B-raf V600E突变的恶性黑素瘤；然而，它们的临床成功因获得性抗性而受阻。因此，需要新的治疗方法来成功解决癌细胞群中的异质性和对药物治疗具有抗性的癌细胞的出现。

概要

本文提供了使用FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的联合治疗。在具体实施方案中，该联合治疗使用FGFR1信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂。

尤其是，本文提供在个体中治疗癌症的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)FGFR信号传导拮抗剂和(b)B-raf拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的相应量有效增加癌症敏感性时段和/或延迟癌症对B-raf拮抗剂的抗性的产生。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的相应量有效增强包括B-raf拮抗剂的癌症治疗的功效。例如，在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的相应量与包括施用有效量的B-raf拮抗剂而不施用(不存在)FGFR信号传导拮抗剂的标准治疗相比有效增强功效。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的相应量与包括施用有效量的B-raf拮抗剂而不施用(不存在)FGFR信号传导拮抗剂的标准治疗相比有效增加应答(例如完全应答)。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的相应量有效增加癌症敏感性和/或恢复对B-raf拮抗剂的敏感性。

本文还提供治疗癌细胞的方法，其中个体中的癌细胞对用B-raf拮抗剂治疗有抗性，该方法包括向个体施用有效量的FGFR信号传导拮抗剂和有效量的B-raf拮抗剂。此外，本文提供在个体中治疗对B-raf拮抗剂有抗性的癌症的方法，该方法包括向个体施用有效量的FGFR信号传导拮抗剂和有效量的B-raf拮抗剂。

本文提供增加敏感性和/或恢复对B-raf拮抗剂的敏感性的方法，该方法包括向个体施用有效量的FGFR信号传导拮抗剂和有效量的B-raf拮抗剂。

本文还提供增强包括B-raf拮抗剂的癌症治疗在个体中的功效的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂。

本文提供在个体中治疗癌症的方法，其中癌症治疗包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂，其中该癌症治疗与包括施用有效量的B-raf拮抗剂而不施用(不存在)FGFR信号传导拮抗剂的标准治疗相比具有增强的功效。

此外，本文提供在个体中延迟和/或预防癌症对B-raf拮抗剂的抗性的产生的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂。

本文提供治疗具有增加的对B-raf拮抗剂产生抗性的可能性的癌症个体的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂。

本文还提供在癌症个体中增加对B-raf拮抗剂的敏感性的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂。

本文还提供在癌症个体中延长B-raf拮抗剂的敏感性时段的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂。

本文提供在癌症个体中延长对B-raf拮抗剂的应答的持续时间的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂。

在任何所述方法的一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是抗体抑制剂、小分子抑制剂、结合多肽抑制剂和/或多核苷酸拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是结合多肽抑制剂。在一些实施方案中，结合多肽抑制剂包含连接到Fc结构域的FGFR的胞外结构域的区(例如连接到免疫球蛋白铰链和Fc结构域的FGFR的胞外结构域的区)。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR1信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR2信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR3信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR4信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是抗体。

在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂仅结合和/或抑制FGFR1。

在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6和FGF10中的一个或多个。在一些实施方案中，小分子是N-[2-[[4-(二乙基氨基)丁基]氨基]-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N'-(1,1-二甲基乙基)-脲或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，小分子是BGJ398(Novartis)、AZD4547(AstraZeneca)和/或FF284(Chugai/Debiopharm(Debio 1347)。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是抗FGF2抗体。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是抗FGFR1抗体。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是抗FGFR1-IIIb抗体。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是抗FGFR1-IIIc抗体。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是能够结合多于一种FGFR多肽的抗FGFR抗体。

在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是索拉非尼、PLX4720、PLX-3603、GSK2118436、GDC-0879、N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺、维罗非尼(vemurafenib)、GSK 2118436、RAF265(Novartis)、XL281、ARQ736、BAY73-4506中的一个或多个。在另外的实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼。在另外的实施方案中，B-raf拮抗剂是GSK 2118436。B-raf拮抗剂可以是B-raf V600E选择性的。

在一些实施方案中，已证实，患者的癌症已经显示表达B-raf生物标记物。B-raf生物标记物可以是突变型B-raf。突变型B-raf是组成型活化的B-raf。在一些实施方案中，突变型B-raf是B-rafV600。B-raf V600可以是B-raf V600E。突变型B-raf的非限制示例性列表为：B-raf V600K(GTG>AAG)、V600R(GTG>AGG)、V600E(GTG>GAA)和/或V600D(GTG>GAT)。在一些实施方案中，检出突变型B-raf多肽。在一些实施方案中，检出突变型B-raf核酸。“V600E”是指在B-RAF(T>A)中在核苷酸位置1799处的突变，该突变导致谷氨酰胺取代B-raf的氨基酸位置600处的缬氨酸。“V600E”按照之前的编号系统也称为“V599E”(1796T>A)(Kumar等,Clin.Cancer Res.9:3362-3368,2003)。

在具体实施方案中，本文提供在个体中治疗癌症的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)FGFR1拮抗剂和(b)B-raf拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR1拮抗剂和B-raf拮抗剂的相应量有效增加癌症敏感性时段和/或延迟癌症对B-raf拮抗剂的抗性的产生。在一些实施方案中，FGFR1拮抗剂和B-raf拮抗剂的相应量有效增强包括B-raf拮抗剂的癌症治疗的功效。例如，在一些实施方案中，FGFR1拮抗剂和B-raf拮抗剂的相应量与包括施用有效量的B-raf拮抗剂而不施用(不存在)FGFR信号传导拮抗剂的标准治疗相比有效增强功效。在一些实施方案中，FGFR1拮抗剂和B-raf拮抗剂的相应量与包括施用有效量的B-raf拮抗剂而不施用(不存在)FGFR信号传导拮抗剂的标准治疗相比有效增加应答(例如完全应答)。在一些实施方案中，FGFR1拮抗剂和B-raf拮抗剂的相应量有效增加癌症敏感性和/或恢复对B-raf拮抗剂的敏感性。

在具体实施方案中，本文还提供治疗癌细胞的方法，其中个体中的癌细胞对用B-raf拮抗剂治疗有抗性，该方法包括向个体施用有效量的FGFR1拮抗剂和有效量的B-raf拮抗剂。此外，本文提供在个体中治疗对B-raf拮抗剂有抗性的癌症的方法，该方法包括向个体施用有效量的FGFR1拮抗剂和有效量的B-raf拮抗剂。

在具体实施方案中，本文提供增加敏感性和/或恢复对B-raf拮抗剂的敏感性的方法，该方法包括向个体施用有效量的FGFR1拮抗剂和有效量的B-raf拮抗剂。

在具体实施方案中，本文提供增强包括B-raf拮抗剂的癌症治疗在个体中的功效的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR1拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂。

本文提供在个体中治疗癌症的方法，其中癌症治疗包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR1信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂，其中该癌症治疗与包括施用有效量的B-raf拮抗剂而不施用(不存在)FGFR信号传导拮抗剂的标准治疗相比具有增强的功效。

在具体实施方案中，本文提供在个体中延迟和/或预防产生癌症对B-raf拮抗剂的抗性的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR1信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂。

在具体实施方案中，本文提供治疗具有增加的B-raf拮抗剂产生抗性的可能性的癌症个体的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR1信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂。

在具体实施方案中，本文提供增加癌症个体中对B-raf拮抗剂的敏感性的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR1信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂。

在具体实施方案中，本文还提供延长癌症个体中对B-raf拮抗剂的敏感时段的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR1信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂。

在具体实施方案中，本文提供延长癌症个体对B-raf拮抗剂的应答的持续时间的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂。

在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是索拉非尼、PLX4720、PLX-3603、GSK2118436、GDC-0879、N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺、维罗非尼、GSK2118436、RAF265(Novartis)、XL281、ARQ736、BAY73-4506中的一个或多个。在另外的实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼。在另外的实施方案中，B-raf拮抗剂是GSK 2118436。B-raf拮抗剂可以是B-raf V600E选择性的。

在任何所述方法的具体实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼(Daiichi Sankyo)。

在任何所述方法的具体实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是抗体抑制剂、小分子抑制剂、结合多肽抑制剂和/或多核苷酸拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是结合多肽抑制剂。在一些实施方案中，结合多肽抑制剂包含连接到Fc结构域的FGFR1的胞外结构域的区(例如连接到免疫球蛋白铰链和Fc结构域的FGFR1的胞外结构域的区)。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是抗体。

在具体实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6和FGF10中的一个或多个。在一些实施方案中，小分子是N-[2-[[4-(二乙基氨基)丁基]氨基]-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N'-(1,1-二甲基乙基)-脲或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，小分子是BGJ398(Novartis)、AZD4547(AstraZeneca)和/或FF284(Chugai/Debiopharm(Debio 1347)。

在具体实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是抗FGFR1抗体。

在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂仅结合和/或抑制FGFR1。

在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是抗FGFR1-IIIb抗体。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是抗FGFR1-IIIc抗体。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是能够结合多于一种FGFR多肽的抗FGFR1抗体。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是特异性结合FGFR1而不结合任何其他FGFR多肽的抗FGFR1抗体。

B-raf拮抗剂和FGFR信号传导拮抗剂可以同时施用。B-raf拮抗剂和FGFR信号传导拮抗剂可以按顺序施用。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂在FGFR信号传导拮抗剂之前施用。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂在B-raf拮抗剂之前施用。

在任何所述方法的一些实施方案中，癌症是肺癌。在一些实施方案中，肺癌是NSCLC。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是HER2+乳腺癌。在一些实施方案中，癌症已经历了上皮-间充质转变。

附图说明

图1A-D.|由肿瘤细胞和/或肿瘤微环境分泌的因子通过细胞表面受体的活化而促成耐药性。A，对跨十个黑素瘤细胞系的447个分泌的细胞因子的筛选揭露出FGF、HGF、NRG1和EGF促成对B-raf和MEK拮抗剂的抗性。B，如黑素瘤细胞系中所示，FGF2、HGF和NRG1最广泛且强效地从对B-raf和MEK拮抗剂的抗性中挽救了肿瘤细胞(R＝50-100％挽救；PR＝25-50％挽救)。C，靶向Met、FGFR和ERBB受体的小分子抑制剂表明配体介导的抗性是同源受体特异性的。D，促进对PLX4032的抗性的分泌的细胞因子再次活化MAPK和PI3K通路。在存在PLX4032的情况下在624MEL细胞中显示了FGF2对MAPK、HGF对MAPK和AKT以及NRG1和SCF对AKT的活化。处理为5μM PLX4032持续24小时和50ng.mL FGF2、HGF、NRGB1或SCF持续10分钟。

图2A-E.|对细胞系(“LOX-IMVI VemR”)进行工程化以耐维罗非尼。A，探查FGFR1表达的11种细胞系的免疫印迹的图像。B，如DMSO图线中所示，LOX-IMVI VemR细胞系不受5μM维罗非尼(即，“PLX”)的影响；然而，该细胞系受与FGFR信号传导拮抗剂(即，BGJ398、PD173074和AP24534)联合的5μM维罗非尼的影响。因此，据发现，LOX-IMVI VemR细胞系通过抑制FGFR而对维罗非尼再次敏感。C，与维罗非尼抗性的LOX-IMVI VemR细胞系相比在亲本LOX-IMVI细胞系中FGFR2的pg/mL数的图线表明LOX-IMVI VemR细胞系的特征在于增加的FGF2分泌。D和E，RNAi敲低和5μM PLX4032筛选暗示LOX-IMVI VemR细胞系的维罗非尼抗性是FGFR1依赖性的并由FGFR1/FGF2驱动。

图3A-B.|FGFR抑制防止Vem-抗性细胞的长出。A，体外研究显示出维罗非尼(PLX4032)和FGFR信号传导拮抗剂(BGJ398)对三(3)种癌细胞系的协同作用。LOX-IMVI VemR细胞显示出对单独的维罗非尼和BGJ398处理的极低应答，但对维罗非尼和BGJ398联合处理的高应答。SK-MEL-3和SK-MEL-24细胞系显示出当与BGJ980联合时对PLX4032增强的应答。B，在存在维罗非尼(PLX4032)、FGFR信号传导拮抗剂(NV-BGJ398)和/或FGF2的情况下在West印迹上显示了所选蛋白的表达模式。

图4A-C.|LOX-IMVI VemR细胞系在体外具有FGFR介导的维罗非尼抗性。A,LOX-IMVI细胞(亲本细胞系)对维罗非尼敏感。B，维罗非尼与NVP-BGJ398的组合在维罗非尼抗性的LOX-IMVI VemR肿瘤中显示出强大的功效。C，在NVP-BGJ398处理结束后，LOX-IMVI(最初为维罗非尼敏感性的)的再次出现可通过共同靶向FGFR和B-raf(即，用BGJ398和维罗非尼共同处理)而防止。

