用于控制帕金森病类神经变性疾病的氙和抗氧化剂的组合的制作方法

NMDA(对于N-甲基天冬氨酸)受体/通道是神经元细胞的质膜分子实体。这些受体是释放入突触和突触外间隙的谷氨酸分子的靶标，谷氨酸是提供从一个神经细胞到另一个神经细胞的沟通的兴奋性神经递质。

一些神经变性疾病、特别是帕金森病的特征在于脑干的多巴胺能神经元死亡，并且在临床上表现为自主运动控制缺失、摇动、运动迟缓和僵硬。

帕金森病中的神经元变性牵涉兴奋性中毒，即与由细胞外隙中谷氨酸神经递质过量导致的NMDA受体过度刺激相关的机制(Metha等人，Eur.J.Pharmacol，2013)。

实际上，已经证实在模拟帕金森病的细胞和动物模型中，神经胶质细胞和神经元携带的兴奋性氨基酸转运蛋白(EAATs)功能障碍导致多巴胺能细胞死亡(Nafia等人，J Neurochem，2008；Swanson等人，Ann Neurol，2011)。

此外，培养物中的多巴胺能神经元在它们经历外源性谷氨酸导致的应激时最特别地易损(Douhou等人，J Neurochem，2001)。

此外，在大鼠和猴子中的多巴胺能系统损害后，存在丘脑下神经元活性的增加，所述丘脑下神经元负责多巴胺能神经元的谷氨酸能兴奋性神经支配(Wallace等人，Brain，2007)。

此外，已经确立，多巴胺(DA)防止谷氨酸诱导的毒性(Vaarmann等人，Cell Death and Disease，2013)。因此，多巴胺能损害导致的DA耗尽自身可以促使多巴胺能神经元易损性至兴奋性毒素应激。

然而，从治疗观点来看，目前没有实际有效的和令人满意以及能够治疗、缓解和/或预防人类中的神经变性疾病、特别是帕金森病后神经退化的药物。

鉴于此，产生的问题在于提供能够治疗、缓解和/或预防人类中的神经变性疾病、特别是帕金森病后神经退化的药物。

本发明的解决方案在于药物组合，其包含氙气体和至少一种液体或固体形式的抗氧化剂，该药物组合用于治疗、缓解和/或预防人类中的神经变性疾病后的神经退化。

换句话说，本发明涉及气体组合物，即可吸入的气态药物，其基于氙，该气体组合物与至少一种液体或固体形式的抗氧化剂组合使用，该气体组合物用于治疗、缓解和/或预防人类中的神经变性疾病后的神经退化。

如果适合，本发明的药物组合或组合物可以包含如下技术特征的一个或多个：

-它包含10％-80％体积的氙；

-所述抗氧化剂是维生素E、维生素E的化学类似物或维生素E的化学衍生物；

-所述抗氧化剂是水溶性维生素E，即6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸，其为维生素E的水溶性化学类似物(Davies等人，Biochem J.，1988)；

