miRNA-543-3p在帕金森病的诊断和治疗中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及miRNA-543-3p在帕金森病的诊断和治疗中的应用。
【背景技术】
[0002] 帕金森病(PD)是一种常见的神经变性疾病，患者会出现静止性震颤、肌强直、运动 迟缓、姿势步态异常，许多患者还伴有嗅觉丧失、抑郁以及痴呆等症状，病情呈进行性加重， 晚期往往全身僵硬，生活不能自理，是中老年人常见的致残疾病之一，严重影响患者的生活 质量，给社会和家庭带来沉重的负担。帕金森病的主要病理变化表现为中脑黑质多巴胺能 神经元进行性变性和死亡;残存神经元内出现嗜酸性蛋白包涵体(Lewy body，LB)，纹状体 内多巴胺显著减少。尽管ro的病因仍不甚明确，人们通过对各种动物与细胞模型的研究发 现，谷氨酸兴奋性毒性、神经炎性反应、神经再生抑制、氧化应激、线粒体功能障碍、凋亡等 参与了黑质多巴胺能神经元死亡的病理过程。在众多PD病因学说中，兴奋性氨基酸毒性学 说是国内外研究的热点，而谷氨酸转运体是这一学说的关键环节。兴奋性氨基酸(尤其是谷 氨酸)与ro发生、发展的相关性研究，已经成为国际学术界的一个前沿课题。研究表明，谷氨 酸通过其受体介导的兴奋性毒性在ro的发生和发展过程中发挥了重要作用 [1]。
[0003] 谷氨酸（glutamate，Glu)是中枢神经系统兴奋性突触传递的主要神经递质。神经 末梢释放的谷氨酸主要由神经元细胞和神经胶质细胞上的谷氨酸转运体（glutamate transporter)回收入细胞膜内，以终止谷氨酸能神经传递，并使胞外谷氨酸浓度保持在较 低水平，以免神经元遭受高浓度谷氨酸的兴奋性毒性效应。谷氨酸的分布具有区域依赖性， 大部分位于细胞内，极少部分位于胞外，跨膜浓度梯度大约是几千倍。由于胞外没有谷氨酸 代谢酶，快速移走胞外谷氨酸的唯一方法是谷氨酸转运体摄取。在生理条件下，位于神经元 和神经胶质细胞上的谷氨酸转运体迅速摄取谷氨酸，有效地抑制了细胞外谷氨酸的堆积。 病理情况下，谷氨酸转运体对谷氨酸的摄取能力降低，甚至出现向细胞外的逆转运，导致细 胞外谷氨酸浓度上升，兴奋谷氨酸受体，导致黑质多巴胺能神经元变性或坏死。真核生物高 亲和力谷氨酸转运体（excitatory amino acid transporter,ΕΑΑΤ)分为GLAST(EAATl) GLT-1(EAAT2)、EAAC1(EAAT3)、EAAT4和EAAT5等5个亚型。五个亚型之间氨基酸序列的同源 性约为50%Χ?Τ-1和GLAST主要表达于脑内的胶质细胞，GLT-1主要表达于前脑、海马、大脑 皮层和纹状体等部位，GLAST在小脑的Bergmann胶质细胞表达较高，在脊髓和前脑也有少量 表达。GLT1和GLAST不仅可单独表达在不同神经胶质细胞，亦可同时表达于同一细胞的不同 部位。清除聚积的谷氨酸，防止兴奋毒性主要由GLT-1和GLAST完成。星形胶质细胞通过其谷 氨酸转运体可以清除细胞间隙80%以上的谷氨酸，从而保护神经元免受谷氨酸兴奋性毒性 损伤。EAAC1主要表达于突触后神经元，特别是树突干和树突棘部位。EAAT4局限在小脑浦肯 野细胞。EAAT5则局限于视网膜，表达于光感受器、双极细胞、无长突细胞和胶质细胞。
[0004] EAATs功能的异常和谷氨酸摄取的下降与帕金森病的发病密切相关，Ferrarese 等[2]研究了34名ro患者和21名正常人的血小板谷氨酸摄取功能，发现与对照组相比，原发 性PD患者谷氨酸摄取量减少了50%，且摄取减少量与PD的严重程度有关。在6-羟基多巴胺 (6_hydroxydopamine，6-〇HDA)和 1-甲基-4-苯基-1，2,3,6_ 四氢 P比啶（l-methyl-4-phenyl-l，2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)及其离子MPP+制造的Η)鼠模型中，发现GLT-1、EAAC1 表达的减少和谷氨酸摄取的下降[3_5]。这些研究提示，在Η)的发病过程中，随着EAATs表达的 下降，其摄取谷氨酸的能力降低，导致了细胞外谷氨酸水平的升高，胞外的谷氨酸持续作用 于代谢性谷氨酸受体，激活多巴胺能神经元胞内第二信使三磷酸肌醇（inositol triphosphate, IP3)与环腺苷二磷酸核糖，通过各自信号调控途径诱导胞内Ca2+浓度升高， 引起对Ca2+敏感的K+通道开放，多巴胺能神经元胞膜超极化导致细胞死亡，同时导致能量消 耗增多、自由基形成，最终引发兴奋性神经毒性效应 [6]。