图5A-D.|FGFR1在黑素瘤中介导FGF2挽救。A，FGFR亚型在624MEL细胞系中的siRNA敲低。B，显示了七种细胞系中靶向FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR1/4和FGFR2/3的siRNA的缺陷的图表。C，FGFR1表达在具有V600E B-raf突变的黑素瘤(n＝49)中增加。D，FGFR1在具有未知B-raf突变的TCGA黑素瘤样品(n＝247)中增加。

图6A-B.|在黑素瘤中FGFR1mRNA水平与FGF2挽救相关联。

图7A-D.|B-raf下游的MEK/ERK的再次活化是B-raf突变型黑素瘤中的抗性的核心机制。A，如通过免疫印迹所示，MAPK信号传导是FGF2介导的抗性所必需的。如通过免疫印迹所示，MAPK信号传导的再次活化是RTK介导的抗性的共同特征，其中FGF2介导的挽救在存在PLX4032(维罗非尼)的情况下活化了MEK和ERK。B，显示RAF1(C-raf)的活化的免疫印迹暗示添加RAF家族成员可介导MAPK再次活化。C，利用合成致死化学筛选(synthetic lethal chemical screen)在12种获得性抗性黑素瘤细胞系中鉴定介导对PLX4032的抗性的信号传导通路。表格显示了当用MEK和ERK的抑制剂共同处理时对PLX4032的敏感性的变化，从而表明B-raf下游通路的再次活化。D，图7C中所示的对特定细胞系进行的合成致死化学筛选的实例。

图8A-C.|PI3K的活化代表了B-raf突变型黑素瘤的替代性机制。A，合成致死化学筛选鉴定了对PLX4032的PI3K依赖性抗性。B和C，当用PLX4032(维罗非尼)处理时，被使得对PLX4032有抗性的624个黑素瘤细胞系(“634mel VemR”)显示出MET(磷酸化)的活化并显示出pAKT的增加。在存在PLX4032的情况下，需要用MET抑制剂共同处理以使624ml VemR细胞生长停滞。在G361细胞中观察到了对PI3K信号传导的类似依赖(数据未示出)。

图9A-C.|独立于MAPK和PI3K的促存活机制促进了B-RAF突变型黑素瘤中的耐药性。A和B，小分子筛选在COLO800和UACC-62细胞中鉴定了SRC家族活化。表现出SRC依赖性抗性的细胞系也通过PI3K信号传导的抑制而再次敏化。C，鉴定了抗凋亡通路的成员BCL-XL和BCL-2。如曲线图中所示，具有对PLX4032的获得性抗性的G-361细胞对BCL-XL和BCL-2抑制剂具有抗性，但对PLX4032和MEKi(GDC-0973)具有抗性的G-361细胞系的变体对BCL-XL和BCL-2抑制剂敏感。

图10A-C.|LOX-IMVI通过FGFR介导的机制而变得对PLX4032具有抗性。A，据显示，LOX-IMVI vemR(对维罗非尼具有抗性的细胞系)显示为依赖于FGFR活性。B，被使得耐FGFR抑制剂的LOX-IMVIvemR细胞变得依赖于EGFR活性。B和C，被使得对FGFR和EGFR抑制剂具有抗性的LOX-IMVI vemR细胞显示出通过MET和MEK抑制剂而再次敏化，伴随HGF分泌增加。

图11.|分泌的因子可促进对药物疗法的抗性。图11的曲线图显示了未处理的细胞(对照)、药物处理的细胞(药物)和用药物及分泌因子处理的细胞的比较。如图所示，诸如维罗非尼的药物可减少(即，杀灭)细胞数量，但当添加细胞分泌的因子(例如FGF)时获得对药物的抗性。

图12.|对促进HER2+乳腺癌细胞中对癌症疗法的抗性的分泌因子进行了筛选，其中将细胞用六种疗法(拉帕替尼、GDC-0032、GDC-0941、GDC-0349、T-DM1或T-DM1加帕妥珠单抗)中的一种处理。测量了与每种分泌因子相关联的增强的杀灭或挽救。

图13.|对促进B-raf突变型黑素瘤细胞中对癌症疗法的抗性的分泌因子进行了筛选，其中将细胞用三种疗法(PLX4032(即，维罗非尼)、GDC-0973或GDC-0623)中的一种处理。测量了与每种分泌因子相关联的增强的杀灭或挽救。

图14.|执行了检测九种不同细胞系上的p-Akt、Akt、pERK、ERK和β-肌动蛋白(对照)的免疫印迹，以检测分泌因子介导的耐药性的下游机制。

图15A-C.|对10种黑素瘤细胞系和10种乳腺癌细胞系进行了筛选，以确定FGF信号传导在耐药性中的作用。A和B，在黑素瘤和乳腺癌细胞系中观察到了稳健的z-得分。C，FGF受体、其亚家族及其配体的汇总。

图16A-B.|FGF2再次活化关键的信号传导通路以促进抗性并刺激下游信号传导的持续活化。A，暴露于FGF2达10分钟的细胞与未暴露的细胞的免疫印迹的比较。B，暴露于FGF2达24小时的细胞与不存在FGF2暴露的细胞的免疫印迹的比较。

图17A-C.|FGF分泌因子介导的信号传导在黑素瘤细胞系中的动力学。A，将细胞系用PLX4032(维罗非尼)处理4小时并用FGF处理10分钟。B，将624MEL细胞系用PLX4032处理24小时并用FGF处理24小时。C，将928MEL细胞系用PLX4032处理24小时并用FGF处理24小时。

图18A-B.|FGFR靶向作用有效阻断了FGF2挽救。A，下游通路的有效阻断通常不会克服FGF2挽救。B，用拉帕替尼、MEKi、SMI和FGF-2处理的AU565细胞的免疫印迹(在HCC1954和UACC-893细胞系中观察到了类似的结果)。

图19A-D.|FGFR4在HER2+乳腺癌中介导FGF2挽救。A，用拉帕替尼和FGF2处理的细胞的挽救百分比。B，用拉帕替尼和FGF2处理的细胞的免疫印迹。C，TCGA乳腺癌样品(n＝913)显示了乳腺癌中的高FGFR1水平。D，HER2+乳腺癌细胞富含高FGFR4。

图20A-C.|先天抗性的HER2+乳腺癌模型。A,FGFR抑制剂(BGJ398)使HCC1569细胞对拉帕替尼敏感。B,FGFR抑制剂(BGJ398)使MDA-MB-453细胞对拉帕替尼敏感。C，肿瘤体积因拉帕替尼和FGFR抑制剂(BGJ398)联合处理而减小。

图21A-B.|另外的获得性抗性机制包括对ERK/MEK抑制剂敏感(A)和对ERK/MEK抑制剂不敏感(B)。

图22A-B.|分泌因子介导的抗性机制在获得性耐药模型中是显而易见的。A，单耐药细胞系的表格。B，双重耐药细胞系的表格。

图23A-C.|维罗非尼抗性和敏感性细胞系可用于确定和预测患者中的抗性途径。LOX-IMVI细胞在筛选中被FGF1、FGF2、EGF和HGF挽救。A，LOX-IMVI VemR细胞通过FGFR抑制而对PLX4032再次敏感。B，双重抗性LOX-IMVI VemR/FGFRi(即，对维罗非尼和FGFR抑制剂具有抗性)细胞通过EGFR抑制而对PLX4032再次敏感。C，三重抗性LOX-IMVI VemR/FGFRi/埃罗替尼细胞通过MET抑制而对PLX4032再次敏感。

详述

I.定义

受关注多肽的“拮抗剂”(可互换地称作“抑制剂”)是干扰受关注多肽的活化或功能，例如部分或完全阻断、抑制或中和由受关注多肽介导的生物活性的药剂。例如，多肽X的拮抗剂可以指部分或完全阻断、抑制或中和由多肽X介导的生物学活性的任何分子。抑制剂的实例包括抗体、配体抗体、小分子拮抗剂、反义和抑制性RNA(例如shRNA)分子。优选地，抑制剂是结合受关注多肽的抗体或小分子。在一个特定实施方案中，抑制剂对受关注多肽具有约1,000nM或更小的结合亲和力(离解常数)。在另一个实施方案中，抑制剂对受关注多肽具有约100nM或更小的的结合亲和力。在另一个实施方案中，抑制剂对受关注多肽具有约50nM或更小的的结合亲和力。在特定实施方案中，抑制剂与受关注多肽共价结合。在特定实施方案中，抑制剂以1,000nM或更小的IC₅₀抑制受关注多肽的信号传导。在另一个实施方案中，抑制剂以500nM或更小的IC₅₀抑制受关注多肽的信号传导。在另一个实施方案中，抑制剂以50nM或更小的IC₅₀抑制受关注多肽的信号传导。在某些实施方案中，拮抗剂降低或抑制受关注多肽的表达水平或生物活性达至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，受关注多肽是FGFR受体(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)或FGF(例如FGF1-23)。在一些实施方案中，受关注多肽是EGFR。

除非另外说明，否则如本文所用的术语“多肽”是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳类动物，诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然的受关注多肽。该术语涵盖“全长”、未加工的多肽以及通过在细胞中处理所得到的任何形式的多肽。该术语还涵盖多肽的天然生成的变体，例如剪接变体或等位基因变体。

在本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”指任意长度的核苷酸聚合物，并包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应而并入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包括经修饰的核苷酸，诸如经甲基化的核苷酸和其类似物。如果存在，可以在组装聚合物之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后被进一步修饰，诸如通过与标记物缀合。其他类型的修饰包括例如“帽子”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰以及未经修饰形式的多核苷酸，该核苷酸间修饰比如为具有不带电荷键接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)和具有带电荷键接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰、包含侧链部分比如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、包含螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、包含烷基化剂的修饰、具有经修饰键接(例如α异头核酸等)的修饰以及未修饰形式的多核苷酸。另外，一般存在于糖类中的任何羟基可以例如被膦酸酯基团、磷酸酯基团取代，被标准保护基团保护，或被活化以制备与其它核苷酸的额外连接，或可与固体或半固体支持物缀合。5’和3’末端OH可以被磷酸化，或被胺或具有1至20个碳原子的有机加帽基团部分取代。其他羟基也可衍生化为标准保护基团。多核苷酸也可包括通常为本领域已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2’-O-甲基核糖、2’-O-烯丙基核糖、2’-氟核糖或2’-叠氮核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚糖、无环类似物和无碱基核苷类似物诸如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键可被替代性连接基团取代。这些替代性连接基团包括但不限于其中磷酸酯被P(O)S(“硫代磷酸”)、P(S)S(“二硫代磷酸”)、"(O)NR₂(“酰胺酯”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH₂(“甲缩醛”)取代的实施方案，其中每个R或R’独立地为H或任选地包含醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)的取代或未取代的烷基(1-20个C)。并非多核苷酸中的所有键必须是相同的。以上描述适用于本文提到的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

术语“小分子”指分子量为约2000道尔顿或更小，优选约500道尔顿或更小的任何分子。

“分离的”抗体是从其天然环境的组分中分离出的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度，该纯度如通过例如电泳法(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如离子交换或反相HPLC)所测定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。

术语“抗体”在本文中以最广泛的意义来使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。

术语抗受关注多肽的抗体和“结合受关注多肽的抗体”指能够以足够亲和力结合受关注多肽，使得该抗体可用作靶向受关注多肽的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中，如例如通过放射免疫分析(RIA)所测量，抗受关注多肽的抗体与无关的、非受关注多肽的蛋白的结合程度是该抗体结合至受关注多肽的约10％。在某些实施方案中，结合至受关注多肽的抗体的离解常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10^-8M或更小，例如从10^-8M至10^-13M，例如从10^-9M至10^-13M)。在某些实施方案中，抗受关注多肽的抗体结合至受关注多肽的表位，该表位在来自不同物种的受关注多肽间是保守地。在一些实施方案中，受关注的多肽是FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)。在一些实施方案中，受关注多肽是EGFR。

“阻断性抗体”或“拮抗性抗体”是抑制或降低其所结合抗原的生物活性的抗体。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体实质性或完全抑制抗原的生物活性。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。如本文所用，除非另外指明，否则“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X与其配偶体Y的亲和力一般可以通过离解常数(Kd)表示。可通过本领域已知的常见方法测定亲和力，包括本文所述的那些方法。下文描述了用于测定结合亲和力的特定说明性和示例性实施方案。

