pⅦ噬菌体展示的制作方法

专利名称：：pⅦ噬菌体展示的制作方法pVII噬菌体展示
背景技术：
：组合方法用于蛋白质鉴定、表征和修饰的用途已经在学术及商业研究和开发两方面获得高度成功。在这个方面，丝状噬菌体或噬菌体展示技术为首个文库平台铺平道路并作为主导技术仍占据统治地位。因而，噬菌体展示广泛地应用于基础和应用性蛋白质发现，以及开发基于新蛋白质的诊断剂和治疗剂，所述诊断剂和治疗剂是世界范围内迅速增加的化合物类型。组合噬菌体展示技术的原理基于由每个病毒粒子仅在其表面展示完全相同蛋白质的特征提供的基因型-表型关联，其中所述的蛋白质由被噬菌体蛋白质衣壳包装的基因组编码。噬菌体颗粒本身高度抵抗多种物理化学条件；因而与竞争性组合技术相比较而言，噬菌体展示在多种选择方案提供优越的通用性。异源多肽的噬菌体展示已经使用丝状噬菌体衣壳的全部5种结构蛋白实现，不过仅PlII-展示和某种程度上pVIII-展示获得广泛使用(图1)。当异源融合物仅是短肽时，优选使用基于噬菌体基因组的载体的多价展示系统，而对于需要折叠的结构域的较大融合物，大多数应用将从噬菌粒系统获益。在后一种情况下，抗体-PlII噬菌体展示迄今在本领域居主导地位，不过备选支架(scaffold)即将出现，从而继续需要扩充将来的蛋白质工程工具。对于许多应用而言，将高度有利的时能够产生并且尤其以受控方式产生双特异性噬菌体颗粒，从而多于一种衣壳蛋白在相同病毒颗粒的背景下展示融合肽。另外，这种系统不应当干扰已经建立的展示方法，并尤其不干扰PlII和pVIII展示。1995年Endemann和Model(PMID7616570)报道次要衣壳蛋白pVII在完整噬菌体中不可接近并且其氨基末端与另一个蛋白质融合的PVII是没有功能的。因此，该报告得出结论PVII不能用于噬菌体展示。1999年Gao等人(PMID10339535)和专利申请W00071694描述使用八肽FLAG标签在PVII上的异源肽噬菌体展示，以及在pVII上的同时噬菌体展示以产生具有复杂折叠拓扑学的功能异源二聚体多肽(抗体Fv)。这些作者旨在开发抗体展示的备选手段。pVII和PlX融合蛋白从使用双顺反子构象的噬菌粒表达，因而所得的功能噬菌体颗粒必然含有可变数量的PVII和pIX融合蛋白，原因在于从辅助噬菌体基因组供给的野生型pVII和pIX蛋白的互补作用。如上文提及，先前已经提出其氨基末端与另一种蛋白质融合的PVII和Pix是没有有功能的，并且Gao等人给出了他们获得成功的单独或二者组合的两种可能原因。一种可能原因是原核前导序列(信号序列)以氨基末端连接至融合蛋白，因而确保将重组蛋白定向至周质间隙并因而防止在细胞浆中积聚。另一种可能原因是重组蛋白从噬菌粒表达，而非如Endemarm和Model那样从噬菌体基因组表达，因而为噬菌粒拯救必然所需要的来自辅助噬菌体的野生型PVII和pIX弥补了重组pVII和pIX融合蛋白，因而保持了本来可能已经因重组修饰而丧失的野生型官能性。即噬菌体将包含野生型蛋白和融合蛋白的混合物。作者提到pVII-pIX展示模式将对似乎在淘洗流程期间因未知原因产生特别有力富集作用的异源二聚体阵列组合展示特别有用。所述作者没有构思使用pvii作为唯一展示蛋白(作为噬菌粒或噬菌体基因组)或使用与另一种(不同于PlX的)衣壳蛋白处展示组合的PVII展示以实现双特异性展示。Kwasnikowski等人(PMID16277988)描述了单链抗体可变区基因片段(scFvfragment)直接与噬菌体基因组中基因VII的遗传稳定融合。即，所得噬菌体不包含天然PVII蛋白，并且这种VII展示是多价的。作者推测在噬菌体基因组模式下成功pVII展示的原因之一是它们支持带有指导融合蛋白至周质间隙的原核信号序列的融合基因。所述作者主张其系统的独有特征是PVII展示噬菌体携带未修饰的野生型pill次要衣壳蛋白。由于已经报道宿主细胞感染需要多个拷贝的功能pIII，因而噬菌体表面的野生型PlII的存在可以促进回收具有较大多样性的所选抗体。然而，所述作者未构思双特异性展示，他们也没有构思不带有导向周质间隙的原核信号序列的pVII展示。Khalil等人(PMID=17360403)描述了利用双特异性丝状噬菌体病毒粒子特征的用途(application)，在所述双特异性丝状噬菌体病毒粒子中外源肽展示在完全相同的病毒粒子的每个远端。他们通过使用弥补PlX展示噬菌粒的常见PlII噬菌体基因组载体组合实现这一点。在这种环境下，噬菌体基因组载体作为辅助噬菌体在拯救噬菌粒中发挥作用，因而使人联想到通过使用PVII修饰的辅助噬菌体基因组拯救pill展示噬菌粒而产生双特异性噬菌粒病毒粒子的本文所述方法。另外，Khalil等人的双特异性病毒粒子展示了允许受控地生物素化其病毒粒子的肽-PlII融合。然而，存在区别获得双特异性病毒粒子以及获得所定义病毒粒子生物素化的这两种途径的几个特征，所述特征使得这两种途径相互独特。首先，Khalil等人的方法不能与pill噬菌粒组合使用，因为正是他们的噬菌体基因组载体才携带PiIi融合物，从而双特异性不能在噬菌粒拯救时获得并且它还极有可能会损害两种PlII融合物的官能性。其次，并且如所述作者本身也指出，由于噬菌体基因组中的重叠基因，不认为基因组PlX修饰是一项有效策略，因而他们没有构想或考虑产生任何修饰的辅助噬菌体基因组，其可以用于PiII噬菌粒(或PVIII)拯救并且籍此向完全相同的病毒粒子的两个远端提供所定义的基因组特征。Khalil等人从未提到修饰的pVII在噬菌粒或噬菌体基因组展示中的用途。第三，Khalil等人没有考虑通过利用同时修饰完全相同的基因组内部的多于一种衣壳基因而修饰单个噬菌体基因组以产生双特异性病毒粒子。他们仅使用借助市售噬菌体基因组载体的标准PiII肽展示。第四，Khalil等人仅产生展示短肽，而非折叠结构域的双特异性病毒粒子，并从未考虑过在两种修饰的衣壳蛋白之一或这两种蛋白质处或其上利用这种展示。第五，Khalil等人通过体外化学偶联而非通过体外或体内酶反应实现PlI所展示肽的位点特异性生物素化。作者从未构思通过展示酶底物如AviTag进行所展示部分的酶介导的生物素化。最后，Khalil等人的确没有在不使用氨基端信号序列(N-terminalsignalsequence)的情况下显示任何类型的展示。发明简述本发明的一个目的是为展示在丝状噬菌体上的肽提供备选支架。本发明的第一方面是源自丝状噬菌体的pVII融合蛋白，所述融合蛋白不包含氨基端信号序列并因而与外源肽直接融合。本发明的另一个方面涉及编码本发明融合蛋白的核酸。本发明的一个方面涉及包含本发明融合蛋白的丝状噬菌体。本发明的另一个方面涉及丝状噬菌体的文库。本发明的一个方面涉及包含噬菌粒和辅助噬菌体的噬菌体展示系统，其中辅助噬菌体包含编码本发明pvii融合蛋白的核酸。本发明的另一个方面涉及包含噬菌粒和辅助噬菌体的噬菌体展示系统，其中噬菌粒包含编码本发明PVII融合蛋白的核酸。一个方面涉及试剂盒，其包含噬菌粒和辅助噬菌体的噬菌体展示系统，其中辅助噬菌体包含编码本发明pVII融合蛋白的核酸。图1丝状噬菌体结构的示意图。病毒粒子由包裹单链DNA分子的5种结构蛋白构成。在野生型(wt)噬菌体中，存在约2700个拷贝的pVIII并存在大约3-5拷贝的4种蛋白质pIII、pVI、pVII和pIX，它们存在于病毒粒子的每个端头。病毒粒子尺寸以每个pVIII衣壳蛋白大约2.3个核苷酸大体上依赖于基因组尺寸并且因而颗粒的长度通过pVIII的所插入拷贝增加或减少而调节。值得注意地是，pill和pVIII的结构已经通过X射线纤维衍射、结晶学和核磁共振(NMR)表征。次要衣壳蛋白PlII含有由富甘氨酸区隔开的3个明显不同结构域Al(结合于TolA)、N2(结合于F菌毛)和CT(整合至病毒粒子并且对正常的病毒粒子装配重要)。图2AviTag、HIS6-标签和FLAG-标签的大肠杆菌K12密码子优化。(A)市售AviTagDNA序列与大肠杆菌K12密码子选择的比较红色柱是提交的序列并且黑色柱是参比组。(B)上面的线显示原始AviTag，而下面的线显示根据A)中的结果所调整的修饰序列。(C)密码子优化的FLAG肽。(D)密码子优化的HIS6肽。图3与野生型辅助噬菌体相比，修饰的辅助噬菌体较的滴度。图4酶联免疫吸附测定(ELISA)分析M13K07AViTag-pVII归一化的噬菌体制备物与链霉抗生物素蛋白(SA)珠混合以吸附生物素酰化的病毒粒子并且ELISA如实施例1中所述那样进行。图5显示FLAG-标签作为M13K07中pVII融合物的可接近性的ELISA分析在所述ELISA测定法中使用归一化的噬菌体制备物。仅存在M13K07-FLAG针对M2和M5单克隆抗体(Mab)的特异性FLAG-标签检测。存在M5MAb对FLAG-标签的较强检测。图6显示FLAG-标签作为pVII融合物对M13K07(SEQIDNO:31)和VCSM13(SEQIDNO32)的可接近性的分析归一化的噬菌体制备物与泰龙戴那(TalonDyna)珠混合以吸附加HIS6标签的病毒粒子并且ELISA如实施例1中所述那样进行。