专利名称：：使用融合多肽的共翻译转运的噬菌体展示的制作方法使用融合多肽的共翻译转运的噬菌体展示发明领域本发明涉及一种新噬菌体展示方法、本文使用的噬菌体或噬菌粒载体以及如此获得的噬菌体颗粒。发明背景多肽在噬菌体上的展示(噬菌体展示)是一种允许由一大群变体提取具有期望特性的多肽的选4奪技术(Russel，M.,Lowman,H.B.,和Clackson,T.，Introductiontophagebiologyandphagedisplay,载于"PhageDisplay",Clackson,T.和Lowman,H.B.编辑，OxfordUniversityPress，2004,1-26页)。已广泛研究了用于由组合抗体或肽文库选择的噬菌体展示。迄今为止，用于噬菌体展示的最广泛使用的噬菌体是丝状噬菌体。丝状噬菌体构成了一个感染许多革兰氏阴性细菌的大细菌病毒家族。最有名的丝状噬菌体是感染大肠杆菌的丝状噬菌体；这些丝状噬菌体是fl/M13/fd和Ike。嗟菌体fl、和fd是迄今已用于丝状噬菌体展示的丝状噬菌体。它们的基因组超过98%相同，它们的基因产物可互换。与许多其它噬菌体的组装相比，丝状噬菌体组装的独特方面在于其是一个分泌过程。壳体多肽向生长的噬菌体中的掺入发生在胞质膜中，新生噬菌体在它们組装时由细胞中被排出来(Russd等，在上述引文中)。大肠杆菌细胞在此过程中不裂解。5种病毒壳体蛋白(pIII、pVI、pVII、pVIII和pIX)在其掺入到噬菌体颗粒之前被插入到胞质膜中(图i)。例如，pin的大部分被转运穿过膜进入周质，而其C-末端疏水尾将该蛋白锚定在膜中。丝状噬菌体展示的一个先决条件是转运目标多肽(POI)穿过胞质膜。这一般通过将POI基因融合至噬菌体壳体蛋白并转运对应的融合多肽实现。或者，独立地转运POI和噬菌体壳体蛋白。在此情况下，POI通过例如形成二硫键(Cys-展示)或与对应的噬菌体壳体蛋白形成亮氨酸拉链(pJuFo系统)稳定连接至周质中的噬菌体颗粒。在使用与pIII融合的常规丝状虔菌体展示中，Sec途径用于转运含POI的融合多肽。在该途径中，多肽首先在核糖体处合成，然后以其未折叠态通过Sec转运翻译后转运(图2,(3)-(4)-(5》。也就是说，转运穿过胞质膜只有在已合成显著量的多肽链后才开始。但是，仍未完全阐明转运机制对成功的噬菌体展示的影响，现有技术没有研究使用共翻译转运途径的可能性。业已将各种各样大小和结构的胞内和胞外蛋白功能性地展示在丝状噬菌体上(Russel等，在上述引文中)。然而，某些多肽由于个体特性而抗拒展示，大部分是由于未知的原因。这使得某些蛋白的成功展示变得不可预知。因此，通常推荐首先检验每种要使用蛋白在丝状噬菌体上的展示效率。另外，在建立用于噬菌体展示的组合文库时，不是所有克隆都以相似效率展示；对由cDNA产生的文库来说尤其如此。多肽的展示问题可能是其对噬菌体生产的干扰、其周质聚集、其蛋白分解、其对大肠杆菌的毒性或其与所用转运途径的不相容性的结果。转运前的步骤尤其是影响融合多肽掺入噬菌体颗粒中的一个重要因素。如果多肽过早折叠，则它们可能难以转运乃至表现出胞质毒性。因此，重要之处在于蛋白是翻译后(潜在地允许过早折叠)转运还是共翻译(不允许胞质折叠)转运。当前的丝状噬菌体展示方法使用翻译后途径转运融合多肽穿过胞质膜(Russel等，在上述引文中；Paschke,M.和H池ne,W.,Gene350,79-88,2005)。因此，与这些途径不相容的多肽将难以展示，使噬菌体展示选择非常低效乃至不可能。例如，几乎专用于噬菌体展示的翻译后Sec途径固有地不能转运不能以未折叠态保持在胞质中的蛋白，因为Sec转运自身只能转运未折叠多肽(Huber，D.,Boyd,D.,Xia,Y.,Olma,M.H.,Gerstein,M.，和Beckwith,J.，J.Bacteriol.187，2983-2991,2005;Paschke等，在上述引文中)。因此，构成本发明基础的技术问题是鉴别新转运方法，其通过使用翻译后转运将展示效率低的多肽有效展示在丝状噬菌体上。该技术问题的解决通过提供以权利要求为特征的实施方案来实现。发明概述本发明涉及一种丝状噬菌休展示方法，其中展示在噬菌体颗粒上的目标多肽(POI)被共翻译转运穿过革兰氏阴性细菌的胞质膜，具体地说是基于信号识别颗粒途径。因此，本发明允许通过共翻译转运含POI的融合多肽进行噬菌体展示。该方法特别适用于已知难以展示在噬菌体上的多肽，以及cDNA文库和其它组合文库的蛋白，尤其是这些蛋白来源于非常快速折叠、稳定的蛋白支架时。本发明还涉及含编码融合多肽的基因构建物的噬菌体或噬菌粒载体，以及通过本发明方法获得的噬菌体，所述融合多肽含要展示在噬菌体颗粒上的POI和基于信号识别颗粒途径促进共翻译转运的N-末端信号序列。附图简述图1.尽标/應的應插入和#^N-末端(N)、C-末端(C)、目标多肽(POI);pill的N-末端结构域(Nl,N2)、pill的C-末端结构域(CT)。A)目标多肽(POI)在丝状噬菌体颗粒上的展示总是包括转运POI穿过胞质膜(cm)进入周质(pp)中。更经常地，POI作为包含壳体蛋白m(pIII)或其片段的融合多肽被转运。pill包含两个N-末端结构域(Nl,N2)和C-末端结构域(CT)。在此具体实例中，融合多肽由N-末端POI和C-末端CT组成。融合多肽和pill在转运后和它们掺入到噬菌体颗粒中之前通过在CT部分的C-末端疏水序列段锚定至胞质膜。胞质(cp)，外膜(om)、胞外间隙(ex)。B)展示pill和A)的融合多肽的丝状噬菌体颗粒的简化示意图。pill的N-末端结构域(Nl,N2)和POI经CT部分掺入到噬菌体颗粒中。激么#运-农,^#^《历#勿^的/^#^€。已知转运多肽穿过革兰氏阴性细菌胞质膜(cm)进入周质(pp)中的3种主要途径的简化示意图。这些途径是SRP途径、Sec途径和Tat途径。Sec和SRP途径都依靠Sec转位子(SecTR),而Tat途径依靠Tat转位子(TatTR)。Sec和Tat途径均翻译后转运多肽，而SRP途径共翻译转运多肽。Sec和SRP途径会聚于转运未折叠(uf)态蛋白通过膜的Sec转位酶。相比之下，Tat转位子仅转运已折叠(f)蛋白。信号序列(ss)的氨基酸组成强烈支持将前体蛋白靶向这些途径之一。在转运后，利用肽酶由前体蛋白切下信号序列。SRP途径由信号识别颗粒(SRP)介导，SRP是一种由54-kDa蛋白同系物和4.5SRNA組成的核糖核酸蛋白。