“抗体片段”是指不同于完整抗体之外的分子，其包含完整抗体中结合该完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

作为参照抗体的“结合相同表位的抗体”是指在竞争分析中使参照抗体与其抗原的结合受阻断50％或更多的抗体，且相反，在竞争分析中，参照抗体使该抗体与其抗原的结合受阻断50％或更多。

术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分是源自特定的来源或物种，而该重链和/或轻链的其余部分使源自不同的来源或物种的抗体。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完全抗体”在本文中可互换使用，是指具有实质上类似于天然抗体结构的结构或具有包含Fc区的重链的抗体。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指实质上均质抗体群体的抗体，即，除可能的变异抗体(例如含天然存在的突变或在单克隆抗体制剂生产期间产生的抗体，此类变体通常是少量存在)之外，构成该群体的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包含针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体是针对抗原上的单个决定子。因此，修饰语“单克隆”实质上均质抗体群体的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法制备该抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用包含所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，此类方法和用于制备单克隆抗体的其它示例性方法。

“人抗体”是一种具有对应于由人类或人类细胞生产或者源自利用人抗体谱系或其它人抗体编码序列的非人类来源的抗体的氨基酸序列的抗体。此人抗体的该定义特别排除了包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。

“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个并且通常两个可变结构域的实质上全部，其中全部或实质上全部HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并全部或实质上全部FR对应于人抗体的FR。人源化抗体可任选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。例如非人抗体的抗体的“人源化形式”是指经历了人源化的抗体。

“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。

“PLX4032”和“维罗非尼”在本文可互换使用并指N-(3-{[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]羰基}-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺。

“B-raf活化”是指B-raf激酶的活化或磷酸化。一般来讲，B-raf活化导致信号转导。

如本文所用的术语“B-raf”除非另外指明否则是指任何天然的或变异的(无论是天然的还是合成的)B-raf多肽。术语“野生型B-raf”通常是指包含天然存在的B-raf蛋白的氨基酸序列的多肽。

如本文所用的术语“B-raf变体”是指在天然B-raf序列中包含一个或多个氨基酸突变的B-raf多肽。任选地，该一个或多个氨基酸突变包括氨基酸取代。

“B-raf拮抗剂”(可互换称作“B-raf抑制剂”)是干扰B-raf活化或功能的试剂。在一个特定实施方案中，B-raf抑制剂对B-raf具有约1,000nM或更小的结合亲和力(离解常数)。在另一个实施方案中，B-raf抑制剂对B-raf具有约100nM或更小的结合亲和力。在另一个实施方案中，B-raf抑制剂对B-raf具有约50nM或更小的结合亲和力。在另一个实施方案中，B-raf抑制剂对B-raf具有约10nM或更小的结合亲和力。在另一个实施方案中，B-raf抑制剂对B-raf具有约1nM或更小的结合亲和力。在一个特定实施方案中，B-raf抑制剂以1,000nM或更小的IC50抑制B-raf信号传导。在另一个实施方案中，B-raf抑制剂以500nM或更小的IC50抑制B-raf信号传导。在另一个实施方案中，B-raf抑制剂以50nM或更小的IC50抑制B-raf信号传导。在另一个实施方案中，B-raf抑制剂以10nM或更小的IC50抑制B-raf信号传导。在另一个实施方案中，B-raf抑制剂以1nM或更小的IC50抑制B-raf信号传导。

“V600E”是指在B-RAF基因中的突变，该突变导致谷氨酰胺取代B-Raf的氨基酸位置600处的缬氨酸。“V600E”按照之前的编号系统也称为“V599E”(Kumar等,Clin.Cancer Res.9:3362-3368,2003)。

如本文所用的例如适用于受体激酶活性的术语“组成型”或“组成型地”是指不依赖于配体或其他活化分子的存在的受体的连续信号传导活性。取决于受体的性质，所有活性均可以为组成型的，或受体的活性可通过结合其他分子(例如配体)而进一步活化。导致受体活化的细胞事件是本领域普通技术人员熟知的。例如，活化可以包括低聚(例如二聚、三聚等)成更高级的受体复合物。复合物可包含单一蛋白物种，即同源复合物。或者，复合物可包含至少两种不同的蛋白物种，即异源复合物。复合物的形成可例如因正常或突变形式的受体在细胞表面上过表达而导致。复合物的形成也可因受体中的一种或多种特定突变而导致。

“个体应答”或“应答”可利用任何指示对个体益处的终点进行评估，包括但不限于：(1)在一定程度地抑制疾病进展(例如癌症进展)，包括减缓和完全阻止；(2)减小肿瘤尺寸；(3)抑制(即减轻、减缓或完全阻止)癌细胞浸润进邻近的外周器官和/或组织中；(4)抑制(即减轻、减缓或完全终止)转移；(5)一定程度上减轻与疾病或病症(例如癌症)相关的一种或多种症状；(6)增加无进展生存期长度；和/或(9)降低治疗后给定时间点的死亡率。

如本文所用的术语“实质性相同”表示两个数值之间足够高的相似程度，以使得本领域技术人员将认为这两个值间的差异在由该值衡量的生物特性(例如Kd值或表达)范畴内具有极小或不具有生物和/或统计显著性。作为参照/比较值的函数，这两个数值之间的差异为例如小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％和/或小于约10％。

如本文所用的短语“实质性不同”表示两个数值之间足够高的差异程度，以使得本领域技术人员将认为这两个值间的差异在由该值衡量的生物特性(例如Kd值)范畴内具有统计显著性。作为参考/比较分子值的函数，这两个数值之间的差异例如大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％和/或大于约50％。

物质/分子(例如药物组合物)的“有效量”是各种剂量下并且持续必要时间段，有效实现期望治疗或预防结果的量。

物质/分子的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及该物质/分子在个体中引起期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指物质/分子的治疗有益效果胜过其任何有毒或有害效果的量。“预防有效量”是指在各种必剂量下并且持续必要时间段上，有效实现期望预防结果的量。通常但非必然，由于预防剂量是在疾病之前或在疾病的早期用于受试者中，因此预防有效量将低于治疗有效量。

术语“药物制剂”是指以允许其中所含的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的其它组分的制剂。

“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

如本文所用，短语“药学上可接受的盐”是指化合物的药学上可接受的有机盐或无机盐。

如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变化形式，诸如治疗(treat)或治疗(treating))是指试图改变待治疗个体的天然进程，并且可为实现预防目的或在临床病变的过程期间中进行的临床介入。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病进展率、改善或缓和疾病状态以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延缓疾病的产生或减缓疾病的进展。

“铂剂”是包含铂的化学治疗剂，例如卡铂、顺铂和奥沙利铂。

术语“细胞毒性剂”或“化学治疗剂”是可用于治疗癌症而不论作用机制如何的生物(例如大分子)或化学(例如小分子)化合物。如本文所用的该术语是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²,Pb²¹²，和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤、亚德里亚霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、阿霉素、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红菌素或其他嵌合剂)；生长抑制剂；酶及其片段诸如核分解酶；抗生素；毒素诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物源性酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；以及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。下文描述其他细胞毒性剂。杀肿瘤剂导致肿瘤细胞被破坏。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如奶牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类和非人类灵长类动物，诸如猴子)、兔和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人类。

术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的特征通常在于细胞生长不受调控的生理病状。此定义包括良性和恶性癌。所谓“早期癌症”或“早期肿瘤”是指非侵袭性的或转移性的，或者归为0期、I期或II期癌症的癌症。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、施旺氏细胞瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体实例包括黑素瘤、结直肠癌、甲状腺癌(例如乳头状甲状腺癌)、非小细胞肺癌(NSCLC)、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃肠癌的胃癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌(包括转移性乳腺癌)、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆管肿瘤以及头颈癌。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤；结直肠癌；甲状腺癌，例如乳头状甲状腺癌；或卵巢癌。

本文中使用的术语“伴随地”是指施用两种或更多种治疗剂，该治疗剂是在时间上足够接近地给予，它们各自的治疗效果在时间上重叠。因此，同时施用包括中止施用一种或多种其它药剂后继续施用一种或多种药剂的给药方案。在一些实施方案中，伴随施用并行地、依序地和/或同时地施用。

“减少或抑制”是指导致总体下降20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的能力。减少或抑制可以指所治疗的病症的症状、转移的存在或大小、或原发性肿瘤的大小。

术语“包装说明书”是指通常包括在治疗产品商业包装内的使用说明，该使用说明包含关于适应症、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌症和/或关于此类治疗性产品的用途的警告的信息。

“制品”是包含至少一种试剂，例如用于治疗疾病或病症(例如癌症)的药物或用于具体检测本文所述生的物标记物的探针的任何制造物(例如包装或容器)或试剂盒。在某些实施方案中，制造物或试剂盒作为用于实施本文所述的方法的单元进行推广、分配或销售。

如本领域技术人员所理解的，本文中提及“约”某一值或参数包括(且描述)针对该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。

应当理解，本文中描述的本发明的方面和实施方案包括“由方面和实施方案组成”和/或“基本上由方面和实施方案组成”。如本文所用，除非另外指示，否则单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数形式。

II.方法和用途

本文提供利用FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的方法。

尤其是，本文提供在个体中治疗癌症的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)FGFR信号传导拮抗剂和(b)B-raf拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的相应量有效增加癌症敏感性时段和/或延迟癌症对B-raf拮抗剂的抗性的产生。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的相应量有效增强包括B-raf拮抗剂的癌症治疗的功效。例如，在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的相应量与包括施用有效量的B-raf拮抗剂而不施用(不存在)FGFR信号传导拮抗剂的标准治疗相比有效增强功效。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的相应量与包括施用有效量的B-raf拮抗剂而不施用(不存在)FGFR信号传导拮抗剂的标准治疗相比有效增加应答(例如完全应答)。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的相应量有效增加癌症敏感性和/或恢复对B-raf拮抗剂的敏感性。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR1信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6和FGF10中的一个或多个。在某些实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼(即，PLX4032)、索拉非尼、PLX4720、PL-3603、GSK2118436、GDC-0879、N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺、GSK 2118436、RAF265(Novartis)、XL281、ARQ736、BAY73-4506中的一个或多个。在某些实施方案中，B-raf拮抗剂可以是B-raf V600E选择性的。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼(即，PLX4032)。

本文提供治疗癌细胞的方法，其中个体中的癌细胞对用B-raf拮抗剂治疗有抗性，该方法包括向个体施用有效量的FGFR信号传导拮抗剂和有效量的B-raf拮抗剂。本文还提供在个体中治疗对B-raf拮抗剂有抗性的癌症的方法，该方法包括向个体施用有效量的FGFR信号传导拮抗剂和有效量的B-raf拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR1信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6和FGF10中的一个或多个。在某些实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼(即，PLX4032)、索拉非尼、PLX4720、PL-3603、GSK2118436、GDC-0879、N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺、GSK 2118436、RAF265(Novartis)、XL281、ARQ736、BAY73-4506中的一个或多个。在某些实施方案中，B-raf拮抗剂可以是B-raf V600E选择性的。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼(即，PLX4032)。

本文还提供增加敏感性和/或恢复对B-raf拮抗剂的敏感性的方法，该方法包括向个体施用有效量的FGFR信号传导拮抗剂和有效量的B-raf拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR1信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6和FGF10中的一个或多个。在某些实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼(即，PLX4032)、索拉非尼、PLX4720、PL-3603、GSK2118436、GDC-0879、N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺、GSK 2118436、RAF265(Novartis)、XL281、ARQ736、BAY73-4506中的一个或多个。在某些实施方案中，B-raf拮抗剂可以是B-raf V600E选择性的。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼(即，PLX4032)。

本文还提供增强包括B-raf拮抗剂的癌症治疗在个体中的功效的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR1信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6和FGF10中的一个或多个。在某些实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼(即，PLX4032)、索拉非尼、PLX4720、PL-3603、GSK2118436、GDC-0879、N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺、GSK 2118436、RAF265(Novartis)、XL281、ARQ736、BAY73-4506中的一个或多个。在某些实施方案中，B-raf拮抗剂可以是B-raf V600E选择性的。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼(即，PLX4032)。

本文提供在个体中治疗癌症，其中癌症治疗包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂，其中该癌症治疗与包括施用有效量的B-raf拮抗剂而不施用(不存在)FGFR信号传导拮抗剂的标准治疗相比具有增强的功效。此外，本文提供在个体中延迟和/或预防癌症对B-raf拮抗剂的抗性的产生的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR1信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6和FGF10中的一个或多个。在某些实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼(即，PLX4032)、索拉非尼、PLX4720、PL-3603、GSK2118436、GDC-0879、N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺、GSK 2118436、RAF265(Novartis)、XL281、ARQ736、BAY73-4506中的一个或多个。在某些实施方案中，B-raf拮抗剂可以是B-raf V600E选择性的。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼(即，PLX4032)。