图7(A)显示为Cfu"p7ml的单链T细胞受体(scTcR)和scFv-pIII展示噬菌粒的噬菌粒滴度。(B).噬菌粒对辅助噬菌体之比显示为噬菌粒滴度(cfu—Ail)除以辅助噬菌体滴度(cfukan7ml)的比率。图8scTCR噬菌粒的ELISA分析，其显示在链霉抗生物素蛋白包被的dyna珠拯救噬菌体后AviTag的特异可接近性。插图显示M13K07-AviTag辅助噬菌体的信号值。使用归一化的噬菌体制备物。图9通过两种抗FLAG抗体M2和M5捕获噬菌粒病毒粒子证实两种不同噬菌粒pFKPDNscTCRVaβ4Β2Α1(A)和pSEX-scFv抗phOx(B)中FLAG-标签作为pVII融合物的可接近性的ELISA分析。使用归一化的噬菌体制备物。图10显示在含有pVIIAviTag的噬菌粒衍生病毒粒子上所展示的scTCRpIII(A)和scFvpIII(B)的官能性的ELISA分析。使用归一化的噬菌体制备物。图11显示在带有FLAG-标签和HIS6-标签的噬菌粒衍生病毒粒子上所展示的scTCR(A)和scFv(B)的官能性的分析结果。使用归一化的噬菌体制备物。图12带有和没有pVIIAviTag的基因组噬菌体fUSE5-scTCRpIII的滴度。图13通过链霉抗生物素蛋白珠捕获噬菌体、随后由抗M13-抗体检测已结合的噬菌体而显示基因组fUSE5-AviTag噬菌体制备物的官能性的ELISA分析。使用归一化的噬菌体制备物。图14显示pill-展示的scTCR在带有Avitag-pVII的基因组噬菌体fUSE5上官能性的ELISA分析。使用归一化的噬菌体制备物。图15新pGALD7(A)和pGALD7ΔL⑶pVII展示噬菌粒的示意图。两种噬菌粒的载体主链均基于pSEX81(SEQIDNO:29)，其中所述pSEX81的序列可以从GenBank登录号Y14584获得并且在材料与方法中描述关于该构建体的细节。两种噬菌粒可以分别通过Ncol/Hindlll和MluI/NotI部分轻易交换表达盒而容纳符合可读框的外源序列表达盒。所述表达盒由本文所述不同之间变动的人工接头序列连接。缩写lacP0，Iac启动子；sd，Shine-Dalgarno序列；pelB，细菌果胶酸裂合酶的信号序列；TP，胰蛋白酶；t，T7转录终止子。图16/ApGALD7AL(pVII^),pGALD7(pVII),pSEX81(pill)和pSEX81ΔL(pill展示的scFv抗ph0x(SEQIDNO26)的噬菌粒滴度。全部噬菌粒携带氨苄青霉素抗性标记，因而滴度显示为每毫升溶液氨苄青霉素抗性菌落形成单位(cfiTP7ml)。图17比较pVII与pill之间和具有与没有信号序列(AL)的情况下功能scFv抗PhOx(SEQIDNO26)展示的抗原特异性(phOx-BSA)ELISA。ELISA如材料与方法中所述那样进行并且滴度输入量对于全部样品是2Χ101(ι(^ιΓΡ7πι1，除pGALD7(pVII)之外，该样品不稀释就使用(对应于1.1XIO7Cfu-pVml)。抗M13hkp是病毒粒子检测MAb对抗原和封闭物的非特异性吸附作用的阴性对照。图18(A)显示为cfuamp7ml的从pGALD7ΔL(pVIIΔL)、pGALD7(pVII)、pSEX81(pill)禾口pSEX81AL(pIII^)展示的scFv抗phOx(SEQIDNO26)的噬菌粒滴度。(B).噬菌粒对辅助噬菌体之比显示为噬菌粒滴度(cfiTP7ml)除以辅助噬菌体滴度(cfukan7ml)的比率。病毒粒子包装通过如材料与方法中所述的标准噬菌粒拯救法(_)或在A和B中超感染后在终浓度的0.ImM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)存在下进行。图19比较具有与没有信号序列(AL)及具有与没有IPTG诱导(0.lmM)pVII融合物表达的情况下功能scFv抗ph0x(SEQIDNO26)展示的抗原特异性(phOx-BSA)ELISA。ELISA如材料与方法中所述那样进行并且滴度输入量对于PGALD7ΔL(pVIIΔL)是2X1010cfuampE/ml，其中pGALD7(pVII)不稀释就使用(对应于分别在没有和具有IPTG情况下的2.0XIO9和1.1XIO7CfuampVml)。抗M13hkp是病毒粒子检测MAb对抗原和封闭物的非特异性吸附作用的阴性对照。图20比较具有与没有信号序列(AL)的情况下功能scTCR(A)和scFv-抗NIP(B)pVII展示的抗原特异性ELISA。ELISA如材料与方法中所述那样，使用等体积的进行未稀释的净化的上清液进行。抗M13hkp是病毒粒子检测MAb对抗原和封闭物的非特异性吸附作用的阴性对照。在(A)中，使用对4B2A1T细胞受体(Bogen等人，PMID1700755)特异的GB113抗体克隆作为代理抗原，替换针对scTCRVaβ4B2A1(L0set等人，PMID17925331)的同族I-Ed/λ2315配体。图21(A)使用如材料与方法中所述的标准噬菌粒拯救，从PGALD7ΔL和pGALD7展示的cTCRVaβ4B2Al和scFv抗mP(SEQIDNO27)的噬菌粒滴度。(B)与(A)中相同的样品的噬菌粒对辅助噬菌体的比率。图22(A)在病毒粒子包装流程结束时作为A6tltlnm光密度(OD)测量的相应大肠杆菌培养物的细胞密度。值得注意地，全部培养物始于A6tltlnm0.025的相同密度并在A6tltlnmO.1达到时用M0I5的M13K07超感染。随后使包装在30°C继续进行直至测量终末培养物OD之前。发明详述应当指出在本发明诸方面之一的上下文中描述的实施方案和特征也适用于本发明的其余方面。本申请书中引用的全部专利和非专利参考文献因而通过引用方式完整地并入本文。我们在此提出一个新概念，其中遗传地改变丝状噬菌体病毒粒子的衣壳结构蛋白PVII，从而修饰的形式编码氨基端序列标签。根据融合于pVII的哪种类型的标签，赋予病毒粒子特异性标签检测的特性以及作为该系统固有特性的灵活纯化和固定途径。所述方法完全兼容于现有全部PiII和PVIII展示系统，无论是否使用基于噬菌体基因组的噬菌粒载体，包括在PVII上产生新文库。我们的概念因而是提供噬菌体展示技术已有高度通用性的前所未有的扩展。现有报告首次显示丝状噬菌体基因组耐受不携带信号序列的pVII的氨基端肽修饰，而不干扰噬菌体的活力和官能性。这对M13K07(SEQIDNO:31)、VCSM13(SEQIDNO:32)和fUSE5(SEQIDNO30)基因组以及噬菌粒的确如此并且因为各种噬菌体毒株之间的序列和表型转换是极高的，故这很有可能适用于全部丝状噬菌体。所选的pVII融合物之一是AviTag(一种作为迄今报道的最高效BirA底物的肽)的原核密码子优化形式。通过这种PVII肽展示与PlII展示组合，我们证实产生了双特异性病毒粒子。对基于噬菌体基因组的载体fUSE5(SEQIDNO30)和用修饰的M13K07辅助噬菌体拯救时对基于噬菌粒的展示确实是这样。可容易构思的是这种双特异性性质也可以与PVI11展示组合使用。特别在噬菌粒衍生的病毒粒子的情况下，内源性生物素化水平极低。然而，如果需要高的生物素化水平，可以通过这些病毒粒子的体外生物素化以及借助F-阳性大肠杆菌AVBIOOFmkII菌株的新用途通过利用体内生物素化轻易地实现这一点ο因而，现有概念产生抗生物素蛋白-生物素技术(及其他捕获系统)与居主导的噬菌体展示平台(噬菌体和噬菌粒)和展示系统(pill和pVIII)的组合。它还导致生物素部分与噬菌体颗粒的受控的位点特异性附着，而不干扰PlII和/或PVIII融合物，从而确保所保留的官能性。该系统完全兼容于现有平台，无需其他修改，仅取决于是否选择使用。总之，基因组衍生的和噬菌粒衍生的病毒粒子均可以耐受pVII修饰，产生具有似乎正常的官能性和活力的病毒粒子。pVII融合蛋白在一个方面，本发明提供源自丝状噬菌体的pVII融合蛋白，该融合蛋白包含外源肽与PVII氨基末端的融合。这种融合蛋白用于例如噬菌体展示环境中。当提及外源肽时，其意指这样的肽，其初始不是pIII、pVII或pVIII蛋白的一部分，具有或没有对于该融合蛋白的pin、pVII或pVIII氨基酸部分的氨基末端的任意接头氨基酸。在优选的实施方案中，该融合蛋白不包含氨基端信号序列。如本文中所用，术语“肽”包括短肽、多肽、蛋白质及其片段。术语“pill蛋白”指SEQIDNO.2中披露的氨基酸序列。在一个实施方案中，pill蛋白包含与SEQIDNO2的氨基酸序列具有至少80%序列同一性，如80%同一性、81%同一性、82%同一性、83%同一性、84%同一性、85%同一性、86%同一性、87%同一性、88%同一性、89%同一性、90%同一性、91%同一性、92%同一性、93%同一性、94%同一性、95%同一性、96%同一性、97%同一性、98%同一性，或99%同一性的氨基酸序列。