在该途径中，是SRP将前体蛋白靶向Sec转位子。SRP识别并结合由核糖体(R)形成的对应信号序列，传递核糖体-新生链复合物至SRP-受体(SR),随后通过Sec转位子共翻译转运前体蛋白。由于其过早的胞质折叠而与Sec途径不相容的多肽因此可在被翻译的同时通过SRP途径被有效转运。(1)SRP结合由核糖体形成的新生蛋白的特定疏水信号序列。(2)SRP经SRP-受体将核糖体新生链复合物导向Sec转位子，在那里发生共翻译转运。大部分前体蛋白具有较少的疏水信号序列，经历SecB依赖性输出。(3)触发因子(TF)是一种对新生多肽具有一般亲和性的胞质分子伴侣，结合新生前体蛋白的成熟区，保持有效结合，直至翻译几乎完成。(4)在TF解离后，诸如SecB的胞质因子有助于以伸展的未折叠构型保持前体蛋白。(5)保持伸展构型的前体蛋白通过Sec转位子被有效转运。(6)但是，如果前体蛋白的折叠发生在胞质中，则蛋白通常降解(IO)，或者甚至可能堵住Sec转位子。具有含双精氨酸基序的信号序列的前体蛋白注定要Tat转运子。("与分子伴侣(TC)如DnaK或另一种Tat-特异性因子结合可能屏蔽信号序列，直至折叠完成(8)。此相同因子或其余因子还可能促进正确的折叠。只有前体蛋白被正确折叠，Tat转运才继续进行；要不然，细胞的蛋白水解机器(9,IO)使前体蛋白降解。图3.p腺噬齊;粒裁沐,秀/(/的^,#激。A)pDST噬菌粒载体系列的表达盒的放大图。表达盒包含大肠杆菌/acZ基因的启动子/操作子元件(/acZp/Q)、核糖体结合位点(未图示)、信号序列(ss)和要展示的目标多肽(POI)的编码序列、阻抑子终止密码子(TAG)、柔性甘氨酸/丝氨酸接头(G/S)和丝状噬菌体蛋白III(CTpIII)的C-末端结构域(氨基酸250-406)(介导融合多肽掺入到噬菌体颗粒中)的编码序列、两个终止密码子(TGATAA,未图示)和转录终止子元件(未图示)。POI的编码序列侧接编码Flag-标签(Flag)和c-myc-标签(c-myc)的DNA序列。显示了DsbA信号序列(DsbAss)的单字母氨基酸序列作为靶向SRP途径的信号序列的代表，以及PhoA信号序列(PhoAss)的单字母氨基酸序列作为靶向Sec途径的信号序列的代表。这些信号序列包含带正电荷的N-末端区(n-区)、非极性疏水核(h-区)和更高极性的C-末端区(c-区)。B)噬菌粒pDST23的示意图。除了A)中所示元件以外，还图示了丝状噬菌体复制起点(Ffori)、大肠杆菌lac阻抑子基因(/ac/)(其产生紧密控制/"cZp/o所需的/"c阻抑子)、用于载体的细菌复制的Coffil复制起点(ColElori)、编码氯霉素-乙酰基转移酶介导的氯霉素抗性的抗生素抗性基因(cO和限制性位点H"謹//1、尸M和五coM。pDST23中编码的POI是设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)h。图4.W^7蛋^l伊遂为、浙旅覆^卓fD^/a;;!7eW,,么衮A)和B)通过使用各自噬菌粒生产的CsCl-纯化的噬菌体颗粒通过SDS-PAGE分离，印迹到PVDF膜上，并用对蛋白III的C-末端结构域特异性的抗体(抗-pin)或对Flag-标签特异性的抗体(抗-FlagMl)检测。每个泳道施加的等份样品已被标准化，相当于5xl0"个噬菌体颗粒。分析各种多肽在噬菌体颗粒上的展示率。多肽的缩写名标示在泳道顶部，指的是列于表1的多肽。另外，表1指出了用于生产噬菌体颗粒的对应噬菌粒，表达盒的略图在图3A中给出。使用分别通过Sec途径或SRP途径转运对应融合多肽的PhoA信号序列(标记"p"的泳道)或DsbA信号序列(标记"d"的泳道)，比较每种多肽的展示率。较强条带表示较高展示率。以kDa表示的标记蛋白分子量标示在印迹两侧。在抗-pIII印迹中于62kDa处的条带对应于pIII野生型蛋白。图5.^/^EZi&4为、浙的属示率比衮展示称为2一3(空心符号)的cJunN-末端激酶2(JNK2)-结合性DARPin或称为3a(实心符号)的氨基糖苷激酶APH(3')-IIIa(APH)-结合性DARPm的噬菌体颗粒分别在含固定化生物素化JNK2或APH蛋白的中性抗生物素蛋白包被且BSA-封闭的孔中温育。在漂洗后，用偶联辣根过氧化物酶的抗-M13抗体检测结合的噬菌体颗粒，并用可溶性BMBluePOD底物显现。图示数据表示y-坐标上在扣除392nm检测的背景之后于360nm检测的吸光度(Abs)对x-轴上每孔施加的噬菌体颗粒(pp)数。使用编码DsbA信号序列的噬菌粒变体生产的噬菌体颗粒(三角符号)已在约8><108个噬菌体/孔显示出半最大信号，而由编码PhoA信号序列的变体生产的噬菌体颗粒(方块符号)仅在约2xl0"个噬菌体/孔显示出半最大信号，表明展示率下降IOO倍以上。因此，与使用PhoA信号序列介导的Sec途径相比，使用DsbA信号序列介导的SRP途径转运融合多肽强烈增加展示率。图6.^/^五UX4》浙定:f^^举如对图5所述分析展示DARPin2一3或3a的噬菌体颗粒。结果以柱形图给出(对数标度)，PhoAss展示率设为1。使用的每种信号序列的展示水平(增加倍数)对应于产生OD45。=0.5的信号的噬菌体颗粒数相比于产生OD45045Q=0.5的信号的含PhoAss噬菌体颗粒数。Pe旧ss:胡萝卜软腐欧文氏菌(五rvW"/"c"ratowra)PelB的信号序歹'J(推定的Sec-依赖性信号序列)。除了DsbAss以外，还检验了大肠杆菌蛋白TorT(TorTss)、TolB(To旧ss)和SfinC(SfmCss)的SRP-依赖性信号序列。与Sec依赖性PhoAss相比，用SRP-依赖性TorTss观察到达700倍的展示率增加。SRP-依赖性To旧ss和SfmCss得到达300倍的展示率增加。推定的Sec-依赖性Pe旧ss仅显示出2-6倍的展示率增力口。发明详述在本发明范围内，术语"丝状噬菌体展示，，指基于丝状噬菌体的噬菌体展示。丝状噬菌体构成了一个感染众多革兰氏阴性细菌的大细菌病毒家族。优选的丝状噬菌体是感染大肠杆菌的丝状噬菌体；具体地说为fl/M13/fd和Ike。实施丝状噬菌体展示的方法是本领域技术人员周知的(例如Russel等，在上述引文中)。在本发明范围内，术语"信号序列"指导致多肽靶向转位酶的多肽N-末端氨基酸序列段。在大肠杆菌中，N-末端信号序列一般含15-52个氨基酸。