-液体形式的抗氧化剂；

-所述抗氧化剂是液体形式的水溶性维生素E；

-所述神经变性疾病是帕金森病或与帕金森病相关的疾病，优选帕金森病；

-将氙气体与施用抗氧化剂的同时或在施用抗氧化剂之后施用于患者，优选在施用抗氧化剂之后；

-与Ca²⁺离子过量进入待治疗的患者或人类的易损神经元的一个或多个群体相关的神经退化；

-氙是与氧和/或氮的混合物；

-氧的比例至少为21％体积；

-它由氙和氧或氙、氮和氧组成；

-所述人类大于30岁，优选至少40岁，特别是至少50岁；

-氙的比例至少为20％体积；

-氙的比例至少为75％体积，优选氙的比例至少为60％体积；

-通过吸入将氙施用于患者；

-被治疗或待治疗的人类、即患者是男性或女性；

-以有效量或比例使用、即施用氙；

-药物包含非麻醉量的氙，即亚麻醉量；

-将氙在被患者吸入之前或吸入时与氧混合，或氙为“随时可用的”作为与氧的预混合物的气体混合物形式且任选地包含另一种气体化合物，例如氮；

-药物由氧和氮形成的气体混合物组成；

-每日将所述气体施用于患者一次或多次；

-将所述气体施用于患者几分钟至几小时的吸入时间，典型地15分钟至6小时，优选少于4小时；

-氙和/或抗氧化剂的施用期限、剂量方案和频率取决于在考量下患者神经学病情的进展，且这些参数优先由临床医师或护理人员设定，视考量下患者的神经学病情的不同而定；

-将氙(或包含氙的气体混合物)包装在贮气筒中，该贮气筒具有至多50升的体积(水当量)，典型地约0.5-15升；和/或小于或等于350巴绝对值的压力，典型地约2-300巴的压力。优选地，该贮气筒由不锈钢、铝或复合材料制成且安装有集成的阀门或调压器，从而能够控制所递送气体的流速和任选地控制所递送的气体的压力；

-在治疗过程中，通过经面罩或鼻罩或鼻护镜(nasal goggles)经任意其它用于施用可吸入气体的系统吸入将氙(或包含氙的气体混合物)施用于患者。

更具体地，在本发明的上下文中，已经证实，氙和抗氧化剂、特别是水溶性维生素E或维生素E的组合使得这些化合物产生协同作用，且这类组合可以构成用于因帕金森病类的神经变性疾病导致的神经退化的富有希望的治疗方法。

特别地，已经通过氙与水溶性维生素E或6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸组合得到了良好的结果，所述水溶性维生素E或6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸为可溶性维生素E类似物，其通过抑制氧化性应激且更具体地通过抑制脂质过氧化作用起作用。

实际上，通过制备这类组合，本发明的发明人已经证实了氙与水溶性维生素E类抗氧化剂的组合的协同作用，如下文详细描述和示例。

这类Xe/抗氧化剂组合特别地基于这些类型的化合物或分子的作用模式。

因此，氙通过其对NMDA受体的拮抗作用、还有对构成谷氨酸离子型受体的α-氨基-3-羟基-5-甲基异噁唑-4-丙酸酯(AMPA)受体以及对钾盐镁矾受体具有兴奋性谷氨酸能信号传导途径-抑制特性(Dinse等人，Br J Anaesth，2005)。

此外，正如所述的，水溶性维生素E通过抑制与脂质过氧化作用相关的氧化性应激起作用(Guerreiro等人，J Neurochem，2009)。

因此，通过制备氙和抗氧化剂、特别是水溶性维生素E或维生素E类型或其衍生物的组合，发明人已经证实了通过氙和水溶性维生素E、维生素E或其衍生物的胞内抗氧化剂作用阻断谷氨酸能受体导致的协同作用。换句话说，本发明的发明人已经注意到，氙能够通过协同作用展示出或强化抗氧化剂的有益作用。

根据另一个方面，本发明还涉及用于治疗、缓解或预防人体患者、即人类中的神经变性疾病后的至少一种神经退化的方法，其中：

i)鉴定患有神经变性疾病或倾向于患有这类神经变性疾病的人体患者；

ii)通过吸入将包含氙的气态药物施用于所述患者；和

iii)将液体或固体形式的、特别是水溶性维生素E、维生素E或其衍生物至少一种抗氧化剂施用于所述患者，以便得到神经元保护，且由此治疗、缓解或预防因所述患者的神经变性疾病导致的至少一种神经退化。