术语“pVIII融合蛋白”指与外源肽融合的pVIII蛋白或其片段。术语“pVIII蛋白”指SEQIDNO3中的氨基酸序列。在实施方案中，pVIII蛋白包含与SEQIDNO3的氨基酸序列具有至少80%序列同一性，如80%同一性、81%同一性、82%同一性、83%同一性、84%同一性、85%同一性、86%同一性、87%同一性、88%同一性、89%同一性、如90%同一性、91%同一性、92%同一性、93%同一性、94%同一性、95%同一性、96%同一性、97%同一性、98%同一性，或99%同一性的氨基酸序列。术语“pVII蛋白”指SEQIDNO1中的氨基酸序列。在一个实施方案中，pVII蛋白包含与SEQIDNO1的氨基酸序列具有至少80%序列同一性，如80%同一性、81%同一性、82%同一性、83%同一性、84%同一性、85%同一性、86%同一性、87%同一性、88%同一性、89%同一性、90%同一性、91%同一性、92%同一性、93%同一性、94%同一性、95%同一性、96%同一性、97%同一性、98%同一性或99%同一性的氨基酸。序列同一性如通常定义，“同一性”在本文定义为基因或蛋白质之间分别在核苷酸或氨基酸水平上的序列同一性。因而，在现有环境下，“序列同一性”是蛋白质之间在氨基酸水平上同一性的度量并且是核酸之间在核苷基酸水平上同一性的度量。蛋白质序列同一性可以通过比对序列时比较每个序列中给定位置内的氨基酸序列确定。类似地，核酸序列同一性可以通过比对序列时比较每个序列中给定位置内的核苷酸序列确定。为确定两种氨基酸序列或两种核酸序列的同一性百分数，出于优化比较目的比对所述序列(例如，可以在第一个氨基酸序列或核酸序列中导入空位以与第二个氨基酸序列或核酸序列优化比对)。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。在第一序列中的位置由第二序列中在对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。这两个序列之间的同一性百分数是所述序列共有的相同位置的函数(即，％同一性=#相同位置/总#位置(例如，重叠位置)χ100)。在一个实施方案中，这两个序列具有相同的长度。可以手工地比对所述序列并计数相同氨基酸的数目。备选地，可以使用数学算法实现两个序列的比对以确定同一性百分数。这种算法并入Altschul等人，1990的NBLAST和XBLAST程序。可以用NBLAST程序、评分=100、字长度=12进行BLAST核苷酸搜索以获得同源于本发明多核苷酸分子的核苷酸序列。可以用XBLAST程序、评分=50、字长度=3进行BLAST蛋白质搜索以获得同源于本发明蛋白质分子的氨基酸序列。为出于比较目的获得空位比对结果，可以使用空位BLAST。备选地，PSI-Blast可以用来进行检测分子之间远缘关系的重复搜索。当使用NBLAST、XBLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。备选地，在序列已经例如由BLAST程序在EMBL35数据库(www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST)中比对后，可以计算序列同一性。一般而言，在例如“评分矩阵”和“空位罚分”方面的默认设置可以用于比对。在本发明的环境下，BLASTN和PSIBLAST默认设置可能是有利的。可以使用与上文所述那些技术相似的技术，在容许或不容许空位的情况下确定两个序列之间的同一性百分数。在计算同一性百分数中，仅计数精确匹配。折叠的蛋白质在优选的实施方案中，术语“肽”排他地指折叠的蛋白质，如抗体衍生的结构域。熟练技术人员会认识到折叠的蛋白质可能是抗体或其片段(包括Fv、scFv、抗原结合片段(Fab)、单个结构域)、蛋白A的Z结构域(亲和体)、锚蛋白或其片段、T细胞受体或其片段、I和II类主要组织相容性抗原复合物(majorhistocompabilitycomplex，MHC)、纤连蛋白或其片段、亲和聚物(Avimer)、抗运载蛋白(Anticalin)、PDZ-结构域、免疫球蛋白新抗体受体(Immunoglobulinnewantigenreceptor,IgNAR)或其片段、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CytotoxicT-LymphocyteAntigen4，CTLA4)或其片段、大肠杆菌免疫蛋白ImmE7、打结素(Knottins)、绿色荧光蛋白(GFP)和生物其他生物基因编码的荧光团。原则上，可以产生任何物质的文库，只要它被展示，因而在最高水平上，与作为折叠的有序结构相比较而言，可以区分仅具有非结构构型的某物质。在另一个优选的实施方案中，术语“肽”排他地指2至50个氨基酸之间的短肽。在某个长度上，短的随机卷曲肽将长到足以采取定义的二级或三级折叠并且因而符合折叠的结构域定义显然，这将取决于化学组成，因而具有20个氨基酸的一条肽将仍是随机卷曲，而具有20个氨基酸的另一条肽可能折叠并且因而属于折叠的结构域定义。在另一个优选的实施方案中，本发明的pVII融合蛋白包含选自由SEQIDNO:1的位置1-33、位置2-33、位置3-33、位置4_33和位置5_33所组成的组中的序列。SEQIDNO:1(MEQVADFDTIYQAMIQISWLCFALGIIAGGQR)是丝状噬菌体衣壳结构蛋白pVII(野生型pVII)的氨基酸序列。最优选地，pVII融合蛋白包含SEQIDN0:1的位置1-33。信号序列优选地，外源肽与该融合蛋白的pVII序列氨基末端的任意接头氨基酸直接融合或不融合。在又一个优选的实施方案中，pVII融合蛋白不包含氨基端前导序列。术语“前导序列，，与术语“信号肽”和“信号序列，，可相互交换地使用，并且指弓I导(所述前导序列作为其部分的)蛋白质至革兰氏阴性细菌周质膜间隙的氨基酸序列。经常使用的前导序列的例子是pelBss、OmpAss>TorAss、malEss、phoAss、IamBss>Blass禾口DspAss、mglBss、sfmCss、tolBss和TorTss。已知此类信号序列引导完整蛋白质至大肠杆菌的分泌装置，其中已知所述的分泌装置包括从细胞质至周质间隙的至少SRP依赖性、SEC依赖性、TatABC依赖性或YidC依赖性易位(Baneyx等人PMID=15529165)。因此，术语“氨基端信号序列”指位于蛋白质氨基端部分内的信号序列。信号肽序列可以部分地通过由所述信号肽序列的氨基酸组成的化学特性定义的特征序列或基序鉴定，其中所述信号肽序列具有引导(该信号序列作为其部分的)一种蛋白质至大肠杆菌的分泌装置并因而将它从细胞质区室运输至周质区室的特性。不过，现存多种的功能信号序列超过了鉴定它们的现有知识，因而定义一种肽为同族信号序列的现有技术一般通过例如神经网络或启发式方法学，借助数据挖掘，使用基于数据的知识进行，其中所述数据以模板作为基础。迄今存在公众通过开放获得渠道可获得的几种此类工具，如Signalp、PR0SITE(EMBL-EBI)的PPSEARCH、SecretomeP、TatP。就分泌蛋白而言挑战甚至更大，原因在于它们从细胞质区室输出，这偏离了所述规则，从而可能鉴定不到信号序列基序，不过通过数据挖掘，在本文也可以定义信号序列特征或获得所讨论真核蛋白质的分泌能力的可能性。然而，不存在用于原核生物分类群的此类工具。目前可获得的毫无争议地确定一种肽作为信号序列的唯一方法因而是通过试验手段确证肽的特性以确立该肽是否为真实的信号序列。还清楚的是可以在此类肽中进行工程化，从而信号肽序列中给定的氨基酸位置可以被改变，然而仍保留其作为信号肽的功能，通过天然官能性或通过改变的官能性，如提高的运输能力。临外，可以使用氨基酸的缺失或添加。这种分析和工程化确实已经对FfpVIII信号序列、靶向Sec-途径的gSpss和靶向Tat-途径的TorAss进行。尤其，Shen等人的结果可以充当很有基础的指南用于工程化PlII信号序列和细菌果胶酸裂合酶信号序列的有功能但已改变的变体。信号序列的官能性可以进一步剖分成以下两个特性；1、引导(该信号序列作为其部分的)一种蛋白质至大肠杆菌的分泌装置并因而将它从细胞质区室运输至周质区室并且在这个过程期间，通过特定蛋白酶如脂蛋白信号肽酶或前导序列肽酶以蛋白酶解方式与剩下的蛋白质分开。2、引导(该信号序列作为其部分的)一种蛋白质至大肠杆菌的分泌装置并因而将它从细胞质区室运输至周质区室并在运输后仍留下作为该蛋白质的一部分。尽管绝大部分的信号序列符合上文给出的情形1)，然而显然这些蛋白质可以容易地工程化至情形2)。因此，任何目前已知的信号序列例如突变PelBss和当初属于情形1)但被变更成情形2)的其他信号序列仍视为同族的信号序列。另外，可构思将情形1)的信号序列改变成情形2)或直接选择符合情形2)的信号序列并随后在运输后除去该信号序列。