大部分信号序列含带正电荷的N-末端区(n-区)、非极性疏水核(h-区)和更高极性的C-末端区(c-区)。c-区包含信号肽酶的切割位点。信号肽酶是在转运反应过程中由多肽中去除信号序列的膜结合蛋白酶。优选包含18-30个氨基酸的这类信号序列。信号序列的确定是本领域技术人员周知的。例如，它们可由诸如Swiss-Prot或GenBank的数据库获得，或使用自动化基因组范围数据集获得。在本发明范围内，术语"前体蛋白"指含N-末端信号序列的多肽。信号序列在转运反应过程中被由前体蛋白上切下，由此得到成熟蛋白。在本发明范围内，术语"融合多肽"指允许在丝状噬菌体上展示的含N-末端信号序列、目标多肽(POI)和附加氨基酸序列的多肽。优选地，此附加序列包含丝状噬菌体壳体多肽或其片段。或者，此序列通过形成稳定键，例如通过形成二硫键(Cys-展示)，或通过与对应噬菌体壳体蛋白形成亮氨酸拉链(pJuFo系统)，将POI连接至周质中的噬菌体颗粒。在此备选策略中，POI和对应的噬菌体壳体蛋白独立地被转运穿过胞质膜。在本发明范围内，术语"转运"指由转位子介导的穿过生物膜的多肽转运(Holland,I.B.等，Biochim.Biophys.Acta1694,5-16,2004)。转运在翻译后或共翻译发生。因此，转位酶是通过转位子特异性转运多肽的酶或酶复合物(Holland等，在上述引文中)。在本发明范围内，术语"Sec途径"指通过Sec转位子翻译后转运前体蛋白穿过革兰氏阴性细菌胞质膜的蛋白转运机制(Holland等，在上述引文中)。Sec途径由在转运前将前体蛋白保持于未折叠态的分子伴侣介导，所述分子伴侣最经常是SecB。Sec途径是革兰氏阴性细菌中的主要蛋白转运途径。在本发明范围内，术语"SRP途径"指通过Sec转位子共翻译转运前体蛋白穿过革兰氏阴性细菌胞质膜的蛋白转运机制(Schierle,C.F.,Berkmen,M.，Huber,D.，Kumamoto,C.,Boyd,D.，和Beckwith,丄，丄Bacteriol.185,5706-5713,2003;Huber等,在上述引文中)。SRP途径由信号识别颗粒(SRP)介导，SRP是一种由54-kDa蛋白同系物(54同系物；Ffh)和4.5SRNA组成的核糖核酸蛋白。在SRP途径中，SRP一由核糖体出现，信号序列就与SRP相互作用。然后，由SRP、新生多肽和核糖体组成的复合物经SRP-受体被转移至Sec转位子，在那里多肽通过Sec转位子被共翻译转运。Sec和SRP途径会聚于转运未折叠态蛋白通过膜的Sec转位酶。是信号序列的氨基酸组成强烈支持将前体蛋白靶向SRP途径，优先于用于其转运的Sec途径(Huber等，在上述引文中)。在本发明范围内，术语"DsbA"指周质大肠杆菌巯基:二硫键互换蛋白DsbA(Swiss-Prot登录号P24991)。DsbA是SRP途径的底物(Huber等，在上述引文中)。DsbA被共翻译输出，以避免其在胞质中折叠，胞质中折叠会抑制其输出。在本发明范围内，术语"TrxA"指大肠杆菌蛋白硫氧还蛋白1(Swiss-Prot登录号P00274)。TrxA可用作报告蛋白，以区分将前体蛋白靶向SRP途径或Sec途径的信号序列(Schierle等，在上述引文中；Huber等,在上述引文中)。在本发明范围内，术语"Tat途径'，指双精氨酸蛋白转运(Tat)途径(Paschke等，在上述引文中)。Tat途径与Sec途径和SRP途径完全不同。与Sec转位子相比，Tat转位子仅输出完全折叠的蛋白。与SRP途径相比，Tat转位子使蛋白翻译后穿过膜。在一个具体实施方案中，包含要展示在噬菌体颗粒上的POI的融合多肽其信号序列是促进共翻译转运的信号序列。检验目标信号序列是否促进共翻译转运穿过革兰氏阴性细菌胞质膜的方法是本领域技术人员周知的。例如，目标信号序列经基因工程融合至成熟MalE(Swiss-Prot登录号P02928,残基27-396)。然后，此人工前体蛋白在大肠杆菌中表达，其新生链的共翻译蛋白水解加工的产率通过如已描述的双向凝胶电泳分析(Josefsson,L,G.和Randall,L丄.，MethodsEnzymol.97,77-85,1983;Schierle等，在上述引文中)。在前体蛋白链仍为新生态的同时去除目标N-末端信号序列表明，转运在多肽合成完成前开始，因此转运是共翻译的。优选的信号序列是在融合至成熟MalE时促进共翻译转运率超过80%、更优选超过90%的信号序列。最优选的信号序列是在融合至成熟MalE时确实仅促进共翻译转运而不促进翻译后转运的信号序列。或者，可使用已知促进共翻译转运的信号序列，例如来自DsbA的信号序列。在另一个具体实施方案中，含要展示在噬菌体颗粒上的POI的融合多肽其信号序列是靶向信号识别途径的信号序列。革兰氏阴性细菌的信号识别途径和检验目标信号序列是否将前体蛋白靶向SRP途径的方法是本领域技术人员周知的。例如，融合至SRP途径靶向信号序列的TrxA的转运在携带基因，突变的大肠杆菌(例如,77或,87突变林)中被强烈抑制，基因,编码SRP组分(Schierle等，在上述引文中；Huber等，在上述引文中)。因此，靶向SRP途径的信号序列在野生型大肠杆菌中促进TrxA转运穿过胞质膜，但在突变抹中非常低效。信号序列因此可被分类为2个不同类别把向SRP途径的信号序列和不靶向SRP途径的信号序列。可通过增加信号序列的整体疏水性，具体地说是通过增加其h-区的疏水性，将靶向Sec途径的信号序列再导向SRP途径。例如，仅仅通过用大疏水残基替换h-区中的极性或小(Gly或Ala)氨基酸增加其疏水性的适度MalE信号序列改变将所述蛋白由Sec途径改变至SRP途径。或者，可使用已知靶向SRP途径的信号序列，例如来自DsbA的信号序列。使用SRP途径的信号序列的其它实例是一部分自体转运蛋白的信号序列，例如血红蛋白蛋白酶(Hbp,UniProtKB登录号088093)的信号序列。不寻常地是，Hbp信号序列相对较长(52个氨基酸)，并包含位于经典信号之前的N-末端延伸。另外，Hbp信号序列的h-区不是特别疏水的。SecM(Swiss-Prot登录号PW3^)的信号序列是长信号序列另一个实例，其含N-末端延伸和已知靶向SRP途径的中等疏水h-区。在又一个实施方案中，含要展示在噬菌体颗粒上的POI的融合多肽其信号序列是促进TrxA转运穿过革兰氏阴性细菌胞质膜的信号序列。