本文提供治疗具有增加的对B-raf拮抗剂产生抗性的可能性的癌症个体的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR1信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6和FGF10中的一个或多个。在某些实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼(即，PLX4032)、索拉非尼、PLX4720、PL-3603、GSK2118436、GDC-0879、N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺、GSK 2118436、RAF265(Novartis)、XL281、ARQ736、BAY73-4506中的一个或多个。在某些实施方案中，B-raf拮抗剂可以是B-raf V600E选择性的。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼(即，PLX4032)。

本文还提供在癌症个体中增加对B-raf拮抗剂的敏感性的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂。此外，本文提供在癌症个体中延长B-raf拮抗剂的敏感性时段的方法，该方法包括向个体伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR1信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6和FGF10中的一个或多个。在某些实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼(即，PLX4032)、索拉非尼、PLX4720、PL-3603、GSK2118436、GDC-0879、N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺、GSK2118436、RAF265(Novartis)、XL281、ARQ736、BAY73-4506中的一个或多个。在某些实施方案中，B-raf拮抗剂可以是B-raf V600E选择性的。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼(即，PLX4032)。

本文还提供在癌症个体中延长对B-raf拮抗剂的应答持续时间的方法，该方法包括伴随施用(a)有效量的FGFR信号传导拮抗剂和(b)有效量的B-raf拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR1信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6和FGF10中的一个或多个。在某些实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼(即，PLX4032)、索拉非尼、PLX4720、PL-3603、GSK2118436、GDC-0879、N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺、GSK 2118436、RAF265(Novartis)、XL281、ARQ736、BAY73-4506中的一个或多个。在某些实施方案中，B-raf拮抗剂可以是B-raf V600E选择性的。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是维罗非尼(即，PLX4032)。

在任何所述方法的一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是抗体抑制剂、小分子抑制剂、结合多肽抑制剂和/或多核苷酸拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是结合多肽抑制剂。在一些实施方案中，结合多肽抑制剂包含连接到Fc的FGFR的胞外结构域的区(例如FP-1039(Five Prime))。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR1信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR2信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR3信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR4信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是抗体。

在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR1b、FGFR1c、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6和FGF10中的一个或多个。在一些实施方案中，小分子是N-[2-[[4-(二乙基氨基)丁基]氨基]-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N'-(1,1-二甲基乙基)-脲或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，小分子是BGJ398(Novartis)、AZD4547(AstraZeneca)和/或FF284(Chugai/Debiopharm(Debio 1347)。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是抗FGF2抗体。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是抗FGFR1抗体。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是抗FGFR1-IIIb抗体。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是抗FGFR1-IIIc抗体。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是能够结合多于一种FGFR多肽的抗FGFR抗体。

对本文所使用的疗法具有抗性的癌症包括对该疗法无应答和/或对该疗法产生明显应答(例如，部分应答和/或完全应答)的能力降低的癌症。抗性可以是在治疗方法的过程中出现的获得性抗性。在一些实施方案中，获得性耐药性是短暂和/或可逆的药物耐受性。对疗法的短暂和/或可逆的耐药性包括其中耐药性能够在治疗方法中断后重新获得对疗法的敏感性。在一些实施方案中，获得性抗性是永久性抗性。对疗法的永久性抗性包括赋予耐药性的遗传变化。

对本文所使用的疗法具有敏感性的癌症包括有应答和/或能够产生明显应答(例如，部分应答和/或完全应答)的癌症。

确定或评估对疗法的抗性的获得和/或敏感性的维持的方法是本领域已知的并在实施例中进行描述。可以通过如实施例和Sharma等中所述测定耐药性持留细胞(drug tolerant persister)的生长来评估抗性的获得和/或敏感性的维持(诸如药物耐受性)的变化。可以通过如实施例和Sharma等中所述测定耐药性扩大持留细胞的生长来评估抗性的获得和/或敏感性的维持(诸如永久性抗性和/或扩大抵抗者)的变化。在一些实施方案中，可以通过IC₅₀、EC₅₀的变化或耐药性持留细胞和/或耐药性扩大持留细胞(drug tolerant expanded persister)中肿瘤生长的降低来指示抗性。在一些实施方案中，所述变化大于约50％、100％和/或200％中的任一个。此外，可以在体内评估抗性获得和/或敏感性维持的变化，例如通过评估对疗法的应答、应答持续时间、和/或进展前时间，例如部分应答和完全应答。抗性获得和/或敏感性维持的变化可以基于一群个体中对疗法的应答、应答持续时间、和/或进展前时间的变化，例如部分应答和完全应答的数目。

在任何所述方法的一些实施方案中，癌症是实体瘤癌。在一些实施方案中，癌症是肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌(例如HER2阳性乳腺癌)。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是上皮组织癌。在一些实施方案中，癌症是腺癌。开始包含FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的治疗方法时本文所述的任何联合治疗中的癌症可以是对包含单独的B-raf拮抗剂的治疗方法敏感的(敏感性的实例包括但不限于应答和/或能够产生显著应答(例如部分应答和/或完全应答))。开始包含FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的治疗方法时本文所述的任何联合治疗中的癌症可以不对包含单独的B-raf拮抗剂的治疗方法具有抗性(抗性的实例包括但不限于不应答和/或能够产生显著应答(例如部分应答和/或完全应答)的能力降低和/或不能产生显著应答(例如部分应答和/或完全应答))。在一些实施方案中，癌症已经历了上皮-间充质转变(EMT)。在一些实施方案中，EMT通过测定上皮相关蛋白/RNA(例如E-钙粘蛋白)和/或间充质相关蛋白/RNA(例如波形蛋白)的表达而检测。在一些实施方案中，癌症具有野生型B-raf(即，癌症在B-raf中无突变)。在一些实施方案中，癌症在B-raf中具有突变。在一些实施方案中，突变型B-raf是组成型活化的B-raf。在一些实施方案中，突变型B-raf是B-raf V600。在一些实施方案中，B-raf V600是B-raf V600E。在一些实施方案中，突变型B-raf是B-raf V600K(GTG>AAG)、V600R(GTG>AGG)、V600E(GTG>GAA)和/或V600D(GTG>GAT)中的一个或多个。

在任何所述方法的一些实施方案中，根据任何上述实施方案的个体可以是人类。

在任何所述方法的一些实施方案中，上述联合治疗涵盖组合施用(其中将两种或更多种治疗剂包含在相同或不同制剂中)和分开施用，在分开施用的情况下，本发明的拮抗剂的施用可在额外的治疗剂和/或佐剂的施用之前、同时、依序、共同和/或之后进行。在一些实施方案中，联合治疗还包括放射治疗和/或额外的治疗剂。

FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂可通过任何合适的手段施用，包括口服、肠胃外、肺内和鼻內施用，以及如果期望用于局部治疗时，病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如，通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分地取决于施用是短暂的还是长期的。本文预期了各种给药时间表，包括但不限于在不同时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。

本文所述的FGFR信号传导拮抗剂(例如抗体、结合多肽和/或小分子)和B-raf拮抗剂可以按照与良好医疗实践一致的方式来配制、给药和施用。在此情形下的考虑因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的起因、药剂的递送部位、施用方法、施用时间表和医疗从业者已知的其他因素。FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂无需但任选地与目前用于预防或治疗所讨论中的病症的一种或多种药剂一起配制。此类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的量、病症或治疗的类型以及上文论述的其他因素。这些药剂通常以相同的剂量和如本文所述的施用途径，或以本文所述的剂量的约1％至99％，或以任何剂量并且通过凭经验/临床上确定为适当的任何途径进行使用。

对于疾病的预防或治疗而言，本文所述的FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂(当单独或与一种或多种其他额外的治疗剂联合使用时)的适当剂量将取决于待治疗的疾病的类型、疾病的严重性和病程、是否施用FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂用于预防目的还是治疗目的、先前疗法、患者的临床病史和对FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的应答、以及主治医师的判断。将FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂适合一次性或历经一系列治疗施用于患者。对于持续数天或更长时间的重复施用，依据状况，治疗通常将持续直至出现所需的疾病症状抑制为止。此类剂量可间歇施用，例如每周或每三周一次(例如以使得患者接受约两剂至约二十剂，或例如约六剂FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂)。可以首先施用较高的负荷剂量，接着施用一种或多种较低的剂量。示例性给药方案包括施用。然而，可以使用其它给药方案。此疗法的进展易于通过常规技术和分析加以监测。

应理解，任何以上制剂或治疗方法都可使用免疫缀合物作为FGFR信号传导拮抗剂和/或B-raf拮抗剂来实施。

III.治疗组合物

本文提供包含FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的组合。在某些实施方案中，该组合增强单独施用的靶向治疗剂的功效。在某些实施方案中，该组合延迟和/或预防癌症对靶向治疗剂的抗性的产生。在某些实施方案中，该组合增加在癌症个体中靶向治疗剂敏感性的时段。

本文提供可用于本文所述的联合治疗的FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂和/或B-raf拮抗剂为抗体、结合多肽、结合小分子和/或多核苷酸。

各种FGFR和FGF的氨基酸序列是本领域已知的并可公开获得。参见例如FGFR1(例如UniProtKB/Swiss-Prot P11362-1、P11362-2、P11362-3、P11362-4、P11362-5、P11362-6、P11362-7、P11362-8、P11362-9、P11362-10、P11362-11、P11362-12、P11362-13、P11362-14、P11362-15、P11362-16、P11362-17、P11362-18、P11362-19、P11362-20和/或P11362-21)、FGFR2(例如UniProtKB/Swiss-Prot P21802-1(即，FGFR2-IIIc)、P21802-2、P21802-3(即，FGFR2-IIIb)、P21802-4、P21802-5、P21802-6、P21802-7、P21802-8、P21802-9、P21802-10、P21802-11、P21802-12、P21802-13、P21802-14、P21802-15、P21802-16、P21802-17、P21802-18、P21802-19、P21802-20、P21802-21、P21802-22和/或P21802-23)、FGFR3(例如UniProtKB/Swiss-Prot P22607-1(即，FGFR3-IIIc)、P22607-2(即，FGFR3-IIIb)、P22607-3和/或P22607-4)、FGFR4(例如Un iProtKB/Swiss-Prot P22455-1和/或P22455-2)、FGF1(例如UniP rotKB/Swiss-Prot P05230-1和/或P05230-2)、FGF2(例如UniPro tKB/Swiss-Prot P09038-1、P09038-2、P09038-3和/或P09038-4)、FGF3(例如UniProtKB/Swiss-Prot P11487)、FGF4(例如UniProt KB/Swiss-Prot P08620)、FGF5(例如UniProtKB/Swiss-Prot P120 34-1和/或P12034-2)、FGF6(例如UniProtKB/Swiss-Prot 10767)、FGF7(例如UniProtKB/Swiss-Prot P21781)、FGF8(例如UniProt KB/Swiss-Prot P55075-1、P55075-2、P55075-3和/或P55075-4)、FGF9(例如UniProtKB/Swiss-Prot P31371)、FGF10(例如UniPro tKB/Swiss-Prot O15520)、FGF11(例如UniProtKB/Swiss-Prot Q9 2914)、FGF12(例如UniProtKB/Swiss-Prot P61328-1和/或P61328-2)、FGF13(例如UniProtKB/Swiss-Prot Q92913-1、Q92913-2、Q92913-3、Q92913-4和/或Q92913-5)、FGF14(例如UniProtKB/Sw iss-Prot Q92915-1和/或Q92915-2)、FGF16(例如UniProtKB/Swi ss-Prot O43320)、FGF17(例如UniProtKB/Swiss-Prot O60258-1和/或O60258-2)、FGF18(例如UniProtKB/Swiss-Prot O76093)、FGF19(例如UniProtKB/Swiss-Prot O95750)、FGF20(例如UniPr otKB/Swiss-Prot Q9NP95)、FGF21(例如UniProtKB/Swiss-Prot Q 9NSA1)、FGF22(例如UniProtKB/Swiss-Prot Q9HCT0)和/或FGF23(例如UniProtKB/Swiss-Prot Q9GZV9)。

在任何所述方法的一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是抗体抑制剂、小分子抑制剂、结合多肽抑制剂和/或多核苷酸拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是结合多肽抑制剂。在一些实施方案中，结合多肽抑制剂包含连接到Fc的FGFR的胞外结构域的区。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是抗体。