这可以由宿主的内源性蛋白酶进行和/或在例如噬菌体展示情况下，当蛋白质融合于衣壳蛋白时进行。随后将人造蛋白酶位点工程化至该信号序列的或(该信号序列作为其部分的)一种蛋白质的恰当区域，从而可以进行定义的切害I]。在本文可以构思所选的两种不同类型的蛋白酶位点A、该蛋白酶位点不切割目的蛋白，仅是预测位点，例如与抗体或其他目的支架如主要组织相容性复合体分子或T细胞受体组合的羧肽酶A或3C鼻病毒蛋白酶位点。通过使用这种方法，可以构思例如通过使用符合上文情形2)的信号序列将目的蛋白进行噬菌体展示并在选择等过程中使用之前，人工除去该信号肽以获得衣壳融合物的官能性和均一性。B、除了工程化的位点之外，该蛋白酶位点还切割目的蛋白，例如胰蛋白酶。两种情况仍将视为信号序列依赖性噬菌体展示。野生型互补作用迄今为止，认为无信号序列的pVII融合物没有支持噬菌体颗粒产生的功能(Endeman等人，1995；Gao等人，1999)。因而，外源肽直接融合至其氨基末端的pVII融合蛋白不得不由源自噬菌体基因组的第二基因或由辅助噬菌体供给的野生型PVII蛋白补充。术语“野生型(wildtype)”有时写成野生型(wildtype)、野生型(wild-type)或wt，是某种生物、株、基因或特征如其在自然界中存在那样的常见形式。野生型指自然群体中最常见的表型。野生型也指需要用来产生野生型表型的在每个基因座处的等位基因。野生型是基因型和表型的参考标准。在生物学中，它特别涉及天然存在生物与已经被人为突变的生物之间的差异。位点定向诱变是允许突变野生型基因的基因序列中特定核苷酸的研究技术。将野生型蛋白书写成Wt-(蛋白质名称)，例如野生型pVII蛋白书写成WtpVII、wt-pVII或野生型pVII。本发明人已经发现此类pVII融合蛋白确实是有功能的并且实际上不需要由野生SpVII蛋白补充。因而，本发明的一个方面涉及在噬菌体展示方面有功能而无需由野生型pVII蛋白补充的pVII融合蛋白。Kwasnikowski等人报道了无需由野生型pVII蛋白补充的pVII融合蛋白。然而，Kwasnikowski等人的pVII融合蛋白在外源肽氨基末端包含信号肽。认为定该信号肽是指导氨基端PVII融合蛋白进入周质间隙和防止其在细胞浆中积聚所必需的。在pVII融合蛋白氨基末端不存在信号肽具有多种优势。信号肽通常以蛋白酶解方式去除并且该过程经常是不彻底的，这在表达一批蛋白质时生成已加工蛋白质的不同氨基末端，因而在该系统中引入随机不均一性，而这可能影响仍携带前导序列肽的蛋白质的官能性，其中所述的前导序列肽在已加工的蛋白质中引起不想要的错误。当无信号肽存在时，防止这种情况发生。另外，当展示肽文库时，某些肽可能妨碍或影响蛋白酶解，这转而将能够影响所展示蛋白质的活性和因而影响功能性文库的多样性。不包含信号肽的又一个惊人优势是噬菌体的活力和官能性不受影响，这与使用信号肽的情况相反。Kwasnikowski等人报道带有在氨基末端包含前导序列(信号肽)的PVII融合蛋白的噬菌体的滴度降低。外源肽在一个实施方案中，外源肽是与预定靶结合的亲和标签。该亲和标签可以例如与预定抗体结合。配对的亲和标签和预定靶是技术人员熟知的。蛋白质标签是遗传地移植到重组蛋白上的肽序列。这些标签往往是通过化学品或通过酶方法如蛋白酶解或蛋白质内含子剪接可除去的。标签出于多种目的附着至蛋白质。将亲和标签附加至蛋白质，从而使用亲和技术，可以从粗制生物学来源中纯化所述蛋白质。使用未加工的氨基端FLAG标签的特征是该标签使其甲酰Met残基完好无损并因而允许与抗FLAGMAbMl发生Ca2+依赖性相互作用。病毒粒子可以因而被束缚(固定)在Ml上并且仅因螯合阳离子例如由EDTA螯合释放，从而提供极温和的洗脱，而没有造成异源性融合物变性的极端PH。使用Ml还意味该系统可以与(内部、加工的氨基端或羧基端)存在的其他FLAG融合物一起使用，而无干扰，因为这些融合物不由Ml识别，或通过单纯地维持低[Ca2+]。在优选的实施方案中，pVII融合蛋白的外源肽选自由AviTag(SEQIDNO4),FLAG标签(SEQIDNO9)、HIS标签(SEQIDNO:12)、HAT标签、HA标签、c_Myc标签、Str印标签、V5标签、其抗体或其片段、T细胞受体或其片段、I和II类MHC、锚蛋白、IgNAR或其片段、纤连蛋白或其片段、蛋白A的Z结构域、CTLA4或其片段、ImmE7、GFP和其他生物基因编码的荧光团所组成的组中。SEQIDNO:2(MSGLNDIFEAQKIEWHE)是大肠杆菌酶BirA序列的底物序列，其中所述大肠杆菌酶BirA序列能够使生物素部分以酶介导的位点特异性方式偶联于该底物序列。因而，联合了噬菌体展示技术和抗生物素蛋白-生物素技术的优点。其中文库不展示于PVII上的任意融合物文库可以例如首先针对某种靶进行分级以鉴定高亲和力文库成员，并随后使用生物素与抗生物素蛋白或抗生物素蛋白样基质的结合作用，借助还包括PVII融合于病毒粒子上在内的手段固定。或者，其中文库不展示于PVII上的任意融合物文库可以例如首先以受控、定向方式随机地或以预定阵列固定在抗生物素蛋白或抗生物素蛋白样基质上，随后借助还包括PVII融合于病毒粒子上在内的手段进行靶筛选，如在例如SEREX中。类似地，可以在利用任意抗生物素蛋白-或抗生物素蛋白-样受体复合物与靶相互作用之前或之后检测大量的或作为单个克隆的PiII或PVIII融合物文库的任意成员。术语“报告分子”在本文中描述例如酶、核酸种类或人造或生物荧光团。基本上，对AviTag概述相同的原理，其中AviTag导致密切至不可逆的固定，而使用咪唑，HIS6产生温和洗脱。组氨酸(HIS)标签与全部可用的固定化金属离子亲和层析(IMAC)基质兼容。在另一个优选的实施方案中，pVII融合蛋白的外源肽是文库成员。如本文环境中使用的文库指不同肽的集合。所述肽可以是折叠的结构域或短肽，例如2-50个氨基酸。此类文库是有意义的，因为它们可以用来鉴定与给定靶结合的新配体。与使用PlII或PVIII展示的文库相比较而言，使用pVII来展示文库存在几个优点。在定向性和效价方面，PVII展示具有与pill展示相同的优点，不过将不影响感染性，已知这是伴随pill展示出现的一个现象，其中在例如亲和选择后拯救时，所述PiII展示向系统导入失控和不想要的不均一性。另外，pVII展示可以在不需要氨基端前导序列肽的情况下实现，其中所述的氨基端前导序列肽是PlII展示和PVIII展示的前提。最后，PiII展示中任何靶固定的种类通常要求(一般由竞争性洗脱或高或低PH洗脱)破坏这种靶-噬菌体键。例如已知这严重妨碍PlII展示中高亲和力或稳定结合物的回收。由于感染所需的PlII不改变并且随时可用于PVII展示中的其他相互作用，即便在噬菌体-靶相互作用后也是如此，因而这完全消除了破坏键的需求，例如酸性洗脱，因为固定的噬菌体仍保持完全的感染性并因而可以在结合于靶的情况下简单地通过感染回收。核酸本发明的第二方面是编码本发明融合蛋白的核酸。该核酸可以包含于噬菌体基因组内部或噬菌粒内部。术语“核酸”指由单聚体核苷酸的链组成的大分子。在生物化学中，这些分子携带遗传信息或形成细胞内部的结构。最常见的核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。此外，术语“核酸”包括人造核酸，如肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及乙二醇核酸(GNA)和苏阿糖核酸(TNA)。这些核酸每一种因分子主链的改变而区别于天然存在的DNA或RNA。噬菌粒或噬粒是一种类型的克隆载体，其中将所述克隆载体开发为丝状噬菌体Ff和质粒的杂合体以产生可以作为质粒增殖并还可以包装为病毒颗粒中单链DNA的载体。类似于质粒，噬菌粒可以用来克隆DNA片段并通过一系列技术(转化、电穿孔)导入细菌宿主。然而，用用'辅助'噬菌体例如VCSM13或M13K07感染含有噬菌粒的细菌宿主提供了能够复制单链DNA并将噬菌粒DNA包装至噬菌体颗粒中的必需病毒组分。丝状噬菌体本发明的第三方面是包含本发明融合蛋白的丝状噬菌体。该丝状噬菌体可以包含噬菌体基因组或噬菌粒。噬菌体，往往称作细菌噬菌体，在这里意指感染、复制并从细菌分泌的病毒。丝状噬菌体或丝状细菌噬菌体是具有以噬菌体衣壳蛋白质包装的单链DNA基因组(ssDNA基因组)的噬菌体。分泌的丝状噬菌体颗粒在表型上具有丝状结构。如本文中所用的术语“丝状噬菌体”包括噬菌体基因组-衍生的病毒粒子和噬菌粒-衍生的病毒粒子。在一个实施方案中，丝状噬菌体不包含编码融合蛋白的基因，因为该融合蛋白可能已经由辅助噬菌体提供。术语“辅助噬菌体”指这样的病毒，该病毒通过感染相同宿主细胞而帮助定义为例如噬菌粒的独立而不相关的缺陷型病毒繁殖，其中所述的噬菌粒本身既不是噬菌体基因组，也不是功能病毒，仅是含有从噬菌体基因组衍生的一个或多个元件的质粒，所述的相同宿主细胞已经由该缺陷型病毒占据并提供该缺陷型病毒丢失并且需要以形成含有该噬菌粒的病毒粒子的完整生命周期的蛋白质。