许多常用的信号序列，例如PhoA(Swiss-Prot登录号P00634)和MalE(Swiss-Prot登录号P02928)的信号序列，的确只是低效促进TrxA转运穿过胞质膜(Schierle等，在上述引文中)。相反地，DsbA的信号序列促进有效的TrxA转运。表达融合至目标信号序列的TrxA的宿主细胞的亚细胞分级分离允许区分能够促进TrxA转运穿过胞质膜进入周质中的信号序列和不能如此的信号序列(Huber等，在上述引文中)。周质级分中的TrxA量描述了信号序列促进TrxA转运的效率。或者，可使用已知促进TrxA转运的信号序列，例如来自DsbA的信号序列。在一个优选实施方案中，含要展示在噬菌体颗粒上的POI的融合多肽其信号序列是选自TorT、SfmC、FocC、CcmH、Yml、To旧、NikA、FlgI和DsbA的信号序列及其同系物。在一个特别优选的实施方案中，含要展示在噬菌体颗粒上的POI的融合多肽其信号序列是选自TorT、SfmC、TolB和DsbA的信号序列。在本发明范围内，术语信号序列的"同系物"指与上文提及的任何信号序列具有70%、优选80%、具体地说90%或以上的氨基酸同一性的氨基酸序列，其同时分别保留信号序列的n-区、h-区和c-区的总电荷、疏水性和切割特性。这种同系物的实例是以下氨基酸序列，其中1、2、3或4个(具有地说是1或2个)氨基酸被其它氨基酸替换，其中1、2、3或4个氨基酸缺失，或者添加1或2个氨基酸，或者如前文所述的置换、缺失和添加的组合。在氨基酸置换中，非极性氨基酸优选被其它非极性氨基酸置换，例如Ue被Leu、Val、Ala、Trp、Phe或Met置换或反之，极性氨基酸被其它极性氨基酸置换，例如Thr被Ser、Asn或Gln置换或反之，负电荷氨基酸被其它负电荷氨基酸置换，例如Asp被Glu置换或反之，或者正电荷氨基酸被其它正电荷氨基酸置换，例如Lys被Arg或His置换或反之。例如，对于具有氨基酸序列MKKIWLALAGLVLAFSASA(SEQIDNO:l)的优选DsbA信号序列，有可能存在氨基酸Lys2被Arg置换，Ala9被Leu置换，Alal4被Val置换，以及Serl6被Thr置换。已知TorT、SfmC、FocC、CcmH、Yral、To旧、NikA、Flgl和DsbA的信号序列通过靶向SRP途径促进TrxA的共翻译转运，并在大多数情况下与靶向Sec途径的信号序列相比具有较高的整体疏水性(Huber等，在上述引文中)。所述蛋白具有以下Swiss-Prot登录号TorTP38683、SfmCP77249、FocCP62609、CcmHP33925、YralP42914、TolBP0A855、NikAP33590、FlglP0A6S3和DsbAP24991。单独的疏水性计算不允许在高疏水性范围内区分SRP依赖性和非SRP依赖性信号序列(Huber等，在上述引文中)。因此，非疏水性的特征(例如信号肽的结构)影响对一种转运途径的偏向性。在一个特别优选的实施方案中，信号序列是DsbA信号序列或与DsbA信号序列具有90%同一性的任意氨基酸序列。所述方法适用于任意丝状噬菌体展示方法，例如采用噬菌体fl、M13、fd和Ike的丝状噬菌体展示方法，尤其是fl、M13和fd。具体地说，本发明方法包括以下步骤(a)构建含融合多肽表达盒的丝状噬菌体或噬菌粒栽体，所述融合多肽具有促进融合蛋白共翻译转运穿过革兰氏阴性细菌胞质膜的N-末端信号序列；(b)通过将编码目标多肽的DNA文库克隆入步骤(a)载体的表达盒中，构建噬菌体或噬菌粒载体的组合文库；(c)用步骤(b)的载体的文库转化合适的革兰氏阴性细菌；和(d)进行多轮噬菌体展示选择，以基于所展示目标蛋白的特性分离噬菌体颗粒。在步骤(a)中，使用标准基因技术方法构建丝状噬菌体或噬菌粒载体。例如，使用标准DNA技术以所述信号序列的编码序列替换编码已有噬菌体或噬菌粒载体的部分融合多肽表达盒的信号序列。或者，使用有关这种载体组成的一般信息(例如Russel等，在上述引文中)和标准DNA合成和组装方法，从头构建含有含所述信号序列的融合多肽表达盒的新噬菌体或噬菌粒载体。用于该目标的噬菌体或噬菌粒载体为例如pAK100、pComb3、pEXmide3、pHENl、pJuFo或pSEX。这种噬菌粒载体的一个实例(pDST23)描述于图3和所附实施例中，作为本发明的说明，而不将本发明限于该具体实施方案。优选地，步骤(a)中的融合多肽的信号序列促进通过SRP途径的融合多肽转运。更优选地，步骤(a)中的融合多肽的信号序列促进TrxA的共翻译转运。在步骤(b)中，使用制备载体组合文库的标准方法。例如，通过随机或定点诱变、通过DNA改组、通过经由细胞mRNA扩增的cDNA制备或者通过共有序列设计，产生编码目标蛋白的组合DNA文库，在步骤(c)中，使用转化革兰氏阴性细菌的标准方法。例如，通是本领域技术人员周知的。在步骤(d)中，进行多轮标准噬菌体展示选择。这种多轮噬菌体展示选择是本领域技术人员周知的(例如Russel等，在上述引文中)。优选地，步骤(d)的所展示目标多肽的特性是与目标靶分子特异性结合。在此情况下，通过将各轮选择中的扩增噬菌体颗粒应用于功能性固定在表面上的靶分子，洗去未结合的噬菌体颗粒，洗脱结合的噬菌体颗粒，并使用洗脱的噬菌体颗粒作为下一轮选择的噬菌体颗粒扩增的供给，使展示结合靶分子的POI的噬菌体颗粒与展示不相关多肽的噬菌体颗粒分离。应理解，在本发明范围内无论何时提及"信号序列"，此表述还指"一个或多个，，(例如l、2、3或4个)不同组成的信号序列。使用一个以上的信号序列可能对具体应用有利，也属于本发明的范围。本发明还涉及含编码融合多肽的基因构建物的噬菌体或噬菌粒载体，所述融合多肽含融合至N-末端信号序列的POI,所述N-末端信号序列促进TrxA的共翻译转运，具体地说为选自TorT、SfmC、FocC、CcmH、Yral、To旧、NikA、Flgl和DsbA的信号序列及其同系物，优选为选自TorT、SfmC、To旧和DsbA的信号序列。最优选的是含信号序列DsbA或其同系物的噬菌体或噬菌粒载体。优选地，融合多肽含融合至噬菌体壳体蛋白pin或pvni或融合至壳体蛋白pill片段的POI。这种片段例如为含pill的氨基酸250-406的片段。周质酶DsbA的信号序列将融合的报告蛋白导向SRP途径，因此增强其共翻译输出。这表明相对疏水的DsbA信号肽与SRP相互作用，促进DsbA的共翻译转运。