在任何所述方法的一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR1信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR1-IIIb、FGFR1-IIIc,FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6和FGF10中的一个或多个。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR1(例如FGFR1-IIIb和/或FGFR1-IIIc)。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGF2。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGF5。

在任何所述方法的一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是结合多肽。在一些实施方案中，结合多肽是FGFR1融合蛋白，其包含FGFR1多肽的胞外结构域和融合配偶体。在一些实施方案中，FGFR1是FGFR1-IIIb。在一些实施方案中，FGFR1是FGFR1-IIIb。在一些实施方案中，胞外结构域由FGFR1-IIIc的氨基酸22至360或22至592构成。在一些实施方案中，FGFR1融合蛋白是在US7678890中描述的蛋白，该专利据此以引用方式整体并入。

在任何所述方法的一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是抗FGF2抗体。在一些实施方案中，融合配偶体是Fc多肽。在一些实施方案中，抗体是FGF2抗体(例如如US20090304707中所述，该专利据此整体以引用方式并入)，例如通过杂交瘤PTA-8864产生的抗体和/或其人源化抗体。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是抗FGFR1抗体。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是抗FGFR1-IIIb抗体。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是抗FGFR1-IIIc抗体。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是能够结合多于一种FGFR多肽的抗FGFR1抗体。

在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是N-[2-[[4-(二乙基氨基)丁基]氨基]-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N'-(1,1-二甲基乙基)-脲或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是BGJ398(Novartis，即3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲和/或其药学上可接受的盐；CAS#872511-34-7)。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是AZD4547(AstraZeneca，即N-(5-(3,5-二甲氧基苯乙基)-1H-吡唑-3-基)-4-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺和/或其药学上可接受的盐)。在一些实施方案中，FGFR1信号传导拮抗剂是FF284(Chugai/Debiopharm(Debio 1347)。

在任何所述方法的一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR2信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR2信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR2-IIIb、FGFR2-IIIc、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF6、FGF7、FGF9、FGF10、FGF17、FGF18和FGF22中的一个或多个。在一些实施方案中，FGFR2信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR2(例如FGFR2-IIIb和/或FGFR2-IIIc)。在一些实施方案中，FGFR2信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGF2。在一些实施方案中，FGFR2信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGF9。

在任何所述方法的一些实施方案中，FGFR2信号传导拮抗剂是结合多肽。在一些实施方案中，结合多肽是FGFR2融合蛋白，其包含FGFR2多肽的胞外结构域和融合配偶体。实例包括但不限于在WO2008/065543和WO2007/014123中所述的那些，这些专利整体以引用方式并入。在一些实施方案中，FGFR2信号传导拮抗剂是抗FGFR2抗体。在一些实施方案中，FGFR2信号传导拮抗剂是抗FGFR2-IIIb抗体。在一些实施方案中，FGFR2信号传导拮抗剂是抗FGFR2-IIIc抗体。在一些实施方案中，FGFR2信号传导拮抗剂是能够结合多于一种FGFR多肽的抗FGFR2抗体。FGFR2抗体的实例是本领域已知的并包括但不限于在US8,101,723、US8,101,721、WO2001/79266、WO2007/144893和WO2010/054265中所述的抗体，这些专利整体以引用方式并入。

在一些实施方案中，FGFR2信号传导拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，FGFR2信号传导拮抗剂是BGJ398(Novartis，即3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲和/或其药学上可接受的盐；CAS#872511-34-7)。在一些实施方案中，FGFR2信号传导拮抗剂是AZD4547(AstraZeneca；即N-(5-(3,5-二甲氧基苯乙基)-1H-吡唑-3-基)-4-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺和/或其药学上可接受的盐)。在一些实施方案中，FGFR2信号传导拮抗剂是FF284(Chugai/Debio pharm(Debio 1347)。

在任何所述方法的一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR3信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR3信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR3-IIIb、FGFR3-IIIc、FGF1、FGF2、FGF4、FGF8、FGF9、FGF17、FGF18和FGF23中的一个或多个。在一些实施方案中，FGFR3信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR3(例如FGFR3-IIIb和/或FGFR3-IIIc)。在一些实施方案中，FGFR3信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGF2。在一些实施方案中，FGFR3信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGF9。

在任何所述方法的一些实施方案中，FGFR3信号传导拮抗剂是结合多肽。在一些实施方案中，结合多肽是FGFR3融合蛋白，其包含FGFR3多肽的胞外结构域和融合配偶体。在一些实施方案中，FGFR3信号传导拮抗剂是抗FGFR3抗体。在一些实施方案中，FGFR3信号传导拮抗剂是抗FGFR3-IIIb抗体。在一些实施方案中，FGFR3信号传导拮抗剂是抗FGFR3-IIIc抗体。在一些实施方案中，FGFR3信号传导拮抗剂是能够结合多于一种FGFR多肽的抗FGFR3抗体。FGFR3抗体的实例是本领域已知的并包括但不限于在US 8,101,721、WO2010/111367、WO2001/79266、WO2002/102854、WO2002/10972、WO2007/144893、WO2010/002862和/或WO2010/048026中所述的抗体，这些专利整体以引用方式并入。

在一些实施方案中，FGFR3信号传导拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，FGFR3信号传导拮抗剂是BGJ398(Novartis，即3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲和/或其药学上可接受的盐；CAS#872511-34-7)。在一些实施方案中，FGFR3信号传导拮抗剂是AZD4547(Ast raZeneca；即N-(5-(3,5-二甲氧基苯乙基)-1H-吡唑-3-基)-4-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺和/或其药学上可接受的盐)。在一些实施方案中，FGFR3信号传导拮抗剂是FF284(Chugai/Debio pharm(Debio 1347)。在任何所述方法的一些实施方案中，FGFR3拮抗剂是Brivanib、Dovitinib(TKI-258)和/或HM-80871A。

在任何所述方法的一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂是FGFR4信号传导拮抗剂。在一些实施方案中，FGFR4信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR4-IIIb、FGFR4-IIIc、FGF1、FGF2、FGF4、FGF6、FGF8、FGF9、FGF16、FGF17、FGF18和FGF19中的一个或多个。在一些实施方案中，FGFR4信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGFR4(例如FGFR4-IIIb和/或FGFR4-IIIc)。在一些实施方案中，FGFR4信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGF2。在一些实施方案中，FGFR4信号传导拮抗剂结合和/或抑制FGF9。

在任何所述方法的一些实施方案中，FGFR4信号传导拮抗剂是结合多肽。在一些实施方案中，结合多肽是FGFR4融合蛋白，其包含FGFR4多肽的胞外结构域和融合配偶体。在一些实施方案中，FGFR4信号传导拮抗剂是抗FGFR4抗体。在一些实施方案中，FGFR4信号传导拮抗剂是能够结合多于一种FGFR多肽的抗FGFR4抗体。FGFR4抗体的实例是本领域已知的并包括但不限于在WO2008/052796和WO2005/037235中所述的抗体，这些专利以引用方式整体并入。

在一些实施方案中，FGFR4信号传导拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，弱FGFR4信号传导拮抗剂是BGJ398(Novartis，即3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲和/或其药学上可接受的盐；CAS#872511-34-7)。在一些实施方案中，弱FGFR4拮抗剂是AZD4547(AstraZeneca；即N-(5-(3,5-二甲氧基苯乙基)-1H-吡唑-3-基)-4-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺和/或其药学上可接受的盐)。在一些实施方案中，弱FGFR4拮抗剂是FF284(Chugai/Debiopharm(Debio 1347)。

示例性FGFR拮抗剂是本领域已知的并包括但不限于US5288855、US6344546、WO94/21813、US20070274981、WO2005/066211、WO2011/068893、US5229501、US6656728、US7678890、WO95/021258、US69 21763、US6713474、US6610688、US6297238、US20130053376、US20 130039855、US2013004492、US20120316137、US20120251538、US20 120195851、US20110129524、US20110053932、US20050227921、EP1 761505、WO2012/125124、WO2012/123585、WO2011/099576、WO2011 /035922、WO2009148928、WO2008/149521、WO2005/079390、WO2003 /080064、WO2008/075068(尤其是实施例80)、WO2005/080330，这些专利以引用方式整体并入。

在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂可以是FGFR/FGF特异性抑制剂，例如FGFR1特异性抑制剂。在一些实施方案中，该抑制剂可以是双重抑制剂或泛抑制剂，其中FGFR信号传导拮抗剂抑制FGFR/FGF和一种或多种其他靶多肽和/或一种或多种FGFR/FGF。

本文还提供可用于本文所述的方法的B-raf拮抗剂。

示例性B-raf拮抗剂包括本领域已知的那些，例如维罗非尼(也称为和PLX4032)、索拉非尼、PLX4720、PLX3603、GSK2118436、GDC-0879、N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺，以及在WO2007/002325、WO2007/002433、WO2009111278、WO2009111279、WO2009111277、WO2009111280和美国专利号7,491,829中所述的那些。其他B-raf拮抗剂包括GSK 2118436、RAF265(Novartis)、XL281、ARQ736、BAY73-4506。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是选择性B-raf拮抗剂。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是B-raf V600的选择性拮抗剂。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是B-raf V600E的选择性拮抗剂。在一些实施方案中，B-raf V600是B-raf V600E、B-raf V600K和/或V600D。在一些实施方案中，B-raf V600是B-raf V600R。

B-raf拮抗剂可以是小分子抑制剂。小分子抑制剂优选地为结合(优选地特异性结合)B-raf的除本文所述的多肽或抗体之外的有机分子。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是激酶抑制剂。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是抗体、肽、肽模拟物、适体(aptomer)或多核苷酸。

可用于所述方法的抗B-raf抗体包括以足够的亲和力和特异性结合B-raf并且可以降低或抑制B-raf活性的任何抗体。所选的抗体通常将具有足够强的对B-raf的结合亲和力，例如，该抗体可以介于100nM至1pM之间的Kd值结合人B-raf。抗体亲和力可例如通过基于表面等离振子共振的测定法(诸如，如PCT申请公布号WO2005/012359中所述的BIAcore测定法)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)和竞争测定法(例如RIA)测定。

在一些实施方案中，B-raf拮抗剂可以是B-raf特异性抑制剂。在一些实施方案中，该抑制剂可以是双重抑制剂或泛抑制剂，其中B-raf拮抗剂抑制B-raf和一种或多种其他靶多肽。

A.抗体

本文提供用于本文所述的方法的分离抗体，其结合至受关注多肽诸如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)和/或B-raf。在任何上述实施方案中，抗体是人源化的。另外，根据任何上述实施方案的抗体为单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一个实施方案中，抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab’)₂片段。在另一个实施方案中，抗体为全长抗体，例如，如本文所定义的“完整IgG1”抗体或其他抗体类别或同种型。

在又一方面，根据任何上述实施方案的抗体可以并入如以下部分中所述的任何特征的一个或组合：

1.抗体亲和力

在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10^-8M或更小，例如从10^-8M至10^-13M，例如从10^-9M至10^-13M)的离解常数(Kd)。在一个实施方案中，通过放射性标记的抗原结合分析(RIA)来测量Kd。在一个实施方案中，用Fab形式的受关注抗体及其抗原进行RIA。例如，通过在未标记抗原的滴定系列的存在下用最小浓度的(¹²⁵I)标记抗原来平衡Fab，然后用抗Fab抗体涂层板捕获所结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为建立分析条件，用含在50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕获用抗Fab抗体(Cappel Lab)涂覆多孔板(Thermo Scientific)过夜，随后在室温(大约23℃)下用含在PBS的2％(w/v)牛血清白蛋白封闭二至五小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与受关注Fab的连续稀释液混合(例如，与Presta等,CancerRes.57:4593-4599(1997)的抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)。然后孵育受关注Fab过夜；然而，该孵育可持续更长时间(例如约65小时)以确保达到平衡。然后，将混合物转移到捕获板，在室温下孵育(例如，持续1小时)。然而移除溶液，用含在PBS中的0.1％聚山梨酸酯20洗涤板八次。当平板干燥后，添加150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20^TM；Packard)，并在TOPCOUNT ^TMγ计数器(Packard)上对板计数10分钟。选择产生小于或等于最大结合的20％的每个Fab的浓度用于竞争性结合分析。