在另一个实施方案中，丝状噬菌体包含编码本发明融合蛋白的核酸。该丝状噬菌体可以包含噬菌体基因组或噬菌粒。特别优选包含噬菌体基因组的噬菌体，其中所述噬菌体基因组包含编码本发明融合蛋白的核酸。在又一个实施方案中，本发明的丝状噬菌体还包含编码野生型pVII的基因和/或野生型PVII蛋白。S卩，可以通过调控野生型pVII对pVII融合蛋白的比率调节由该丝状噬菌体展示的融合蛋白的数目。这种系统也可以称作77系统或7+7系统，取决于野生型pVII蛋白是否从辅助噬菌体(7+7)或从噬菌体基因组(77)上的第二基因提供。仍在另一个实施方案，该丝状噬菌体不包含野生型pVII基因和/或野生型pVII蛋白，即该丝状噬菌体仅包含PVII融合蛋白并且不含野生型pVII蛋白。在优选的实施方案中，该丝状噬菌体还包含ρIII融合蛋白或pVIII融合蛋白。一个文库可以例如展示在PiII或PVIII处，并且例如使用抗生物素蛋白或抗生物素蛋白样基质，PVII融合蛋白可以用于亲和纯化、固定或检测。优选地，该丝状噬菌体仅包含野生型形式的Pix蛋白。本发明的第四方面是本发明丝状噬菌体的文库，所述的丝状噬菌体将外源肽或蛋白质展示为与pin、pvn或PVIII的融合物。文库是丝状噬菌体的集合，所述的丝状噬菌体将肽或蛋白质展示为一种或多种丝状噬菌体衣壳蛋白的部分。这种文库可以包含展示不同肽或蛋白质的两种或多种噬菌体。在优选的实施方案中，将肽同时地展示在pVII处以及PlII或pVIII处。在另一个优选的实施方案中，展示在pVII处的外源肽选自由AviTag(SEQIDNO:4)、FLAG标签(SEQIDNO9)、HIS标签(SEQIDNO:12)、HAT标签、HA标签、c-Myc标签、Strep标签、V5标签、其抗体或其片段、T细胞受体或其片段、锚蛋白、IgNAR或其片段、纤连蛋白或其片段、I和II类MHC、蛋白A的Z结构域、CTLA4或其片段、ImmE7、GFP和其他生物基因编码的荧光团所组成的组中。在这个实施方案中，展示于PlII或PVIII处的肽优选地是文库成员。在备选实施方案中，文库成员展示于PVII处，而pill或pVIII展示外源肽，所述外源肽选自由AviTag(SEQIDNO4)、FLAG标签(SEQIDNO9)、HIS标签(SEQIDNO12),HAT标签、HA标签、c-Myc标签、Str印标签、V5标签、其抗体或其片段、T细胞受体或其片段、I和II类MHC、锚蛋白、IgNAR或其片段、纤连蛋白或其片段、蛋白A的Z结构域、CTLA4或其片段、ImmE7、GFP和其他生物基因编码的荧光团所组成的组中。噬菌体展示系统本发明的第五方面是包含噬菌粒和辅助噬菌体的噬菌体展示系统，其中辅助噬菌体包含编码本发明pvii融合蛋白的核酸。噬菌体展示系统、噬菌体展示技术(technique)、噬菌体展示技术(technology)或简单地噬菌体展示指用于发现和研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-肽和蛋白质-DNA相互作用的方法，所述方法利用细菌噬菌体以将蛋白质与编码它们的遗传信息相联系。展示蛋白质或展示的蛋白质指与检测或配体固定可接近的噬菌体衣壳蛋白融合的蛋白质。本发明的第六方面是包含噬菌粒和辅助噬菌体的噬菌体展示系统，其中噬菌粒包含编码本发明PVII融合蛋白的核酸。试剂盒本发明的第七方面是包含由噬菌粒和辅助噬菌体组成的噬菌体展示系统的试剂盒，其中噬菌粒包含编码本发明PVII融合蛋白的核酸。试剂盒应当包括带有编码pVII的基因的噬菌粒和辅助噬菌体(例如M13K07、VCSM13或其他)，其中所述的基因具有在编码区氨基端的多克隆位点。该试剂盒应当配备用于感染、表达、固定、选择和检测噬菌体克隆的技术手册。该试剂盒也应当附带用于进行特定测定法的缓冲液和培养基的必需配方。试剂盒在本文指用于产生具有单特异性或双特异性融合蛋白的噬菌体颗粒作为噬菌体展示文库或作为单个噬菌体颗粒的试剂集合。试剂盒可能包含噬菌粒、辅助噬菌体、细菌菌株和具有试剂配方和测定法描述的技术手册。试剂盒可以用于研究试剂、诊断试剂和治疗试剂的开发。本发明的第八方面是包含基于噬菌粒基因组的噬菌体展示系统的试剂盒，其中所述噬菌粒基因组包含编码本发明pVII融合蛋白的核酸。该试剂盒应当包含带有编码pVII的基因的噬菌体基因组载体(M13K07、VCSMl3,fUSE5(SEQIDNO:30))，其中所述的基因具有在编码区氨基端的多克隆位点。该试剂盒应当配备用于感染、表达、固定、选择和检测噬菌体克隆的技术手册。该试剂盒也应当附带用于进行特定测定法的缓冲液和培养基的必需配方。本发明的第九方面是包含辅助噬菌体的试剂盒，其中所述的辅助噬菌体用于产生PiII融合物噬菌粒文库或以标签作为pVII融合物的单个PlII融合物噬菌粒克隆。该试剂盒应当包含带有编码PVII的基因的辅助噬菌体(例如M13K07、VCSM13)，其中所述的基因具有编码适于捕获和/或检测目的多肽的插入序列。该试剂盒应当配备用于感染、表达、固定、选择和检测噬菌体克隆的技术手册。该试剂盒也应当附带用于进行特定测定法的缓冲液和培养基的必需配方。本发明的第十方面是包含基因组载体的试剂盒，其中所述的基因组载体用于产生噬菌体基因组文库以将融合蛋白展示于PlII和PVII上。这种试剂盒应当包含带有编码pill和pVII的基因的噬菌体基因组载体(Ff)，其中所述的基因具有在每个编码区氨基端的多克隆位点。或者，该试剂盒应当含有这样的噬菌体基因组载体，其带有以氨基端方式存在于PVII中的编码适于捕获和/或检测的插入序列和以氨基端方式存在于pill中的多克隆位点。该试剂盒应当配备用于感染、表达、固定、选择和检测噬菌体克隆的技术手册。该试剂盒也应当附带用于进行特定测定法的缓冲液和培养基的必需配方。本发明的第十一方面是方法，其包括以下步骤a提供双特异性噬菌体展示文库，其中噬菌体包含展示于第一位置处的肽和展示于第二位置处的亲和标签。b针对靶选择该噬菌体展示文库。c针对亲和标签的捕获基团固定该噬菌体展示文库。本发明现将在以下非限制性实施例中更详细地描述。实施例实施例1.具有与pVII融合的肽的修饰辅助噬菌体具有FLAG-pVII、HIS6_pVII和AviTag-pVII的修饰辅助噬菌体M13K07(SEQIDN0:31)和VCSM13(SEQIDNO:32)可以显示扩展噬菌体展示技术用途的极广阔潜力，不过极重要的是所述融合肽不包含辅助噬菌体的官能性，因而噬菌体的滴度是一个重要验证参数。此外，与PVI融合的肽必须是后续检测和/或固定可接近的。本实施例支持这样的事实，即两种pVII-修饰的辅助噬菌体均可以携带用于检测和/或固定目的多种肽并且这些肽不影响噬菌体的感染性。尽管来自Endemann和Model(PMID=7616570)的早期结果表明丝状噬菌体(Ff)衣壳蛋白PVII不耐受外源性融合物，然而稍后已经证实基于噬菌粒的(Gao等人(PMID10339535)和基于噬菌体基因组的(Kwasnikowski等人(PMID16277988)肽和折叠结构域展示可以作为与PVII的氨基端融合物产生。在两种情况下，应当强调成功的关键要求通过添加原核信号序列或前导肽至融合蛋白的氨基最末端对该融合物进行周质引导，因而引导该融合物至大肠杆菌宿主的SEC途径。先前已经仅在携带氨基端前导肽的噬菌粒上编码的氨基端融合物的背景下证实生产性PVII展示，其中所述的氨基端前导肽确保将重组pVII运输至周质区室(Endeman等人，1995；Gao等人，1999)。然而，已知在掺入病毒粒子之前，野生型pVII作为革兰氏阴性大肠杆菌宿主的内膜中的整合膜蛋白存在，具有面向周质间隙的氨基末端。另外，由于这种膜结合的成熟的野生型PVII保留其氨基末端甲酰基(Simons等人，PMID；6945579)，它似乎不由例如周质前导肽酶以氨基末端方式加工，这对于细胞质区室外部存在的信号序列引导的绝大部分蛋白质也是如此(Baneyx和Mujacic，PMID15529165)。由于没有鉴定到pVIIORF中明显的信号序列样基序，故PVII从细胞质至周质的运输模式仍不清楚，不过最可能不涉及大肠杆菌种中所鉴定的4种主要分泌装置，即SEC-、SRP_和Tat-和YidC途径(Baneyx和Mujacic，PMID15529165；SamueIson等人，PMID10949305)。图1中显示丝状噬菌体病毒粒子的结构。试剂全部培养基和缓冲液基本上如Sambrook等人《分子克隆实验手册》(冷泉港实验liHjIiJxii)(Molecularcloning-.alaboratorymanual(ColdSpringHarborLaboratoryPress))中所述制备。抗M13-HRP抗体和M2和M5抗体分别从通用电气医疗保健生命科学部AB(GEHealthcareBio-SciencesAB)(乌普萨拉，瑞典)和西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)(奥斯陆，挪威)购买。