[0005]谷氨酸转运体在蛋白质水平的变化固然对其功能的正常发挥具有重要作用。然 而，信使RNA(mRNA)翻译生成谷氨酸转运体蛋白质阶段的调控对谷氨酸转运体的表达以及 功能的发挥也至关重要，microRNA(miRNA)是其中一个非常重要的调控因素。MicroRNA是一 类内源性的大小在20-25nt的非编码RNAs，主要通过与靶基因的3'端非翻译区（3' untranslated regions，3 ' UTR)完全互补或不完全匹配结合，降解革EmRNA或抑制革EmRNA的 翻译，发挥调控作用。MicroRNA表达具有高度保守性、时序性和组织特异性。目前已经发现 人类的microRNA超过1400个，它们在生物体内既是代谢产物，也是机体的重要调控分子。一 种microRNA可以定位于多个mRNA，并参与生物体的生长、发育、衰老、死亡的调控等生物学 过程，人类有接近1/3的基因受到microRNA的调控。目前，发现很多microRNA与神经退行性 疾病相关，其中陆续发现了一些参与帕金森病发病过程的microRNA。体内或体外细胞培养 敲除miR-133b，可使酪氨酸羟化酶和多巴胺转运蛋白水平明显下降，该研究首次发现单个 特异的microRNA对多巴胺生成的调节作用 [7] Jang等在研究成纤维细胞生长因子20 (fibroblast growth factor 20，FGF20)与]^的关系中发现，FGF20可以被microRNA-433调 节，在患者中microRNA-433表达降低，FGF20表达升高，而FGF20可以促进致病中最关键 的蛋白α-Synuclein表达升高 [8]。最近有报道以α-突触核蛋白（a-Synuclein)mRNA作为革巴基 因的miR-7与miR-153，二者都可以抑制α-突触核蛋白的表达，miR-7参与调节氧化应激介导 的细胞死亡 [9'1Q]<aet-7与miR184以转录因子E2F1及DP作为靶基因，参与调节多巴胺能神经 元的生存与活性 [11]。从组织库中将帕金森病病人与对照组脑组织内microRNAs表达谱进行 对比，可以为microRNAs在帕金森病发展过程中的作用提供一些线索。对帕金森病病人脑组 织内microRNAs表达谱研究发现miR-34b及miR-34c在受损脑组织表达量显著降低，杏仁核、 黑质、额皮质的表达量比对照组降低40-65%，小脑含量同样降低，但幅度较小；用维甲酸和 12-〇_ 十四烧酰佛波醇-13_ 醋酸酯（12-〇-tetradecanoy 1-phorbo 1-13-acetate)刺激成神 经瘤细胞SH-SY5Y后，miR-34b及miR-34c表达量增加二倍;相反如果敲除miR-34b/miR-34c， 细胞则因线粒体功能受损及氧化应激效应导致死亡;鉴定miR_34b及miR-34c的靶基因有助 于发现其调节神经元存活的机制 [12]。研究发现micr〇RNA-124a在终末期肌萎缩侧索硬化症 (amyotrophic lateral sclerosis，ALS)小鼠模型的脊髓组织中下调，通过外源性注射 microRNA-124a能够抑制ALS中GLT-1的下调[13]。该项研究提示microRNA-124a将有可能成 为治疗诸如ALS等神经变性疾病的一个新的靶标。新近的研究也表明，间充质干细胞能够释 放外源性的microRNA-124,进而促进神经前体细胞和星形胶质细胞上GLT-1的表达 [14]。最 近有研究表明，在缺血性中风模型的脑组织和血液中存在高水平的miR-107,高表达的miR-107可以通过抑制GLT-1的表达，进而加速谷氨酸的兴奋性毒性对机体的损害。并且在缺血 性中风患者的血液中也发现了高水平的miR-107和谷氨酸，提示miR-107有可能会成为检测 缺血性中风患者体内兴奋性谷氨酸毒性损伤程度的一个生物指标[15]。由此可见， microRNAs对于谷氨酸转运体表达的调控在神经变性疾病中发挥重要的作用。但是对于帕 金森病中那些针对谷氨酸转运体发挥调控作用的microRNAs目前尚未见报道，值得我们进 一步进行探索。
[0006] 上述涉及到的参考文献的具体信息为：
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