根据另一个实施方案，使用表面等离共振分析测量Kd。例如，在25℃下，使用固定抗原CM5芯片以大约10个应答单位(RU)进行使用或(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的分析。在一个实施方案中，根据供应商的说明使用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠(pH4.8)稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射，以获得大约10个应答单位(RU)的偶联蛋白。在抗原注射后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下将Fab的两倍连续稀释(0.78nM至500nM)以大约25μl/min的流速注射到含0.05％聚山梨酸酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂(PBST)的PBS中。使用简单一对一Langmuir结合模型(评估软件3.2版)，通过同时拟合结合和离解传感图来计算结合速率(k_on)和离解速率(k_off)。平衡离解常数(Kd)被计算为k_off/k_on比率。参见例如，Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果上述表面等离振子共振分析测得结合速率超过10⁶M^-1s^-1，则可通过使用荧光淬灭技术来测定结合速率，即如在分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯所测量，在浓度渐增的抗原的存在下，测量PBS(pH7.2)中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃下的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。

2.抗体片段

在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂、Fv和scFv片段，以及下文所述的其他片段。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün,于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；另见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基并且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')₂片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。

双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，可以是二价的或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。在Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)中还描述了三抗体和四抗体。

单结构域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变结构域或整个或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516)。

可通过各种技术制备抗体片段，这些技术包括但不限于如本文所述的完整抗体的蛋白水解消化，以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)。

3.嵌合和人源化抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在美国专利号4,816,567和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中进行了描述。在一个实例中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔，或非人灵长类动物诸如猴子的可变区)和人类恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体是其中类或亚类已从亲本抗体发生改变的一个“类型切换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，使非人类抗体人源化以降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人类抗体的特异性和亲和力。一般来讲，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR例如CDR(或其部分)衍生自非人类抗体，而FR(或其部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体任选地还包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被非人类抗体(例如，衍生HVR残基的抗体)的相应残基取代，例如用于恢复或提高抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中进行了综述，并在例如Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR重排”)以及Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR重排的“导向选择”方法)中进一步描述。

可用于人源化的人类框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；衍生自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人生殖细胞框架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及衍生自筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。

4.人抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可使用本领域已知的各种技术制备人抗体。人抗体通常如van Dijk和van de Winke l,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中所述。

可通过向转基因动物施用免疫原来制备人抗体，该转基因动物已被修饰为应答抗原激发而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常包含所有或部分人免疫球蛋白基因座，其取代了内源性免疫球蛋白基因座，或其在染色体外存在或无规整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源性免疫球蛋白基因座灭活。关于从转基因动物获取人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSE^TM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述技术的美国专利号7,041,870以及描述技术的美国专利申请公布号US 2007/0061900。可以例如通过与不同的人恒定区组合来进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。

还可通过基于杂交瘤的方法制备人抗体。用于制备人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系已有所描述(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也在Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中进行了描述。额外的方法包括例如美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人杂交瘤技术(三体杂交瘤(Trioma)技术)还在Vollmers和Brandlein,Hist.&Histopath.,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods Find Exp.Clin.Pharmacol.,27(3):185-91(2005)中进行了描述。

还可通过分离选自人衍生型噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来生成人抗体。然后，可以将此类可变结构域序列与所需的人恒定结构域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。

5.文库源性抗体

可通过筛选组合文库中具有一种或多种所需的活性的抗体来分离抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库以及筛选此类文库中具有所需结合特性的抗体的多种方法是本领域已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等Methods Mol.Biol.178:1-37(O’Brien等编,Hum an Press,Totowa,NJ,2001)中，并进一步在例如McCafferty等,Nature 348:552-554；Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,Methods Mol.Biol.248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Le e等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中描述。

在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的谱系，并于噬菌体文库中无规重组，然后可筛选噬菌体文库中的抗原结合噬菌体，如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体通常展示呈单链Fv(scFv)片段形式或呈Fab片段形式的抗体片段。来自免疫来源的文库提供了针对免疫原的具有高亲和力的抗体，而无需构建杂交瘤。或者，可(例如自人)克隆天然谱系以在没有任何免疫的情况下，提供针对大范围的非自体抗原和自体抗原的单一来源抗体，如Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，还可通过以下方式合成制备天然文库：自干细胞克隆未重排的V基因区段并使用含有PCR引物的无规序列以编码高度可变的CDR3区并且体外实现重排，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括例如：美国专利号5,750,373以及美国专利公布号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。

从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被视为人抗体或人抗体片段。

6.多特异性抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性中的一种是受关注多肽，诸如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)和/或B-raf，而另一种针对任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合受关注多肽(诸如FGFR/FGF和/或B-raf)的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达受关注多肽诸如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)和/或B-raf的细胞。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段。

用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于：具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))；WO 93/08829和Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991))，以及“孔中钮”(knob-in-hole)工程化(参见例如美国专利号5,731,168)。还可通过以下方法制备多特异性抗体：工程化用于生成抗体Fc-杂二聚体分子的静电牵引效应(WO2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980和Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以生成双特异性抗体(参见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术以生成双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及如例如在Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。

本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”(Octopus antibodies)(参见例如US 2006/0 025576A1)。

本文的抗体或片段还包括“双重性作用FAb”或“DAF”，其包含结合受关注多肽诸如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)和/或B-raf以及另一种不同抗原的抗原结合位点(参见例如US 2008/0069820)。

7.抗体变体

a)糖基化变体

在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可通过改变氨基酸序列以产生或移除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体添加糖基化位点或使抗体缺失糖基化位点。

在抗体包含Fc区的情况下，可改变其附接的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体一般包含支化的双触角寡糖，其一般通过N-键附接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如Wright等TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接至双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的海藻糖。在一些实施方案中，可对本发明的抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改进性质的抗体变体。

在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏附接(直接或间接)至Fc区的海藻糖的碳水化合物结构。例如，海藻糖在此类抗体中的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。如通过MALDI-TOF质谱法所测量，通过相对于附接至Asn297的全部糖结构(例如复合、杂交和高甘露糖结构)的总和，计算在Asn297处的糖链内海藻糖的平均量而测定海藻糖的量，如例如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中的约位置297位(Fc区残基的Eu编号)处的天冬酰胺残基；然而，Asn297还可以由于抗体的微小序列变异而位于位置297的上游或下游约±3个氨基酸处，即在位置294和位置300位之间。此类海藻糖基化变体可具有改进的ADCC功能。参见例如美国专利公布号US 2003/0157108(Presta,L.)、US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“去海藻糖基化”或“海藻糖缺乏的”抗体变体的专利公布的实例包括：US 2003/0157108；W O 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2 004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/08457 0；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/03 1140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-O hnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成去海藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质海藻糖基化的Lec13CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1,Presta,L；以及WO 2004/05631 2 A1，Adams等，尤其是实例11)，以及基因敲除细胞系，诸如α-1,6-海藻糖基转移酶基因FUT8基因敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biot echnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。

进一步提供了具有两等分寡糖的抗体变体，例如其中附接至抗体的Fc区的双触角寡糖通过GlcNAc二等分。此类抗体变体可具有降低的海藻糖基化和/或改进的ADCC功能。此类抗体变体的实例在例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)、美国专利号6,602,684(Umana等)和US 2005/0123546(Umana等)中有所描述。还提供了在附接至Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改进的CDC功能。此类抗体变体在例如WO 1997/30087(Patel等)、WO 1998/58964(Raju,S.)和WO 1999/22764(Raju,S.)中有所描述。

b)Fc区变体

在某些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区，从而生成Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。

在某些实施方案中，本发明涵盖了具有一些但非全部效应子功能的抗体变体，这些效应子功能使该抗体成为某些应用的期望候选物，在这些应用中抗体的体内半衰期是重要的，但某些效应子功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可进行体外和/或体内细胞毒性分析，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/去除。例如，可进行Fc受体(FcR)结合分析，以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的初级细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464页上的表3。评估受关注分子的ADCC活性的体外分析的非限制性实例在美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中有所描述。或者，可采用非放射性分析方法(参见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madi son,WI))。适用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估受关注分子的ADCC活性，例如在动物模型，诸如Clynes等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所公开的。还可进行C1q结合分析，以确认抗体不能结合C1q，从而缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为评估补体活化，可进行CDC分析(参见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood 101:1045-1052(2003)和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。还可使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。

效应子功能降低的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个经取代的那些抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括具有氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297被取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。

描述了对与FcR的结合有所改善或减弱的某些抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312和Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个具有改进ADCC的氨基酸取代(例如Fc区的位置298、333和/或334处(EU残基编号)处的取代)的Fc区。在一些实施方案中，对Fc区作出改变，其导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的改变(即，改善或降低)，例如如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。

半衰期增加且与负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿Fc受体(FcRn)(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))的结合得到改进的抗体在US2005/0014934A1(Hinton等)中有所描述。这些抗体包含具有一个或多个改进取代Fc区对取代FcRn的结合的取代的Fc区。此类Fc变体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一个或多个处具有取代，例如Fc区残基434的取代的那些变体(美国专利号7,371,826)。关于Fc区变体的其他实例，还参见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351。

c)半胱氨酸工程化抗体变体

在某些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸工程化抗体，例如通过使用THIOMAB^TM技术，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，被取代的残基存在在抗体的可接近位点处。通过用半胱氨酸取代这些残基，从而将反应性硫醇基团借此定位于抗体的可接近位点，并且该活性硫醇基团可用于将抗体缀合到其他部分，诸如药物部分或接头-药物部分，以产生免疫缀合物，如本文进一步描述。在某些实施方案中，以下残基中的任一个或多个可被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。另外的抗体可设计有半胱氨酸取代，如在美国专利号7,521,541和美国专利公布号20110301334中所述，这些专利整体并入本文。半胱氨酸工程化抗体可以如例如美国专利号7,521,541中所述而生成。

B.免疫缀合物

本文还提供包含结合受关注多肽诸如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)或B-raf的抗体的免疫缀合物，该抗体与一种或多种细胞毒剂诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)、或放射性同位素缀合，以用于本文所述的方法。

在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，该药物包括但不限于美登木素(参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235 B1)；奥瑞斯他汀(auristatin)，诸如单甲基奥瑞斯他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588以及7,498,298)；多拉司他汀；卡里奇霉素或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和 5,877,296；Hinman等,Cancer Res.53:3336-3342(1993)；以及Lode等,Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环霉素，诸如柔红霉素或阿霉素(参见Kratz等,Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King等,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)和美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷，诸如多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛(larotaxel)、泰西他赛(tesetaxel)和奥拉他赛(ortataxel)；单端孢霉烯；以及CC1065。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文所述的抗体，该酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲菌素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecene)。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文所述的抗体。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合物。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²，和Lu的放射性同位素。当使用放射性缀合物进行检测时，其可包含供闪烁法研究用的放射性原子，例如Tc^99m或I¹²³，或供核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可使用多种双官能蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如己二亚胺二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮基苯甲酰)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯-2,6-二异氰酸酯)以及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)抗体和细胞毒性剂的缀合物。例如，蓖麻毒素这种免疫毒素可如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述而制备。碳-14-标记的1-异硫氰酸酯基苄基-3-甲基二亚乙基三胺戊乙酸(MX-DTPA)是放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是有助于细胞毒性药物在细胞中释放的“可裂解接头”。例如，可以使用酸不稳定的接头、肽酶敏感性接头、光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。

本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的此类缀合物，该交联剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)，这些可商购获得(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。

C.结合多肽

本文还提供了用于本文所述的方法的结合多肽，该结合多肽是结合(优选地特异性结合到)FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)和/或B-raf的多肽。在一些实施方案中，结合多肽是FGFR(例如FGFR1,FGFR2,FGFR3和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)拮抗剂和/或B-raf拮抗剂。结合多肽可以使用已知的多肽合成方法化学合成，或可使用重组技术制备和纯化。结合多肽的长度通常为至少约5个氨基酸，或至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸或更长，其中此类结合多肽能够结合到(优选地特异性结合到)靶标，例如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)或B-raf，如本文所述。结合多肽可使用熟知的技术无需过多试验来鉴定。就这一点而言，应注意，用于筛选多肽文库中能够特异性结合多肽靶标的结合多肽的技术是本领域熟知的(参见例如美国专利号5,556,762、5,750,373、4,708,871、4,833,092、5,223,409、5,403,484、5,571,689、5,663,143；PCT公布号WO 84/03506和WO84/03564；Geysen等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:3998-4002(1984)；Geysen等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:178-182(1985)；Geysen等,于Synthetic Peptides as Antigens,130-149(1986)；Geysen等,J.Immunol.Meth.,102:259-274(1987)；Schoofs等,J.Immunol.,140:611-616(1988)；Cwirla,S.E.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378；Lowman,H.B.等(1991)Biochemistry,30:10832；Clackson,T.等(1991)Nature,352:624；Marks,J.D.等(1991)J.Mol.Biol.,222:581；Kang,A.S.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8363；以及Smith,G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.,2:668)。