限制酶(RE)从美国的麻萨诸塞州伊普斯威奇市的纽英伦生物技术公司(NewEnglandBiolabs)(Ipswich,MA,USA)购买，DpnI例外，它从美国加利福尼亚州拉荷亚的斯瑞塔基因(Stratagene)(Lajolla，CA，美国)获得。DNA寡聚物从MWG生物技术公司(MWGBiotechAG)(埃伯斯伯格，德国)购买。Dyna珠MyOne-链霉抗生物素蛋白磁珠和TalonNi-NTA磁珠从英杰公司(InVitrogen)(奥斯陆，挪威)购买。牛血清清蛋白(BSA)和吐温20(Tween20)从Sigma-Aldrich(奥斯陆，挪威)购买。PfuUltraDNA和PhusionDNA聚合酶分别从Stratagene(LaJolla，CA，美国)和Sigma-Aldrich(奥斯陆，挪威)购买。可溶性四甲基联苯胺(TMB)来自卡尔生化(Chalbiochem)。细菌菌株，噬菌体大肠杆菌菌株XLl-Blue从Stratagene(LaJolla，CA，美国)购买。M13K07辅助噬菌体从GEHealthcareBio-SciencesAB(乌普萨拉，瑞典)购买，而VCSM13(SEQIDNO:32)从Stratagene(Lajolla，CA，美国)购买。AviTag-,HIS6-和FLAG-pVII的设计和体外诱变使用GCUA月艮务器(http://gcua.schoedl.de/seqoverall.html),将AviTag(N-MSGLNDIFEAQKIEffHE-C)的可读框(ORF)与大肠杆菌K12菌株中的密码子选择比较。通过QuikChange体外诱变，根据制造商的技术手册(Stratagen，Lajolla,CA，美国)，使用引物对BirA-pVII_frwd/BirA-pVII_rev(5‘-CCGGCTAAGTAACATGTCCGGCCTGAACGATATCTTTGAAGCGCAGAAAATTGAATGGCATGAAATGGAGCAGGTC-3/5'-GACCTGCTCCATTTCATGCCATTCAATTTTCTGCGCTTCAAAGATATCGTTCAGGCCGGACATGTTACTTAGCCGG-3')(分别是SEQIDNO:5和SEQIDNO:6)，将原核密码子优化形式的AviTag肽序列(SEQIDNO4)以氨基末端方式与PVII开放阅读框(pVIIORF)连接。以如上文所述的相同方式，分别使用引物对FLAG-pVII-frwd/FLAG-pVII-rev(5‘-CCGGCTAAGTAACATGGACTACAAAGATGACGATGACAAAATGGAGCAGGTCG-3/5‘-CGACCTGCTCCATTTTGTCATCGTCATCTTTGTAGTCCATGTTACTTAGCCGG-3‘)(分别是SEQIDNO7和SEQIDNO8)和HIS6-pVII-frwd/HIS6-pVII-rev(5'-CCGGCTAAGTAACATGCATCACCATCACCATCACATGGAGCAGGTCG-3'/5'-CGACCTGCTCCATGTGATGGTGATGGTGATGCATGTTACTTAGCCGG-3')(分别是SEQIDNO10和SEQIDNO11)，将大肠杆菌K12密码子优化形式的FLAG-标签(N-DYKDDDDK-C)(SEQIDNO9)和HIS6-标签(N-HHHHHH-C)(SEQIDNO:12)以氨基末端方式与pVIIORF连接。在全部情况下通过DNA测序验证各种构建体(奥斯陆大学分子生物科学系自备ABIlabDNA测序核心设施)。为确保清晰的载体背景，使用标准技术将含有修饰的PVII的BsrGI/SnaBI限制性酶切片段移入M13K07野生型或VCSM13野生型基因组中的容性限制性酶位点上。DNA构建体通过电穿孔法导入多种大肠杆菌宿主。引物设计基于使用ClustalW的M13K07(NewEnglandBiolabs序列)(SEQIDNO31)和VCSMl3(GenBank登录号AY598820)(SEQIDNO32)序列的序列比对。图2中显示修饰的AviTag-、HIS6-和FLAG-的序列。噬菌体颗粒的制备基本上如(Scott和Smith,PMID1696028)所述，从用M13K07(SEQIDNO31),VCSMl3(SEQIDNO32)构建体转化的大肠杆菌XLl-Blue扩增噬菌体。生物素酰化病毒粒子的SA珠捕获将10μ1/管链霉抗生物素蛋白珠转移至1.5ml新管并添加PBS中的500μ12%BSA(w/v)。同样，将250μ1净化的上清液或适宜量的噬菌体转移至1.5-ml管并补充以250μ12%BSA0所述管随后在室温于转轮上孵育1小时。此后，所述珠通过使用Dynal管磁性支架首先固定，洗涤所述珠3次。弃去上清液并添加0.5ml含有0.05%Tween20的PBS(PBST)至每个管。将管从支架取下并短暂涡旋混合，随后再次返回该支架。再次净化上清液并重复洗涤过程2次。从支架取下管并将250μ1封闭的噬菌体和250μ1PBST添加至每个管。所述管随后在转轮上孵育1.5小时/室温。所述管在如上文所述的PBST中洗涤3次。随后将0.5ml含有抗Μ13MAb-HRP(12000)的PBST添加至每个管并且所述管在转轮上孵育1小时/室温。所述管在如上文所述的PBST中洗涤3次。随后将0.5ml的2,2'-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)添加至每个管并将所述管留在工作台上30分钟，此后置于磁性支架中并将100μ1上清液转移至MaxisorpELISA板条(丹麦罗斯基勒Nunc，Roskilde,Denmark)。随后使用TECANELISA读数仪在A4tl5nm测量吸光度。噬菌体捕获酶联免疫吸附测定(ELISA)M2和M5抗体以pH7.4的PBS中2.5μg/ml至5μg/ml的浓度在4°C吸附至MaxiSorp微量定平板板孔(Nunc，Roskilde,Denmark)过夜。板孔用PBS中的2%脱脂乳(w/v)在室温封闭1小时，随后添加病毒粒子制备物并使其在室温反应1至2小时，随后用抗M13-HRP(15，000)在室温检测捕获的病毒粒子。在每个步骤之间，用PBST板孔洗涤3次。板孔以ABTS底物显色并在30分钟后于A4tl5nm处读取吸光度。结果A-辅助噬菌的滴定16ml2XYT用XLl-Blue新鲜培养物接种并在37V/250转/分钟孵育至A600nmO.4-0.8。将10μ1每份稀释的噬菌体制备物转移至96孔微量滴定平板。将190μ1XLl-Blue培养物转移至含有噬菌体稀释剂的各板孔。平板在37°C孵育50分钟。BA82/20膜覆盖在LB-卡那霉素抗性琼脂培养皿上，将3μ1/样品体积点于该膜上并将培养皿在37°C/ON孵育。计数菌落(图3)。B-插入的肽Avi标签的可接近性和官能性BirA酶是乙酰辅酶A-羧化酶并内源地存在于全部大肠杆菌中。已经证实向这类细胞导入噬菌体背景下的AviTag产生由内源性BirA所致的低水平(约7%)靶生物素化(Sholle等人，PMID16628754)。16628754).为检验氨基端pVII修饰是否实际地有功能的，从而病毒粒子组装并且作为BirA的酶底物发挥作用，我们检验了使用SA包被的磁珠是否可能从粗制上清液捕获所得的病毒粒子。Dynal链霉抗生物素蛋白珠捕获M13K07_Avi标签pVII。在本测定法中使用两种噬菌体。由源于宿主的内源性BirA体内生物素酰化的M13K07-AviTag宿主和M13K07野生型。结果清楚地显示特异性SA捕获，而M13K07(SEQIDNO31)不结合。因而，AviTag-pVII融合物实际上必然是有功能，在这个意义上说，它如野生型PVII那样适应病毒粒子的需要，同时氨基端AviTag是BirA酶可接近的并且被识别为生物素化的底物(图4)。FLAG-标签进行ELISA测定以通过两种抗FLAG抗体M2和M5捕获噬菌体显示FLAG-标签作为M13K07中pVII融合物的可接近性。在该测定法中，包括野生型M13K07、M13K07_His和M13K07-AviTag(图5)。His-标签检验了M13k07_HIS6和VCSM13-HIS6对DynalTalon珠(IMAC基质)的特异性结合.简而言之，Talon珠通过与2%BSA孵育30分钟伴以转动进行封闭。洗涤珠子并且添加250μ1滴度匹配的BSA-封闭的噬菌体上清液(对应于2XIOltlCfukanVml)和在转轮上再孵育30min/室温。在PBST中洗涤后，将抗M13MAb-HRP(12000稀释)添加至每个管并且所述管在转轮上再孵育45分钟/室温。洗涤后，将ABTS添加至每个管并孵育15分钟/室温，随后置于磁性支架中。将体积100μ1的每种溶液转移至MaxisorpELISA板条。使用TECANELISA读数仪在A4tl5nm测量吸光度。