因此，DsbA的信号序列可用作其它蛋白的通用信号序列，如在以下实施例中所示。同样，可使用DsbA信号序列的同系物以及TorT、SfmC、FocC、CcmH、Yral、To旧、NikA和Flgl的信号序列及其同系物。本发明方法尤其适于采用化合物文库的应用，所述化合物文库例如为DNA文库，具体地说为cDNA文库，与迄今在噬菌体展示中使用的方法相比，本发明方法允许可靠地呈现通过表达这些文库获得的多肽。本发明的一个具体实施方案是其中由DNA文库编码的POI展示在嗟菌体颗粒上的所述丝状噬菌体展示法。优选地，基于信号识别颗粒途径，例如促进TrxA共翻译转运的信号序列，完成由DNA文库编码的POI的共翻译转运。最优选的是如本文所述用于重复蛋白的噬菌体展示的方法。如同任意选择技术一样，噬菌体展示选择的成功强烈依赖于所展示文库成员的多样性。大组合DNA文库自身不保证可展示大量不同的文库成员。在噬菌体展示中，要展示的多肽在其掺入噬菌体颗粒前必须被转运穿过胞质膜。现行的丝状噬菌体展示方法全部使用翻译后途径转运融合多肽穿过胞质膜(Russel等，在上述引文中；Paschke等，在上述引文中)。因此，与这些途径不相容的文库成员将难以展示，因此明显降低了所展示的文库多样性。考虑的DNA文库是所有可能的组合DNA文库，包括通过随机或定点诱变、通过DNA改组或通过共有序列设计产生的组合DNA文库。这些方法将产生具有新特性(例如结合特性)的文库成员；它们中的一些将与使用Sec途径的转运不相容。这些文库包括编码肽文库、抗体文库或基于替代支架的文库的DNA文库(Russel等，在上述引文中；Nygren,P.A.和Skerra，A.，丄Immunol.Methods,290,3-28,2004)。考虑的其它DNA文库是cDNA文库，尤其是真核生物源的cDNA文库。cDNA文库编码各种各样的天然细胞蛋白，包括胞质蛋白、膜蛋白和胞外蛋白。这些天然文库成员中的一些与使用Sec途径的转运不相容。考虑的其它DNA文库是编码单链Fv(scFv)抗体文库的DNA文库，单链Fv(scFv)抗体文库用于选4奪^^内活性scFv片段(内抗体)。内抗体的先决条件是它们完好折叠并在大肠杆菌胞质中稳定。因此，胞质稳定且完好折叠的内抗体非常低效地被通过Sec途径的翻译后机制转运。考虑的其它DNA文库是编码基于重复蛋白的替代支架文库的DNA文库，所述重复蛋白包括锚蛋白重复蛋白、亮氨酸富集重复蛋白、34肽重复蛋白(tetratdcopeptiderepeatprotein)、35肽重复蛋白(pentatricopeptiderepeatprotein)或armadillo/HEAT重复蛋白。一种优选的DNA文库是编码设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)的文库(Binz,H.K.,Amstutz,P.，Kohl,A.，Stumpp,M.T.,Briand,C.,Forrer,P.，Griitter,M.G.,和Pliickthun,A.,Nat.Biotechnol.,22，575-582,2004)。展示在噬菌体颗粒上的DARPins的实例示于实施例中。本发明还涉及通过本发明方法生产的噬菌体。本发明还涉及非常快速折叠且胞质稳定的蛋白的周质表达，具体地说是涉及DARPins的周质表达。实施例的编码DsbAss和DARPins的噬菌粒可直接用于DARPins在非抑制性大肠杆菌中的有效周质表达。或者，可通过以编码本发明信号序列的DNA(具体地说是编码DsbAss的DNA)替换编码用于周质表达的信号序列的DNA，修改标准周质表达栽体。例如，DARPins的有效周质表达有助于融合至非常难以在胞质中表达的效应子蛋白(具体地说是毒素或细胞因子)的DARPins的表达。本文以下例举的新噬菌体展示方法允许将非常广泛范围的待展示POI有效掺入噬菌体颗粒中，并因此实现有效的噬菌体展示。此新方法相比于传统噬菌体展示法的关键差异在于使用将含待展示POI的融合多肽导向共翻译SRP途径的信号序列(图2，(1)-(2))。这样，待展示POI被有效转运穿过胞质月莫进入周质中，因此能使POI有效掺入到噬菌体颗粒中。优选的融合蛋白还包含一种丝状噬菌体壳体蛋白或截短形式的壳体蛋白。在此情况下，POI在转运后(图l)和掺入到噬菌体颗粒中之前通过噬菌体壳体蛋白的疏水伸展被锚定至胞质膜。耙向SRP途径的信号序列的一个具体实例是大肠杆菌蛋白DsbA(DsbAss)的信号序列。例举的pDST噬菌粒的所有其它元件都来源于经典噬菌粒如pAK100系列，其携带PelB(Pe旧ss)或PhoA(PhoAss)的信号序列，这些信号序列经翻译后Sec途径引导要展示的目标多肽(图2,(3)-(4)-(5》。在一系列的实验中，比较由编码PhoAss的pDST噬菌粒和编码DsbAss的pDST噬菌粒产生的噬菌体颗粒之间的展示率。噬菌体颗粒如下文所述用标准方法产生，并通过CsCl梯度离心纯化。蛋白质印迹表明，对于单链Fv抗体展示，pDST噬菌粒产生的噬菌体颗粒具有大约相同的POI展示率，与使用的信号序列无关(图4A,scFv)。但是，完全相反的是，当使用含DsbAss的pDST噬菌粒时，全部4种检验的DARPins都能唯一地被有效展示，当使用含PhoAss的pDST噬菌粒时，几乎不能检测到展示的蛋白(图4A,DARPms)。同样，就多肽GCN4(图4A)、入头蛋白D、TrxA和APH(图4B)而言，含DsbAss的pDST噬菌粒产生相当高的展示率。对于蛋白Taq聚合酶、噬菌体入蛋白磷酸酶(XPP),仅观察到稍高的展示率，对于c-junN-末端激酶2(JNK2,图4B)未能检测到展示的蛋白。这表明通过使用含DsbAss的pDST噬菌粒产生的噬菌体颗粒上的展示率至少与使用PhoAss的经典噬菌粒产生的展示率相当，但在展示DARPins和其它快速折叠且热动力学稳定的蛋白时显示出强烈增加的展示率。为定量此差异，在噬菌体ELISA实验中使用噬菌体颗粒。在由含DsbAss的pDST嗟菌粒或含PhoAss的pDST噬菌粒生产后，比较展示特异性结合蛋白APH和JNK2的DARPins的噬菌体颗粒。基于用抗-M13抗体定量的结合噬菌体颗粒的检测结果，观测到100倍以上的展示率增加(图5)。为表明通过使用DsbAss获得的较高展示率还有益于选择实验，以不同稀释度混合含3种不同类型的噬菌体颗粒(由编码DsbAss或PhoAss的^^菌粒生产)的2种测试混合物。