生成肽文库和筛选这些文库的方法还在美国专利号5,723,286、5,432,018、5,580,717、5,427,908、5,498,530、5,770,434、5,734,018、5,698,426、5,763,192和5,723,323中有所公开。

D.结合小分子

本文提供了用于上文所述的方法中的结合小分子，其用作FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)和/或B-raf的小分子拮抗剂。

结合小分子优选地为除本文所定义的结合多肽或抗体之外的有机分子，其结合到(优选地特异性结合到)如本文所述的FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)和/或B-raf。可以使用已知的方法来确定和化学合成结合有机小分子(参见例如PCT公布号WO00/00823和WO00/39585)。结合有机小分子的大小通常小于约2000道尔顿，或者其小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中此类能够结合到(优选地特异性结合到)如本文所述的多肽的有机小分子就可使用熟知的技术无需过多实验来确定。就这一点而言，应注意，用于筛选有机小分子文库中能够结合受关注多肽的分子的技术是本领域熟知的(参见例如PCT公布号WO00/00823和WO00/39585)。结合有机小分子可以是例如醛、酮、肟、腙、缩氨基脲、卡巴肼、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、缩酮、酮缩硫醇、缩醛、硫缩醛、芳基卤、芳基磺酸酯、烷基卤、烷基磺酸酯、芳族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔烃、二醇、氨基醇、噁唑烷、噁唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺、环氧化物、氮丙啶、异氰酸酯、磺酰氯、重氮化合物、酰基氯等。

E.拮抗剂多核苷酸

本文还提供用于本文所述的方案的多核苷酸拮抗剂。多核苷酸可以是反义核酸和/或核酶。反义核酸包含与受关注基因诸如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)和/或B-raf基因的RNA转录物的至少一部分互补的序列。然而，绝对互补性虽然是优选的，但其不是必需的。

本文中提及的“与RNA的至少一部分互补的”序列意指具有足够的互补性而能够与RNA杂交从而形成稳定双链体的序列；在双链反义核酸的情况中，因而可以测试双链体DNA的单链，或者可以测定三链体形成。杂交能力将取决于互补性程度和反义核酸的长度这两者。一般来讲，杂交的核酸越大，核酸可以含有的与RNA的碱基失配越多，并且仍形成稳定的双链体(或视情况而定，三链体)。本领域技术人员可以通过使用标准规程测定杂交复合物的熔点来确认可容许的失配度。

与信使的5'端(例如，5'非翻译序列直至AUG起始密码子且包括AUG起始密码子)互补的多核苷酸在抑制翻译方面应当最有效。然而，已经显示了与mRNA的3'非翻译序列互补的序列也有效抑制mRNA的翻译。一般参见Wagner,R.,1994,Nature 372:333-335。因此，与基因的5'-或3'-非翻译、非编码区互补的寡核苷酸可以在反义方法中用来抑制内源性mRNA的翻译。与mRNA的5'非翻译区互补的多核苷酸应当包括AUG起始密码子的补体。与mRNA编码区互补的反义多核苷酸是不太有效的翻译抑制剂，但是可以根据本发明使用。无论是设计成与mRNA的5'-、3'-还是编码区杂交，反义核酸的长度都应当是至少6个核苷酸，并且优选地为长度在6至约50个核苷酸范围内的寡核苷酸。在具体的方面，寡核苷酸是至少10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。

F.抗体和结合多肽变体

在某些实施方案中，考虑了本文所提供的抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体。例如，可能期望改进抗体和/或结合多肽的结合亲和力和/或其他生物特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体和/或结合多肽的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体和/或结合多肽的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可对缺失、插入和取代进行任何组合，以获得最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特性，例如抗原结合。

在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体和/或结合多肽。取代诱变的受关注突变位点包括HVR和FR。保守取代如表1的“优选取代”标题下所示。表1的“示例性取代”标题下提供了更多的实质性变化，如下文结合氨基酸侧链类别进一步描述。可将氨基酸取代引入受关注抗体和/或结合多肽，然后筛选产物的所需活性，例如保持/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。

表1

氨基酸可根据共同的侧链特性分组：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守取代需要将这些类别中的一种的成员转换为另一种类别。

G.抗体和结合多肽衍生物

在某些实施方案中，本文提供的抗体和/或结合多肽可进一步修饰为包含本领域已知的且易得的其他非蛋白质部分。适于使抗体和/或结合多肽衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于：聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)以及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。聚乙二醇丙醛由于在水中的稳定性，在制备中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以是支化的或非支化的。附接至抗体和/或结合多肽上的聚合物数量可变化，而且如果附接了超过一个聚合物，则该聚合物可以是相同的或不同的分子。一般来讲，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可基于多种考虑因素来确定，所述考虑因素包括但不限于抗体和/或结合多肽的待改进的特定性质或功能，无论该抗体衍生物和/或结合多肽是否将用于在确定条件下的治疗等。

在另一个实施方案中，提供了抗体和/或结合多肽与可通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，该非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以具有任何波长，且包括但不限于不会伤害普通细胞但将非蛋白质部分加热至邻近该抗体和/或结合多肽-非蛋白质部分的细胞将被杀死的温度的波长。

IV.筛选和/或鉴定具有所需功能的FGFR信号传导拮抗剂的方法

上文已经描述了用于本文所述的方法的受关注多肽诸如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)、FGF(例如FGF1-23)和/或B-raf的额外的拮抗剂，包括抗体、结合多肽和/或小分子。诸如本文所提供的抗体、结合多肽和/或结合小分子的额外的拮抗剂可以通过本领域已知的各种分析进行鉴定、筛选或表征其物理/化学性质和/或生物学活性。

在某些实施方案中，所包括的存储器包含FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)多肽的原子坐标的计算机系统可作为模型用于合理地鉴定结合FGFG信号传导的配体结合位点的化合物。例如，可以重新或通过修饰已知化合物来设计此类化合物。在其他情况中，可以通过测试已知化合物以确定其是否“对接”FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)的分子模型来鉴定结合性化合物。此类停靠方法是本领域众所周知的。

FGFR信号传导晶体结构数据可以与计算机建模技术结合使用，从而通过分析晶体结构数据来开发各种FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)结合性化合物的结合的模型。位点模型表征位点表面的三维形貌，以及包括范德华力接触、静电相互作用和氢键结合机会等因素。然后使用计算机模拟技术来标绘被设计成与模型位点相互作用的官能团(包括但不限于质子、羟基基团、胺基团、二价阳离子、芳族和脂族官能团、酰胺基团、醇基团等)的相互作用位置。可以将这些基团设计到药效团或候选化合物中，预期该候选化合物将特异性结合该位点。因此，药效团的设计涉及到考虑落入药效团内的候选化合物通过任何或所有可用类型的化学相互作用(包括氢键结合、范德华力、静电和共价相互作用)与位点相互作用的能力，尽管一般来讲，药效团通过非共价机制与位点相互作用。

除了实际合成以外，还可以使用计算机建模技术来分析药效团或候选化合物结合FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)多肽的能力。只有通过合成那些通过计算机建模被指出以足够的结合能(在一个实例中，结合能对应于10^-2M数量级或更紧密的对靶标的离解常数)结合靶标(例如FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)多肽结合位点)的候选物才可能被合成，并使用本领域技术人员已知的和/或本文所述的酶分析测试它们结合FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)多肽并抑制FGFR信号传导(如果适用的话，酶功能)的能力。因此，计算评估步骤避免了对不太可能以充分亲和力结合FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)多肽的化合物的不必要合成。

可以借助一系列步骤计算评估和设计FGFR信号传导药效团或候选化合物，其中对化学实体或片段与FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)多肽上的各个结合靶位点缔合的能力进行筛选和选择。本领域技术人员可以使用若干方法中的一种对化学实体或片段与FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)多肽，更具体地讲与FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)多肽上的靶位点缔合的能力进行筛选。该过程可以基于FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)多肽坐标或本领域已知的那些坐标的子集，在计算机屏幕上目视检测例如靶位点而开始。

为了选择诱导癌细胞死亡的拮抗剂，可以相对于参照来评估膜完整性的丧失，如通过例如碘化丙啶(PI)、台盼蓝或7AAD摄入来指示。可以在不存在补体和免疫效应细胞的情况下执行PI摄入分析。仅用培养基或用包含适当联合治疗的培养基孵育肿瘤细胞。将细胞孵育3天的时间。每次处理后，洗涤细胞并等分到35mm滤网覆盖的12×75管(每只管1ml，每个处理组3只管)以去除细胞团块。然后试管接收PI(10μg/ml)。可以使用流式细胞仪和CellQuest软件(Becton Dickinson)分析样品。如通过PI摄入所测定的相比于仅含培养基和/或单一疗法诱导统计显著水平的细胞死亡的那些拮抗剂可以被选为诱导细胞死亡的抗体、结合多肽或结合小分子。

在任何筛选和/或鉴定方法的一些实施方案中，候选FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)拮抗剂是抗体、结合多肽、结合小分子或多核苷酸。在一些实施方案中，FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，FGFR(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4)和/或FGF(例如FGF1-23)拮抗剂是小分子。

V.药物制剂

如本文所述的FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的药物制剂通过将具有所需纯度的此类抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合而以冻干制剂或水溶液形式制备。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂和/或B-raf拮抗剂是结合小分子、抗体、结合多肽和/或多核苷酸。药学上可接受的载体通常在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体还包括间质性药物分散剂，诸如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP(包括rHuPH20)和使用方法在美国专利公布号2005/0260186和2006/0104968中有所描述。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的葡糖胺基聚糖酶诸如软骨素酶组合。

示例性冻干制剂在美国专利号6,267,958中有所描述。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后述制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。

本文的制剂也可包含多于一种为所治疗的特定适应症所必需的活性成分，优选为具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。此类活性成分以对于预期目的有效的量适当地联合存在。

可以将活性成分包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微胶囊中，例如分别于胶态药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米囊)中或于粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)中有所公开。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形制品(例如薄膜或微胶囊)的形式。

用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌性可易于例如通过经无菌过滤膜过滤来实现。

VI.制品

在本发明的另一个方面，提供一种含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制品。该制品包括容器和在该容器上或与该容器相伴的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉输液袋等。容器可由诸如玻璃或塑料的多种材料形成。容器内含有单独的组合物或与另一种有效治疗、预防和/或诊断病状的组合物组合的组合物，并且可具有无菌进入口(例如容器可为具有塞子的静脉输液袋或小瓶，塞子可被皮下注射针刺穿)。组合物中的至少一种活性剂为本文所述的FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂。标签或包装说明书指示组合物用于治疗特别的病状。此外，制品可包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中该组合物包含FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中该组合物包含另一种细胞毒性剂或额外的治疗剂。

在一些实施方案中，该制品包含容器、容器上的标签和容器内包含的组合物；其中该组合物包含一种或多种试剂(例如结合一种或多种生物标志物的一级抗体，或针对本文所述的一种或多种生物标记物的探针和/或引物)，容器上指示该组合物可用于评估样品中一种或多种生物标记物的存在，以及使用该药剂来评估样品中一种或多种生物标记物的存在的说明书。该制品还可以包括一套用于制备样品和使用药剂的说明书和材料。在一些实施方案中，该制品可以包含诸如一级抗体和二级抗体两者的试剂，其中二级抗体与标记物例如酶标记物缀合。在一些实施方案中，该制品包含针对本文所述的一种或多种生物标记物的一种或多种探针和/或引物。

在任何制品的一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂和/或B-raf拮抗剂是抗体、结合多肽、结合小分子或多核苷酸。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂和/或B-raf拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，FGFR信号传导拮抗剂和/或B-raf拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是人的、人源化或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是抗体片段且该抗体片段结合FGFR信号传导和/或抑制剂。

本发明的该实施方案中的制品还可以包含包括指示组合物可用于治疗特定病状的包装说明书。或者或另外，制品还可以包含第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)和葡萄糖溶液。其还可以包含从商业和使用者观点来看合乎需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。

制品中的其他任选组分包括一种或多种缓冲液(例如封闭缓冲液、清洗缓冲液、底物缓冲液等)、其他药剂诸如被酶标记物化学改变的底物(例如色原)、表位修复液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照载玻片等。