结果真实地说明含有HIS6_pVII的病毒粒子偏好地结合至Ni-NTA磁珠。即便存在可以通过优化测定法予以克服的低信号，然而同族的病毒粒子确实与M-NTA基质差异性结合。这种特殊pVII融合物最有吸引力的应用是可能将它与例如离心柱组合用于Ni-NTA纯化，以及Ni-NTA基质的位点特异性并且因而均质定向固定(图6)。实施例2.修饰的辅助噬菌体在噬菌粒包装中的官能性本发明的前景是修饰的辅助噬菌体用于功能地包装噬菌粒的用途，其中所述的噬菌粒在除pVII之外的噬菌体衣壳蛋白上、优选在pill或pVIII中展示折叠的结构域。以下的实施例支持具有与PVII融合的不同肽的修饰的辅助噬菌体能够进行功能性噬菌粒包装并且这些噬菌粒展示有功能PVII肽融合物以及与这些噬菌粒的PlII衣壳蛋白融合的有功能的折叠结构域。以这种方式，所述实施例还适用于利用噬菌粒的双特异性展示。试剂全部培养基和缓冲液基本上如Sambrook等人《分子克隆实验手册》(Molecularcloning-.alaboratorymanual(ColdSpringHarborLaboratoryPress))中Β^ΙΙΙο抗M13-HRP抗体和Μ2和Μ5抗体分别从GEHealthcareBio-SciencesAB(乌普萨拉，瑞典)和Sigma-Aldrich(奥斯陆，挪威)购买，而F23.2和GBl13抗体是来自B.Bogen教授(挪威奥斯陆大学免疫学研究所)的友好惠赠。Dyna珠MyOne-链霉抗生物素蛋白磁珠从Invitrogen(奥斯陆，挪威)购买。BSA和Tween20从Sigma-Aldrich(奥斯陆，挪威)购买。半抗原与BSA结合的2-苯基噁唑基-5-酮(phOx)基本上如其他处(Makela等人，PMID；722243)所述制备。细菌菌株，噬菌体大肠杆菌菌株XLl-Blue从Stratagene(Lajolla，CA，美国)购买。M13K07辅助噬菌体从GEHealthcareBio-SciencesAB(乌普萨拉，瑞典)购买。携带scFv的噬菌粒pSEX81(SEQIDNO29)由艾菲技术公司(AffitechAS)(奥斯陆，挪威)友好提供，其中所述的scFv具有针对偶联于牛白蛋白的2-苯基噁唑-5-酮(phOx)的特异性。pFKPDN-scTCRVaβ4Β2Α1在(LOset等人2007，PMID17925331)(SEQIDNO28)中描述。噬菌体颗粒的制备通过如(Welschof等人，PMID9050877和Koch等人，PMID11126120)描述的点滴定法监测利用M13K07辅助噬菌体的从大肠杆菌XLl-Blue拯救噬菌粒和病毒粒子装配。噬菌体捕获酶联免疫吸附测定(ELISA)单克隆抗体M2、M5、F23.2、GB113、ph0x_BSA以ρΗ7.4的PBS中2.5μg/ml至5μg/ml的浓度在4°C吸附至MaxiSorp微量定平板板孔(Nunc，Roskilde,Denmark)过夜。板孔用PBS中的2%脱脂乳或2%BSA(w/v)在室温封闭1小时，随后添加病毒粒子制备物并使其在室温反应1至2小时，随后用抗M13-HRP(15,000)在室温检测捕获的病毒粒子。在每个步骤之间，用PBST板孔洗涤3次。板孔以ABTS底物显色并在30分钟后于A4tl5nm处读取吸光度。结果A-通过修饰的M13K07包装并滴定噬菌粒使用具有不同的折叠结构域的两种噬菌粒pFKPDNscTCRVaP4B2A1和pSEX_scFv抗phOx，分别展示作为pill融合物的scTcR和scFv。两者皆以3种修饰的野生型M13K07辅助噬菌体和野生型M13K07辅助噬菌体包装。简而言之，这两种噬菌粒克隆的过夜培养物用修饰的辅助噬菌体和野生型辅助噬菌体感染。孵育后，将培养物离心并将细菌沉淀重悬于含氨苄青霉素和卡那霉素的YT培养基并在30°C进一步孵育。通过离心净化的上清液用于下游过程。大肠杆菌XL-IBlue用噬菌体稀释液感染并涂布在氨苄青霉素和卡那霉素霉素上用于分别滴定滴定噬菌粒和辅助噬菌体(图7)。两种包装的噬菌粒显示高比率，表明借助3种修饰的M13K07辅助噬菌体模式的成功和功能性包装。B-由噬菌粒pill展示中辅助噬菌体提供的pVII的官能性pVII-Avitag展示就AviTag-pVII官能性而言，基本上如实施例1中所述那样实时在珠上捕获SA。尽管信号低，然而确实存在含有AviTag-pVII的病毒粒子的特异性差异捕获(图8)。与阳性对照(插图)相比较，显而易见当二者均携带AviTag-pVII融合物时，噬菌粒病毒粒子上的生物素化水平低于M13K07病毒粒子上的生物素化水平。然而，已知在噬菌体背景下内源性AviTag生物素化在37°C仅为7%范围内(Scolle等人PMID16628754)。尽管在37°C确实包装出M13K07_AviTag，然而仅在30°C进行了噬菌粒拯救，这强烈地提示观察到的差异归因于在较低的温度上内源性BirA活性本身较低。因此，为进步利用病毒粒子生物素化，必须提高效率以利用这个特征。这可以方便地通过病毒粒子体外生物素化做到，使用标准技术，这应当导致接近100%的生物素化(Scolle等人PMID16628754)。备选地，可以通过过量表达BirA酶进行体内生物素化。已知因超转化大肠杆菌从而不止噬菌粒或噬菌体基因组载体存在于相同的细胞中，这可以导致将标准质粒包装至病毒粒子中并因而造成基因型-表型联系的丢失。如果从质粒过量表达BirA，情况将会如此。为评估单个克隆，这可以接受，不过当该方法与组合库联合时，这是不可接受的，因为它可能导致淘洗期间挽回的表型变体丢失。备选地，BirA可以因染色体整合而过量表达，其中所述的染色体整合如由大肠杆菌MC1061-衍生的AVB100菌株(美国科罗拉多州阿威帝提(Ayidity，C0，USA))提供。然而，该菌株缺乏编码与噬菌粒系统无关的F菌毛结构的F质粒。然而，AVB100恰恰与基于噬菌体基因组的载体兼容，这不需要辅助噬菌体补充。为采用AVB100菌株以进一步配合与修饰的M13K07辅助噬菌体组合的基于噬菌粒的噬菌体展示，我们因而通过标准接合法将AVB100与XLl-Blue交配(实施例5)。pVII-Flag展示开展ELISA分析以通过两种抗FLAG抗体M2和M5捕获噬菌粒病毒粒子证实两种不同噬菌粒pFKPDNscTCRVaβ4Β2Α1(A)和pSEX-scFv抗phOx(B)中FLAG-标签作为pVII融合物的可接近性。简而言之，抗体在4°C包被于ELISA平板上。洗涤该平板并将噬菌粒制备物在室温于该平板上孵育2小时。将该平板洗涤并与抗M13胃结合抗体进一步孵育。在洗涤该平板后，添加可溶性ABTS并在室温孵育30分钟，产生信号(图9)。对用M13K07-FLAG包装的噬菌粒衍生病毒粒子获得FLAG特异反应性，而全部其他样品呈阴性。即，包装的噬菌粒衍生病毒粒子将FLAG标签展示为功能pVII-融合物。A.pIII噬菌粒展示的官能性对两种不同的噬菌粒衍生病毒粒子pFKPDNscTCRVaβ4B2A1和pSEX_scFv抗PhOx,二者均展示AviTag(图10)、FLAG-标签(图11)和HIS6-标签(图11))分别分析scTcR和scFvpIII-融合物的功能性展示。借助特异性靶MABGBl13捕获噬菌粒病毒粒子进行ELISA分析，所述的MABGBl13结合scTCR和针对scFv抗phOx(SEQIDNO26)的phOx-BSA。使用BSA作为封闭物并使用由野生型M13K07拯救的噬菌粒作为对照。简而言之，所述靶在4°C包被于ELISA平板上。洗涤该平板并将噬菌粒制备物在室温于该平板上孵育2小时。将该平板洗涤并与抗M13胃结合抗体进一步孵育。用ABTS并在室温孵育30分钟产生信号，随后测量在A4tl5nm的吸光度(图10和图11)。结果显示对全部包装的噬菌粒获得同族抗原反应性。该分析因而证实修饰的辅助噬菌体不影响PlII展示，而仅向完全相同的病毒粒子上的pVII蛋白提供定义的表型。实施例3.在pill和pVII上的基因组噬菌体展示本发明允许产生在pVII衣壳蛋白上具有展示特性的基因组噬菌体载体。这种展示将象PlII展示一样不影响病毒粒子的感染性。此外，本发明促进在pVII和pIII/pVIII上或甚至同时促进在全部3种衣壳蛋白上的双特异性展示。以下实施例支持基因组噬菌体展示系统中在PlII和PVII上的双特异性展示，其中所述的基因组噬菌体展示系统显示该构建体在增殖、病毒粒子装配、病毒粒子浓缩、PiII展示表型方面完全象野生型噬菌体那样发挥作用并且它确实在PVII肽融合物处被选择性地体内生物素酰化。试剂全部培养基和缓冲液基本上如Sambrook等人《分子克隆实验手册》(Molecularcloning-.alaboratorymanual(ColdSpringHarborLaboratoryPress))中ΜΙ^ΙοM13-HRP抗体从GEHealthcareBio-SciencesAB(乌普萨拉，瑞典)购买，并且F23.2和GBl13抗体是来自B.Bogen教授(挪威奥斯陆大学免疫学研究所)的友好惠赠。