对于两种测试混合物，以1:107稀释度将展示特异性结合蛋白APH和JNK2的DARPins的噬菌体颗粒搀入展示未选^t奪的DARPinsE3—5和E3—19的噬菌体颗粒中。这两个测试混合物用作对靶蛋白APH和JNK2进行标准噬菌体展示选^t奪的输入文库(表2)。而APH和JNK2特异性噬菌体颗粒可由编码DsbAss的p笪菌粒产生的测试混合物富集，每轮选择富集约1000倍(在仅2轮选择后就已有10%以上的测试克隆对其靶是特异性的)，由含PhoAss的p笪菌粒产生的测试文库甚至在5轮选择后也未能观测到富集(未观测到特异性克隆)。在另一系列的实验中，通过噬菌体ELISA比较由编码PhoAss、Pe旧ss、DsbAss、TorTss、To旧ss或SfinCss的pDST噬菌粒产生的噬菌体颗粒之间的展示率。在由各个pDST噬菌粒生产后比较展示特异性结合蛋白APH和JNK2的DARPins的噬菌体颗粒。基于用抗-M13抗体定量的结合噬菌体颗粒的检测结果，与Sec-依赖性信号序列PhoAss相比，用SRP-依赖性信号序列(DsbAss、TorTss、To旧ss或SfmCss)观测到达700倍的展示率增加。(图6)。表i.属^4^炎逸萝傳斌面丄的蛋冷的澥迷,裙萃赠在淑"參者PhoAssDsbAssscFv—gpDscFvpDST24pDST31结合含二碗键gpD的单链Fv的E1-T245cDARPin3a3apDST21pDST23结合APH的DARPin3a的D13-Q166dDARPinJNK2—2一32—3pDST34pDST37结合JNK2的DARPinJNK2_2_3的D13-Q133DARPinE35E3—5pDST30pDST32未选择的DARPinE3一5的D13-Q166fDARPinE3—19E3—19pDST65pDST66未选择的DARPinE3J9的D13-Q166gGCN4GCN4pDST39pDST40来源于转录因子GCN4(E259-，S262P)的肽的R249-R281hpDtDN2gpDpDST41pDST42噬菌体X的壳体稳定蛋白的T21-V110iJNK2ffiJNK2pDST45pDST46有丝分裂原活化的蛋白激酶JNK2的S2-R424jTrxATrxApDST47pDST48硫氧还蛋白的S1-A108(大肠杆菌的TrxA基因)kT叫聚合酶Stoffel片段TaqpDST51pDST52T叫DNA聚合酶的S290-E832入-磷酸酶辟pDST53pDST54噬菌体人SerThr蛋白磷酸酶的M1-A221mAPHAPHpDST55pDST56氨基糖苷磷酸转移酶的A2-F264(C19S，C156S，S194C)ascFv,单链Fv抗体片段；DARPin,设计的锚蛋白重复蛋白；PhoAss,PhoA信号序列；DsbAss,DsbA]言号序列N吏用的第一个和最后一个氨基酸以单字母氨基酸密码子指示，提及点突变C(SEQIDNO:2)d(SEQIDNO:3)eBinz,H.K.等,在上述引文中fGenBank登录号AA025689gGenBank登录号AAO25690h(SEQIDNO:4)'Swiss-Prot登录号P03712JSwiss-Prot登录号P45984kSwiss-Prot登录号P00274'Swiss-Prot登录号PI9821mSwiss-Prot登录号P03772nSwiss-Prot登录号P0A3Y5<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>a由编码PhoAss或DsbAss的噬菌粒产生的输入(I叩ut)混合物如在实施例中所述产生。以1:107的稀释度向展示未选择的DARPinsE3一5和E3_19的噬菌体颗粒的1:1混合物中加入展示靶特异性DARPinsh或2一3的噬菌体颗粒。b菌落通过DNA测序筛选<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>实施例耕化学物质购自Fluka(Switzerland)。寡核苷酸得自Microsynth(Switzerland)。VentDNA聚合酶、限制性酶和緩冲液得自NewEnglandBiolabs(USA)或Fermentas(Lithuania),辅助喧菌体VCSM13来自Stratagene(USA)。所有克隆和噬菌体扩增都在Stmtagene(USA)的大肠杆菌XL1-Blue中进行。为、子J^夢除非另有说明，否则所有分子生物学方法都按照已描述的方法进行(Ausubel,F.M.,Brent，R.,Kingston,R.E.,Moore，D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.和Stuhl,K.编辑，CurrentProtocolsinMolecularBiology,NewYork:JohnWileyandSons,1999)。简要方法在下文给出。遵,沐肩^"初^才法除非另有说明，否则所有的噬菌体展示相关方法都按照已描述的方法进4亍(Clackson,T.和Lowman,H.B.编辑，PhageDisplayAPracticalApproach,NewYork:OxfordUniversityPress,2004;BarbasIII,C.F.,Burton,D.R.,Scott,J.K.编丰專，PhageDisplay:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)。简要方法在下文给出。克嫠编码DARPin3a的噬菌粒pAK100的衍生物(Krebber,A.,Bornhauser,S.,Burmester,丄，Honegger,A.,Willuda,丄，Bosshard,H.R.，和PlUckthun,A.,J.Immunol.Methods201,35-55，1997)是克隆本研究的笫一个噬菌粒(称为pDST23)的起点。为置换该pAKl00衍生物的信号序列，设计寡核苷酸oDST4(SEQIDNO:5)、oDST5(SEQIDNO:6)、oDST6(SEQIDNO:7)和oDST8(SEQIDNO:8)。这4种寡核苦酸编码大肠杆菌DsbA肠杆菌DsbA蛋白可见于Swiss-Prot数据库(登录号P24991)。其信号序列是MKKIWLALAGLVLAFSASA(SEQIDNO:l)。