优选地，在步骤i)中：

-所述人体患者是男性或女性；

-所述人体患者超过30岁，优选至少40岁，特别是至少50岁；

-由临床医师等鉴定所述患者；

-通过技术筛选检查鉴定所述患者；

-所述神经变性疾病能够导致至少一种帕金森病类、优选帕金森病的神经退化；

-所述神经退化包含Ca²⁺离子过量进入患者的易损神经元的一个或多个群体。

优选地，在步骤ii)中：

-以液体形式施用所述抗氧化剂；

-经肠、即通过口服施用至少一种抗氧化剂；

-将水溶性维生素E(维生素E类似物)、维生素E或其衍生物作为抗氧化剂施用于所述患者；

-将液体形式的水溶性维生素E施用于所述患者；

-在患者吸入氙之前、同时或在患者吸入氙之后将至少一种抗氧化剂施用于所述患者。

优选地，在步骤iii)中：

-根据在考量下患者的神经学病情的进展选择和/或设定氙的施用期限、剂量方案和频率；

-施用有效量的氙；

-施用非麻醉量的氙；

-施用10％-80％体积的氙、优选20％-50％体积的氙；

-将氙在被患者吸入之前或吸入时与氧、优选与至少21％体积的氧混合；

-施用由氙和氧(二元混合物)或氙、氧和氮(三元混合物)组成的随时可用的气体混合物；

-每日将氙气体施用于患者一次或多次；

-将氙气体施用于患者几分钟至几小时的吸入时间，典型地15分钟至6小时，优选少于4小时；

-通过面罩或鼻罩或鼻护镜或经任意其它用于施用可吸入气体的系统或装置将氙气体施用于患者。

现在通过下列实施例和附图更清楚地理解本发明，给出的实施例作为示例，而非限定，所述附图显示氙和水溶性维生素E在模拟慢性帕金森病患者的细胞模型中的协同保护作用。

实施例

为了证实本发明氙和抗氧化剂组合的效能，设置多巴胺能神经元细胞模型，在该模型中，通过用L-反式-吡咯烷-2，4-二甲酸(PDC)延长处理阻断谷氨酸(GLU)再摄取系统触发神经元死亡，L-反式-吡咯烷-2，4-二甲酸(PDC)为合成化合物，其作用机制预先由Zuiderwijk等人(Europ J Pharmacol，1994)描述。

实施的技术如下所述且得到的结果示例在附图中。

用于得到中脑初级培养物的方案

由取自妊娠15.5天的妊娠雌性Wistar大鼠的大鼠胚胎中脑制备培养物。

用于得到中脑培养物的方法包含通过机械解离即非酶解离胚胎组织、使用Leibovitz L15培养基(Sigma Aldrich)得到均匀的细胞混悬液。

将该混悬液的等分部分加入到Nunc 48-孔板中，该板用聚乙烯亚胺(1mg/ml，硼酸盐缓冲液，pH 8.3)薄层预涂敷，以便能够粘附神经元细胞(参见Toulorge等人，Faseb J，2011)。

接种密度约为80 000-100 000细胞/cm²。

将中脑培养物维持在神经基础培养基中，其包含不含抗氧化剂的B27混合物、N2补充剂、谷氨酰胺(2mM)和青霉素/链霉素混合物(参见Nafia等人，J Neurochem，2008)。该培养基及其补充剂购自Life Technologies。

直到评价所关注的气体作用时，将培养物放入常规的在37℃下恒温控制的包封物，其中将CO₂维持在5％体积，且其中用水饱和气氛。

在培养期的至始至终不改变培养基。

培养物的药理学处理

通过应用谷氨酸再摄取系统阻滞剂L-反式-吡咯烷-2，4-二甲酸或PDC触发变性过程(Zuiderwijk等人，Europ J Pharmacol，1994)。

将抗氧化剂、即水溶性维生素E加入到培养物中，然后应用PDC。

这两种产品即PDC和水溶性维生素E分别购自RD Systems和Sigma Aldrich公司。

在受控气体气氛中培养物的维持

一旦进行药理学处理，则将包含培养物中的细胞的多孔板和用于加湿室内部隔室的板置于接收树脂玻璃温育室的金属基板上。两部分(基板和树脂玻璃室)通过旋紧彼此对接。

然后将包含测试的(％体积)：20％O₂、5％CO₂和75％气体的所关注的气体混合物注入带有开放的进阀和排出阀的温育室，同时通过流量计控制输出流速。

测试气体是氮和氙。

根据所用的混合物密度校正参比输出流速，将空气设定在10升/min。

当排出阀的CO₂测量值达到5％时，停止注射气体混合物，并且通过封闭进阀和排出阀完全气密所述的室。

然后在本实验方案的至始至终，在37℃下，将暴露室放入包封物。

酪氨酸羟化酶(TH)的免疫检测和细胞计数

在通过打开进阀和排出阀并且从它的底部打开室中断气密后，用4％甲醛的PBS溶液将培养物固定12min，且然后在4℃与抗-TH单克隆抗体(稀释度1/5000)一起温育2天。