应当理解，任何上述制品可包含本文所述的免疫缀合物代替或补充FGFR信号传导拮抗剂和B-raf拮抗剂。

实施例

以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上文提供的一般说明，可以实践各种其他实施方案。

实施例1

研究了对B-raf抑制剂具有获得性抗性的两个模型以确定与B-raf抑制剂抗性相关的分泌因子。具体地讲，研究了HER2+乳腺癌和B-raf突变型黑素瘤细胞系。HER+阳性乳腺癌的治疗方案由手术、赫赛汀、拉帕替尼、帕妥珠单抗、T-DM1、蒽环、紫杉烷和卡倍他滨组成(曲妥珠单抗、帕妥珠单抗和多西他赛作为转移性乳腺癌的一线治疗)。HER2+乳腺癌占乳腺癌的大约15-35％(每年约40,000个病例)。联合靶向于HER受体可通过补偿抗性机制而改善存活；然而，尽管存在高初始应答率，但是大部分患者最终产生进行性疾病。B-raf突变型黑素瘤的治疗方案是手术、易普利姆玛(Ipilimubab)(CTLA4)、维罗非尼、曲美替尼(trametinib)、达拉非尼(dabrafenib)和达卡巴嗪(darcarbazine)。约50％的黑素瘤的特征在于B-raf V600E突变，且每年有大约108,000个新病例。虽然大部分患者对维罗非尼有应答，但10％的患者在疗法的早期经历疾病进展，大部分患者在最大应答后具有肿瘤残留，并在1年内复发。

如本文所述，对促进对诸如维罗非尼的疗法的抗性的分泌因子进行了筛选，以确定对B-raf抑制剂的获得性抗性的成因(图11)。

为了确定哪些分泌因子促进耐药性，对HER2+乳腺癌细胞和B-raf突变型黑素瘤细胞进行了分泌因子筛选(图12和图13)。分泌因子筛选的结果显示哪些分泌因子与增强的细胞死亡(即，增强的被因子杀灭)相关以及哪些分泌因子与挽救(即，获得性耐药性)相关。

在存在拉帕替尼、GDC-0032、GDC-0941、GDC-0349、T-DM1或T-DM1加帕妥珠单抗的情况下在HER2+乳腺癌细胞中测量了分泌因子。基于该筛选，将BTC、EGF、FGF、HGF、HRG1、NRG1(EGF)、OSM、PRGN和TGFA(EGF)鉴定为可能导致HER2+乳腺癌细胞中的耐药性的分泌因子。类似地，还在不存在药物或存在PLX4032、GDC-0973或GDC-0623的情况下在B-raf突变型黑素瘤细胞中测量了分泌因子。基于该筛选，将FGF、HGF、HRG1、NRG1(EGF)、OSM、TGFA(EGF)和TNFA鉴定为可能导致B-RAF突变型黑素瘤细胞中的耐药性的分泌因子。

作为分泌因子筛选的结果，鉴定了离散数量的促进挽救的因子。对于HER2+乳腺癌细胞系，FGFR、EGFR和HER3/4的配体作为抗性驱动因素而被牵连。在HER2+乳腺癌细胞系的较小子集中，MET和趋化因子的配体也作为抗性的驱动因素而被牵连。对于B-RAF突变型黑素瘤细胞系，FGFR、MET和HER3/4的配体在抗性中被牵涉。在B-RAF突变型黑素瘤细胞系的较小子集中，cKIT和EGFR的配体也作为抗性的驱动因素而被牵连。

基于该筛选，对于所有测试的化合物(即，药物)，鉴定了促进抗性的分泌因子的相同子集。因此，分泌因子是癌症类型依赖性的。还得出以下结论：药物靶标、化学和浓度影响分泌因子驱动的抗性的强度(即，药物筛选浓度的选择是至关重要的)。还确定，基础受体蛋白表达状态并不总是能预测分泌因子挽救(即，获得性抗性)。例如，虽然EGFR和MET缺失能预测分泌因子挽救，但HER3和FGFR则不能。此外，在EGFR、MET与FGFR之间不存在明显的受体窜扰(crosstalk)介导的挽救，并且靶向下游(mTOR)信号传导节点克服了大部分挽救。

实施例2

研究了分泌因子介导的抗性的下游机制。具体地讲，研究了由分泌因子再次活化的共同通路以确定它们的抑制是否可以克服获得性耐药性。

基于用五种分泌因子中的一种处理的九种细胞系的免疫印迹筛选，确定了没有单种下游信号可以预测所有分泌因子介导的抗性(图14)。此外，配体可通过不同的机制挽救不同的细胞系。

实施例3

在10种HER2+乳腺癌细胞系和10种B-raf突变型黑素瘤细胞系种研究了FGF信号传导和抗性(图15)。10种HER2+乳腺癌细胞系中有7种被FGF2挽救(图15A)。10种B-raf突变型黑素瘤细胞系中有8种被FGF2挽救(图15B)。后续分析确定了50-70％的具有V600E突变的黑素瘤细胞系被FGF2挽救(n＝30)。

此外，确定了FGF2再次活化关键信号传导通路以促进抗性(图16)。这在细胞测定法中得以证实，其中将HER2+乳腺癌细胞在存在拉帕替尼(2μM)的情况下暴露于FGF2(50ng.mL)达10分钟(图16A)。类似地，执行了将HER2+乳腺癌细胞在存在或不存在拉帕替尼(2μM)的情况下暴露于FGF2(50ng/mL)达24小时的测定(图16B)。基于这些实验，确定了FGF2刺激下游信号传导的持续活化。

实施例4

还研究了分泌因子介导的信号传导的动力学和反馈机制。据显示，FGFR靶向作用有效阻断了FGF2挽救。

将三种细胞系(624MEL、928MEL和LOX IMVI)暴露于(5μM)PLX4032(即，维罗非尼)达4小时，然后暴露于分泌(50ng/mL)FGF(亚型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、16、17、18、19、20、21和22)达10分钟。制备了免疫印迹，并探查了p-MEK和p-ERK。确定了许多FGF活化MAPK通路但不促进抗性(图17A)。还将624MEL和982MEL细胞系暴露于(5μM)PLX4032达24小时和(50ng/mL)FGF(亚型1、2、4、6、8、9、17和18)达24小时，然后转到免疫印迹分析。免疫印迹分析探查了p-MEK和p-ERK。确定了信号的寿命可能发挥作用，但另外的因子也在获得性耐药性中被牵涉(图17B)。

还研究了与FGF挽救的下游介导物相关的反馈机制(图18)。将BT-474乳腺癌细胞用2μM拉帕替尼或2μM拉帕替尼加50ng/mLFGF2在存在或不存在p38、PI3K、MEK和FGFR中的一种或多种抑制剂的情况下处理(图18A)。还将细胞用2μM拉帕替尼、MEK抑制剂和/或小分子抑制剂p38、PI3K、p38和PI3K或FGFR预处理，然后用50ng/mL FGF2刺激10分钟。对预处理和刺激后的细胞进行处理，然后进行免疫印迹分析，该免疫印迹分析探查了p-HER2、pMEK、MEK、p-ERK、ERK、p90RSK(pS380)、p90RSK、p-p38MAPK(T180/Y182)、p38MAPK、p-Akt(S473)、Akt和β-肌动蛋白(图18B)。还使用HCC-1954和UACC-893乳腺癌细胞系开展了类似的预处理和/刺激实验。

确定了下游通路的有效阻断通常不会克服FGF2挽救，并且显然存在多种反馈和补偿机制。此外，确定了仅FGFR靶向作用有效阻断了FGF2挽救。

实施例5

开展了实验，并表明FGFR1在黑素瘤中介导FGF2挽救。

将624MEL细胞用DMSO(对照)、5μM PLX4032或5μM PLX4032/FGFb处理，并暴露于靶向FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR1与FGFR4(即，FGFR1/4)、FGFR2与FGFR3(即，FGFR2/3)或FRS2的siRNA(图5A)。类似地，对七种细胞系(624MEL、928MEL、A-375、COLO 849、G361、LOX-IMVI和UACC62)进行了靶向FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR1与FGFR4以及FGFR2与FGFR3的siRNA筛选(图5B)。仅靶向FGFR1和FGFR1/4的siRNA引起了细胞生长/增殖的完全阻断。

在WT和突变型(V600E)细胞系黑素瘤样品(n＝49)中测量了FGFR1、FGFR1、FGFR3和FGFR4表达水平(图5C)。据显示，FGFR1在WT和V600E突变型黑素瘤细胞样品中具有最高的表达。还对未知B-raf状态的TCGA黑素瘤样品(n＝247)进行了分析(图5D)。分析表明FGFR1的表达水平高于FGFR2、FGFR3和FGFR4(**p<0.0001)。

实施例6

据显示FGFR4介导HER2+乳腺癌细胞系中的FGF2挽救。

将HER2+乳腺癌细胞系(AU565、BT-474、HCC1954、SK-BR-3和UACC-893)用拉帕替尼和FGF2处理。之后，将细胞暴露于靶向FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4的siRNA或暴露于FGFR泛抑制剂BGJ398(图19A)。据显示，靶向FGFR4的siRNA和泛抑制剂从对拉帕替尼和FGF2的获得性抗性中具有最大的挽救百分比。还在存在和不存在FGF2的情况下在用拉帕替尼处理的细胞中执行了免疫印迹分析以检测IP/pTyr/IB:FGFR4、FGFR4、pERK、ERK和肌动蛋白(对照)(图19B)。

还分析了TCGA乳腺癌样品(图19C和图19D)。据显示FGFR1水平在乳腺癌样品(n＝913)中较高(图19C)。当针对HER2+乳腺癌设门时，据显示HER2+乳腺癌FGFR4富含高水平的FGFR4(HER2log2RPKM截止值＝8.0)(图19D)。

实施例7

研究了HER2+乳腺癌细胞系中的先天抗性和B-raf突变型黑素瘤细胞系中的获得性抗性模型。

先天抗性HER2+乳腺癌细胞系为HCC1569和MDA-MB-453。HC1569表达FGFR2(通过Western印迹检测)并分泌FGF2(通过ELISA检测)。得自HCC1569细胞系的FGFR ECD嵌合体对拉帕替尼敏感。此外，用FGFR抑制剂处理的HC1569细胞使细胞对拉帕替尼敏感。MDA-MB-453细胞系具有高水平的磷酸化FGFR4表达(通过Western印迹检测)，并且未分泌FGF2(ELISA未检出FGF2)。用FGFR抑制剂处理的MDA-MB-453细胞使细胞对拉帕替尼敏感。

将HCC1569和MDA-MB-453细胞用100nM阿法替尼、100nM克唑替尼或100nM BGJ398在5μM拉帕替尼存在或不存在的情况下处理(图20A和图20B)。如图所示，拉帕替尼和BGJ398的组合将细胞系中耐药性中挽救出来并减小肿瘤体积(图20A-C)。

将Lox-IMVI VemR细胞系用作B-raf突变型黑素瘤中获得性抗性的模型。使用Western印迹测试了11种细胞系的FGFR1表达。在所测试的细胞系中，在LOX-IMVI(维罗非尼敏感性)和LOX-IMVI VemR(维罗非尼抗性)细胞系中检出了FGFR1表达(图2A)。还经证实，LOX-IMVI VemR细胞系通过添加FGFR信号传导拮抗剂(1μM BGJ398、1μM PD173074和1μM AP24534)而被挽救(即，对维罗非尼再次敏感)(图2B)。还在LOX-IMVI(“亲本”)和LOX-IMVI VemR(“VemR”)细胞系中测量了FGF2表达(pg/mL)，并表明LOX-IMVI VemR与维罗非尼敏感性亲本细胞系相比具有增加的FGF2表达(图2C)。此外，靶向FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR1/4、FGFR2/3和FRS2的siRNA筛选证实与维罗非尼联合的FGFR1敲低使LOX-IMVI VemR细胞系对维罗非尼治疗再次敏感(图2D)。

还在体内研究了LOX-IMVI VemR细胞系的维罗非尼抗性和恢复。在存在维罗非尼、BGJ398或维罗非尼与BGJ398的情况下在LOX-IMVI(亲本，维罗非尼敏感性)肿瘤以及在LOX-IMVI VemR(维罗非尼抗性)肿瘤中测量了肿瘤体积(mm³)(图3A和图3B)。如图中所示，当在LOX-IMVI细胞中用维罗非尼(25mg/kg,BID)或维罗非尼(25mg/kg,BID)和BGJ398(15mg/kg,QD)处理时，肿瘤体积减小。相比之下，LOX-IMVI VemR细胞在暴露于维罗非尼时未显示出肿瘤体积减小，但当暴露于维罗非尼和BGJ398的联合处理时确实显示出肿瘤体积的减小。

尽管已经通过说明和实施例详述了上述发明以用于清楚说明，但是这些描述和实施例不应被视为限制本发明的范围。本文所引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用整体并入。