退火寡核香酸oDST4、oDST5、oDST6和oDST8，并通过PCR用寡核苷酸oDST6和oDST8扩增。获得的DNA片段编码DsbA信号序列，并侧接限制性内切核酸酶位点Z6al和5amM。该DNA片段用X6al和fiaw//1消化，并连接入同样处理和去磷酸化的pAK100衍生物中。分离获得的噬菌粒pDST23(图3)，并通过DNA测序核实正确的序列。为允许与编码PhoA的信号序列(SEQIDNO:9)的噬菌粒进行直接实验对比，产生称为pDST22的第二个噬菌粒。再退火称为oDST4p(SEQIDNO:IO)、oDST5p(SEQIDNO:l1)、0DST6(SEQIDNO:7)和oDST8p(SEQIDNO:12)的4种寡核苷酸，并通过PCR用oDST6和oDST8p扩增。获得的DNA片段编码PhoA信号序列，并侧接限制性内切核酸酶位点和^w别。此DNA片段用XMI和^aro//1消化，并连接入同样处理和去磷酸化的pDS丁23中。分离获得的噬菌粒pDST22，并通过DNA测序核实正确的序列。本研究中使用的其它噬菌粒列于表1,如下获得使用适宜设计的PCR引物和模板DNA，例如制备的cDNA或公众可获得的质粒DNA,PCR扩增目标蛋白的编码序列。从而将5aw//1或限制性位点导入各个编码序列的5-端，将两个限制性位点(五coM和尸M)导入各个编码序列的3-端。这些PCR片段用5a附//1或以及5"c(7I或尸WI消化，然后连接入同样处理和去磷酸化的噬菌粒pDST23或pDST22中。所有构建物都保留了含克隆PCR产物的融合多肽表达盒的可读框，尤其是保留了与噬菌体蛋白III的C-末端结构域(CTp3)融合的C-末端的正确读框。克隆的目标蛋白的第一个和最后一个氨基酸以及GenBank或Swiss-Prot数据库的参考或登录号在表1中给出。所有噬菌粒的正确序列都通过DNA测序核实。对设计的锚蛋白(DARPms)3a和2_3，j吏用如上对DsbAss和PhoAss描述的相同克隆策略，产生编码PdBss(分别为pDST80和pDST81)、SfmCss(分别是pDST86和pDST87)、TolBss(分别是pDST84和pDST85)和TorTss(分别是pDST88和pDST89)的噬菌粒。用具有目标噬菌粒的单个大肠杆菌XL-1Blue菌落接种5ml含1%葡萄糖、34fig/ml氯霉素(cam)和15fig/ml四环素(tet)的2xYT培养基，细胞于^。C振摇过夜生长。用过夜培养物以1:100的比率(OD6。。0.04)接种新鲜的5ml含1%葡萄糖、34jig/mlcam和15fig/mltet的2xYT培养基，于37。C振摇生长至OD6。。为0.5。培养物用VCSM13辅助噬菌体以4x101Qpfu(噬菌斑形成单位)/ml(感染复数约为20)感染，将细胞于37。C不搅拌温育30分钟，然后于37。C振摇温育30分钟。如下更换培养基通过离心(3500g,24°C,IO分钟)收集细胞，将沉淀重悬浮在50ml含34)ig/mlcam、50吗/ml卡那霉素(kan)和0.1mM异丙基-P-D-硫代半乳糖普(IPTG)的2xYT培养基中。在于3CTC振摇生长14-16小时后，通过离心去除细胞(5600g,4°C,IO分钟)。培养上清液在冰上与1/4体积的冰冷PEG/NaCl溶液(20%聚乙二醇(PEG)6000,2.5MNaCl)温育1小时。然后通过离心(5600g,4'C,15分钟)收集沉淀的噬菌体颗粒，再溶解在1mlTBS15Q(25mMTris/HCl,"0mMNaCl,pH7.5)中。如下通过CsCl梯度离心进行噬菌体颗粒的进一步纯化。在加入1.6gCsCl后，用TBS^将体积调整至4ml。将CsCl溶液转移至y2xl!/2英寸聚异质同晶体管(Beckmann,USA,No358980)中，并在TLN曙IOO转子(BeckmanInstruments)中于4°C以100000r.p.m.离心4小时。在离心后回收噬菌体区带。将噬菌体转移至72x2英寸聚碳酸酯管(Beckmann,USA,No349622)中，装入TBS，至3ml。在TLA-100.3转子中于4。C以50000r.p.m.离心1小时后，沉淀的噬菌体再溶解在3mlTBS中。在TLA-100.3中于4。C以50，000r.p.m.再离心1小时后，将噬菌体溶解在1mlTBS中。噬菌体颗粒的总浓度以分光光度法定量。使用含1%葡萄糖和34jug/mlcam的2xYT琼脂平板，通过对大肠杆菌XL-1Blue细胞滴定测定噬菌体样品的感染滴度。在于37。C过夜温育后计数菌落。还原条件下对通过CsCl梯度纯化的5x10"个噬菌体颗粒应用15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),并通过电印迹转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)Immobilon-P转移膜(Millipore,USA)。该膜用MTTBS15o(TBSI50,0.1%Tween20,5y。脱脂乳)于室温(RT)封闭1小时，并与作为一抗的鼠拓二-pIII抗体(MoBiTec,Germany,No.PSKAN3)(1:1000,MTTBS15。中，室温20分钟)温育，该一抗识别pill的C-末端结构域。F(ab，)2片段山羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶缀合物(Pierce，USA,No.31438)(1:10000,MTTBS，中,室温1小时)用作二抗。蛋白用ChemiGlowWest底物(AlphaInnotech,USA)检测。在第二个实验中，封闭的膜与作为一抗的鼠抗FLAGMl抗体(Sigma,USA,No.F3040)(l:5000，MTTBS15。中，室温1小时)温育。山羊抗小鼠IgG碱性磷酸酶缀合物(Sigma,USA，No.A3562)(l:10000MTTBS,5。中，室温1小时)用作二抗。蛋白用底物5_溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)和氮蓝四峻(NBT)(Fluka,Switzerland)检测。进行噬菌体ELISA,以测定MB噬菌体颗粒上功能性展示的DARPins的量。