使用IR DYE800抗-小鼠二次抗体(Euromedex，1/10 000inPBS)显示出该抗体。使用Odyssey型(Li-COR Biosciences)红外成像仪进行图像采集并且通过ICY软件(Institut Pasteur)进行神经元定量。

通过用PDC长期处理的中脑变性模型中得到的结果揭示出氙与水溶性维生素E之间的累加保护效应，将它们概括在下表中并且用图表示。

表：对中脑培养物的体外研究的主要结果的总结

在上表中：

-有利的响应，即与在所关注的处理的存在下神经元细胞死亡水平降低同义表示为“+”、“++”或“+++”符号(+++＝参比水平)；

-相反，不利的响应表示为“-”符号，与神经元死亡增加同义。

水溶性维生素E作为脂质过氧化抑制剂起作用且氙通过阻断NMDA受体起作用。

PDC(其部分)通过防止培养物中神经元细胞内源性产生和释放的谷氨酸再摄取诱导变性过程，由此导致神经元NMDA受体过度活化和刺激氧自由基种类胞内产生。

鉴于附图1中示例的结果，注意到氙和抗氧化剂、即在这种情况中是水溶性维生素E的组合与分别摄取每个分子的作用相比产生协同神经保护作用。

实际上，提出氙/水溶性维生素E组合的实际协同作用是完全预料不到的。

首先，这些试验显示PDC在100μM浓度下、在包含75vol％氮的气氛中导致多巴胺能神经元细胞大量缺失。然而，这些PDC的有害作用在用氙替代氮时得到部分预防，因为存活率随后从25.4％达到57.7％。

显著地，在以0.1-0.3μM、在包含75％氮的气氛中单独应用时在这种细胞模型中没有显著作用的水溶性维生素E在氙、即在这种情况中是75％的氙的存在下变成有效的，从而能够在这些条件下实现约90％的存活率。

当水溶性维生素E浓度≥1μM时还观察到氙的作用增强，这是当以75％的氮应用它们时发挥的保护作用。

有关附图中记录的结果示例氙和水溶性维生素E在模拟慢性帕金森病变性的细胞模型中的协同保护效应。这些结果在大鼠中脑培养物得到，所述大鼠中脑培养物在体外第12天结束时用谷氨酸再摄取抑制剂PDC(100μM)处理，并且在接下来的4天，用谷氨酸再摄取抑制剂PDC(100μM)在包含75％氮(N₂ 75)或75％氙(Xe 75)的气氛中、在0.1-10μM测试的水溶性维生素E的存在下或没有它存在下处理。

然后使培养物恢复用于固定和分析。在各种测试的实验条件下，通过计数用于多巴胺能标记TH免疫阳性的细胞体数量对神经元存活率进行定量。

将结果表示为维持在75％氮(对照条件)下未用PDC处理的培养物的平均值的％(±SEM)。

因此，在两组之间的单一比较的情况中通过斯氏t检验、或通过单向方差分析(ANOVA)、然后进行相对于参比组进行的多重比较的Dunnett检验(对于每个实验点，n＝9)进行统计学研究，其显示：

-在包含75％氙(与对照条件中75％的氮比较)的气氛中，观察到使用PDC处理的多巴胺能神经元的存活率增加，无论水溶性维生素E是否存在于培养基中(#p＜0.05，与相应的在75％氮气氛中的暴露于PDC的、在水溶性维生素E的存在下或没有其存在下的培养物相比)；

-在包含75％的氮的气氛中，水溶性维生素E产生从1μM开始的并且在包含75％氙的气氛中从0.1μM开始的显著的保护效应(＊p＜0.05，与仅暴露于100μM的PDC的在相同气态气氛中相比)。

因此，氙在与抗氧化剂、特别是水溶性维生素E类或维生素E或其衍生物组合时，在治疗、缓解或预防帕金森类、特别是帕金森病的神经变性疾病后的神经退化方面产生协同作用。