生物素化APH和JNK2蛋白(Binz等，在上述引文中)如下固定通过于4。C过夜温育将TBS15。中的中性抗生物素蛋白(66nM,100iul/孑L;Socochim,Switzerland)固定在MaxiSorp板(Nunc,Denmark,No.442404)上。各孔用300|ulBTTBSI5。(TBS，，0.1%Tween20，1%BSA)于室温封闭1小时。于4。C进行BTTBS，中的生物素化APH和JNK2蛋白(IOOpi,1^M)的结合持续1小时。将BTTBS15Q中连续稀释的噬菌体颗粒加入各孔，并于室温温育2小时。在用300TTBS150(TBS150,0.1%Tween20)对孔进行5次的5分钟清洗后，用抗-M13辣根过氧化物酶缀合物(AmershamPharmaciaBiotech,UK,No,27-9421-01)和可溶性BMBluePOD底物(RocheDiagnostics,Germany,No.1484281)检测结合的嗟菌体颗粒。赠赠逸分别由编码PhoA信号序列的噬菌粒(pDST30、pDST65、pDST22、pDST34)或编码DsbA信号序列的噬菌粒(pDST32、pDST66、pDST23、pDST37)生产展示E3—5、E3—19、3a和2一3的噬菌体颗粒。这些噬菌体颗粒用于制备由编码PhoAss或DsbAss的噬菌粒生产的噬菌体颗粒的混合物。以l:l(^稀释度向展示非结合性DARPmsE3一5和E3—19的噬菌体颗粒的1:1混合物中加入展示靶特异性DARPins3a或2—3的噬菌体颗粒。如对嗟菌体ELISA所述包被生物素化APH和JNK2蛋白。向各孔的0.1mlBTTBS，力口入O.lml噬菌体颗粒混合物(1013cfu/ml),并温育2小时。在用TTBS15。(第一轮选择3次，第二轮4次，其它轮次5次)和TBS15。(第一轮选择3次，第二轮4次，其它轮次5次)清洗后，如下洗脱噬菌体颗粒与0.2ml洗脱緩沖液(0.2M甘氨酸/HCl，pH2.2)于约22。C温育15分钟，接着用0.2ml胰蛋白酶(10mg/ml，TBSI5。中)于37。C洗脱30分钟。合并的洗脱液(用10fil2MTiis-碱中和)用于感染4ml指数生长的大肠杆菌XL1-Blue。于3TC不搅拌温育30分钟和于37。C振摇温育30分钟后，将细胞涂布在含1%葡萄糖和34pg/mlcam以及15pig/mltet的2xYT琼脂平板上，于37。C过4复生长。用含1%葡萄糖、15%甘油、34|ug/mlcam和15吗/mltet的2xYT由平板上洗下细胞，并用于下一轮淘选的噬菌体生产。在每轮淘选后，测定9-16个洗脱的噬菌体颗粒的身份。这可如下进行用这些噬菌体颗粒感染大肠杆菌，并通过采用克隆特异性引物的PCR筛选菌落。权利要求1.一种丝状噬菌体展示方法，其中由DNA文库编码的目标多肽被展示在噬菌体颗粒上，其中所述目标多肽被共翻译转运穿过革兰氏阴性细菌胞质膜。2.权利要求1的方法，其中所述共翻译转运基于信号识别颗粒途径实现。3.权利要求1或2的方法，其中所述用于要展示在噬菌体颗粒上的目标多肽转运的信号序列是促进TrxA共翻译转运的信号序列。4.权利要求l、2或3的方法，其中所述用于要展示在噬菌体颗粒上的目标多肽转运的信号序列选自TorT、SfmC、FocC、CcmH、Yral、TolB、NikA、Flgl和DsbA的信号序列及其同系物。5.权利要求4的方法，其中所述用于要展示在噬菌体颗粒上的目标多肽转运的信号序列选自TorT、SfmC、To旧和DsbA的信号序列。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述要展示在噬菌体颗粒上的目标多肽是重复蛋白。7.权利要求1-6中任一项的方法，所述方法包括以下步骤(a)构建含融合多肽表达盒的丝状噬菌体或噬菌粒载体，所述融合多肽具有促进融合蛋白共翻译转运穿过革兰氏阴性细菌胞质膜的N-末端信号序列；(b)通过将编码目标多肽的DNA文库克隆入步骤(a)的载体的表达盒中，构建噬菌体或噬菌粒载体的组合文库；(c)用步骤(b)的载体的文库转化合适的革兰氏阴性细菌；和(d)进行多轮噬菌体展示选择，以基于所展示目标多肽的特性分离噬菌体颗粒。8.—种丝状噬菌体展示方法，其中展示在噬菌体颗粒上的目标多肽使用信号序列共翻译转运穿过革兰氏阴性细菌胞质膜，所述信号序列选自TorT、SfmC、FocC、CcmH、Yral、To旧、NikA、Flgl和DsbA的信号序列及其同系物。9.权利要求8的方法，其中所述信号序列选自TorT、SfmC、TolB和DsbA的信号序列。10.—种含编码融合蛋白的基因构建物的噬菌体或噬菌粒栽体，所述融合蛋白含要展示在噬菌休颗粒上的目标多肽和信号序列，所述信号序列选自TorT、SfmC、FocC、CcmH、Yral、To旧、NikA、Flgl和DsbA的信号序列及其同系物。11.权利要求10的载体，其中所述信号序列选自TorT、SfmC、To旧和DsbA的信号序列。12.—种含编码融合蛋白的基因构建物的噬菌体文库或噬菌粒载体文库，其中每种融合蛋白都包含促进TrxA共翻译转运的信号序列和要展示在噬菌体颗粒上的目标多肽，其中每种目标多肽都由DNA文库的成员编码。13.权利要求12的载体文库，其中所述信号序列选自TorT、SfmC、FocC、CcmH、Yral、Toffi、NikA、Flgl和DsbA的信号序列及其同系物。14.权利要求12的载体文库，其中所述信号序列选自TorT、SfmC、TolB和DsbA的信号序列。15.权利要求12至14中^f壬一项的载体文库，其中所述编码目标多肽的DNA文库是编码重复蛋白的DNA文库。全文摘要本发明涉及一种丝状噬菌体展示方法，其中展示在噬菌体颗粒上的目标多肽基于信号识别颗粒途径被共翻译转运穿过革兰氏阴性细菌的质膜。该方法特别适合于已知难以展示在噬菌体上的多肽，以及cDNA文库和其它组合文库的蛋白，尤其是在蛋白来源于非常快速折叠的、稳定的蛋白支架时。本发明还涉及可用于所述方法的噬菌体或噬菌粒载体，其包含编码融合多肽的基因构建物，所述融合多肽包含要展示在噬菌体颗粒上的多肽和促进共翻译转运的N-末端信号序列。文档编号C12N15/10GK101213299SQ200680024386公开日2008年7月2日申请日期2006年6月30日优先权日2005年7月8日发明者A·普卢克素恩,D·斯泰纳,M·T·斯图姆普,P·福勒申请人:苏黎世大学