限制酶(RE)从NewEnglandBiolabs(Ipswich,MA,USA)购买，DpnI例夕卜，它从Stratagene(Lajolla，CA，美国)获得。DNA寡聚物从MWGBiotechAG(埃伯斯伯格，德国)购买。Dyna珠MyOne-链霉抗生物素蛋白磁珠从Irwitrogen(奥斯陆，挪威)购买。dm5CTP来自加拿大伯灵顿佛曼塔斯公司(Fermentas)(Burlington,Canada)。BSA和Tween20从Sigma-Aldrich(奥斯陆，挪威)购买。PfuTurboDNA和PhusionDNA聚合酶分别从Stratagene(Lajolla，CA，美国)和Sigma-Aldrich(奥斯陆，挪威)购买。QIAquickPCR清洁试剂盒来自Qiagen(Qiagen，Hilden，德国)。细菌菌株，噬菌体大肠杆菌菌株XLl-Blue从Stratagene(LaJolla，CA，美国)购买，而大肠杆菌菌株MC1061和K91K是来自G.P.Smith博士(美国密苏里大学生物科学分校)的友好馈赠。携带scFv的噬菌粒pSEX81(SEQIDNO29)由AffitechAS(奥斯陆，挪威)友好提供，其中所述的scFv具有针对偶联于牛白蛋白的2-苯基噁唑-5-酮(phOx)的特异性。fUSE5-scTCRVa34Β2Α1ρΙΙΙ展示载体在(LOset等人2007，PMID:17925331)中描述。AviTag-pVII的设计和体外诱变使用GCUA月艮务器(http://gcua.schoedl.de/seqoverall.html),将AviTag(N-MSGLNDIFEAQKIEffHE-C)的可读框(ORF)与大肠杆菌K12菌株中的密码子选择比较。通过QuikChange体外诱变，根据制造商的技术手册(Stratagen，LaJolla，CA，美国)，使用引物对BirA-pVII_frwd/BirA-pVII_rev(5‘-CCGGCTAAGTAACATGTCCGGCCTGAACGATATCTTTGAAGCGCAGAAMTTGAATGGCATGAMTGGAGCAGGTC-3‘/5‘-GACCTGCTCCATTTCATGCCATTCAATTTTCTGCGCTTCAAAGATATCGTTCAGGCCGGACATGTTACTTAGCCGG-3')(分别是SEQIDNO:5禾口SEQIDNO:6)，将原核密码子优化形式的AviTag肽序列以氨基末端方式与pVIIORF连接。为确保清晰的载体背景，使用标准技术将含有修饰的PVII的BsrGI/SnaBI限制性酶切片段克隆到未修饰的fUSE5-scTCRVa^4B2AlpIII基因组中的容性限制性酶位点上。DNA构建体通过电穿孔法导入大肠杆菌MC1061。引物设计基于公开的fUSE5序列(GenBank登录号AF218364)(SEQIDNO30)。新基因组pVII展示载体pGVII和pGVIIΔL的构建引物设计和载体装配基本上如无缝(SeamLess)方案(Stratagene，Lajolla，CA,美国)中所述进行。使用作为平板的VCSM13基因组DNA(SEQIDNO32)和引物对VCSM13_FNCSMl3_R(5'-ATCTCTTCCATGGAGCAGGTCGCGGATTTCGACACAATTTATCAGG-3'/5'-ATCTCTTCCATGTTACTTAGCCGGAACGAGGCGCAGAC-3')(分别是SEQIDNO19和SEQIDNO:20)，用PfuTurbo聚合酶基本上如SeamLess方案(Stratagene，Lajolla，CA，美国)中所述那样PCR扩增完整基因组。同样，均携带scFv抗phOx(SEQIDNO:26)单位的pSEX81ΔL(稍后在实施例4中描述)和pSEX81(SEQIDNO29)用作使用PhusionDNA聚合酶(Sigma，奥斯陆，挪威)的标准PCR中的模板以scFv单位扩增，其中所述的标准PCR具有引物对pGALDL_F/pGAL_R(5'-TCTCTTCACATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAG-3'/5'-ATCTCTTCCCATTCTGATATCTTTGGATCCAGCGGCCGCAC-3‘)分别是SEQIDNO22禾口SEQIDNO23)禾口pGAL_F/pGAL_R(5'-ATCTCTTCACATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGC-3'/5'-ATCTCTTCCCATTCTGATATCTTTGGATCCAGCGGCCGCAC-3')(分别是SEQIDN0:21和SEQIDN0:23)。PCR后，全部3种片段由PCR纯化试剂盒(Qiagen，GmbH，Hilden，德国)纯化并用EarI进行限制酶消化。随后使用标准技术将RE消化的凝胶纯化的片段连接并电穿孔至XLl-Blue中。扩增菌落和在使用弓I物对pVII_frwd/pVII_rev(分别是5‘-AGCAGCTTTGTTACGTTGATTTGG-3'/5'-GCAGCGAAAGACAGCATCG-3‘)(分别为SEQIDNO:24禾口SEQIDNO25)的标准PCR中通过PCR筛选验证正确的插入物大小。基因组pVII展示载体由pGVII(具有信号序列依赖性scFv-pVII展示)和pGVIIΔL(具有无任意信号序列的scFv-pVII展示)表示。这些载体现在含有scFvORF作为符合可读框的pVII氨基端融合物并保留其起始密码子相对于上游PVORF的正确位置，其中所述的pVORF对正常转录和翻译重要。值得注意地，这些噬菌体基因组载体的装配可以如此容易地通过一个三步骤PCR装配产生，其中PCR扩增具有互补于载体主链的5'-引物标签突出端的外源性0RF，其中可以通过PCR重叠延伸拼接(SOE)法将所述5'-引物标签突出端与从该载体中包含插入位点的5'-和3'部分扩增的互补性片段剪接起来。噬菌体基因组的理想部分应当覆盖包含两个单一限制酶位点BsrGI/SnaBI的片段，其中发现所述限制酶位点BsrGI/SnaBI在全部Ff基因组中分布于pVIIORF两侧。限制酶消化的SOE产物随后可以方便地插入互补性限制酶消化的载体主链，如实施例1和3中所述。另一个便利装配途径将是完全通过短重叠寡核苷酸产生适宜融合ORF的人工基因装配物，其中可以将所述短重叠寡核苷酸作为一个整体(asonepot)复性、连接并由侧翼引物进行PCR扩增。改厕了可以产生与SOE法相同的片段或不依赖于限制酶，其中插入噬菌体基因组可能依赖于例如重组，如(Tillett和Neilan，PMID10481038)所述。也可以容易地构思所述计数的综合。噬菌体颗粒的制备基本上如(Scott和Smith，PMID1696028)所述，从大肠杆菌MC1061扩增fUSE5噬菌体。通过如(Scott和Smith,PMID1696028和Koch等人，PMID11126120)所述的点样滴定法监测病毒粒子装配。在可用的情况下，通过如Sambrook等人《分子克隆实验手册》(Molecularcloning:alaboratorymanual(ColdSpringHarborLaboratoryPress))中所述的PEG/NaCI沉淀纯化和浓缩病毒粒子。噬菌体捕获酶联免疫吸附测定(ELISA)F23.2，GBl13抗体以pH7.4的PBS中2.5μg/ml至5μg/ml的浓度在4°C吸附至MaxiSorp微量定平板板孔(Nunc，Roskilde,Denmark)过夜。板孔用PBS中的2%脱脂乳(w/v)在室温封闭1小时，随后添加病毒粒子制备物并使其在室温反应1至2小时，随后用抗M13-HRP(15，000)在室温检测捕获的病毒粒子。在每个步骤之间，用PBST板孔洗涤3次。板孔以ABTS底物显色并在30分钟后于A4tl5nm处读取吸光度。A-fUSE5-scTCR-亲和标签基因组噬菌体的滴定野生型和pVII-修饰的fUSE5-scTCRVa@4B2Al形式均不显示任何宿主毒性。pVII-修饰的fUSE5-scTCRVa^4B2Al形式之间在病毒粒子产生和PEG沉淀效率方面不存在表型差异。PVII-修饰的fUSE5-scTCRVa^4B2Al形式产率接近于用fUSE5系统可实现的最大理论滴度(图12)。B-fUSE5-VII-AviTag融合肽的官能性该ELISA分析旨在通过链霉抗生物素蛋白珠捕获病毒粒子、随后由抗M13-抗体检测已结合的噬菌体而检验基因组噬菌体制备物的官能性。简而言之，MyOne链霉抗生物素蛋白dyna珠用BSA封闭、洗涤并且与滴度归一化的具有(scTCR/pVII-AviTag)和没有(scTCR/pVIDpVII-Avitag融合物的fUSE5噬菌体样品孵育。洗涤珠子并用抗M13-HRP结合抗体检测结合的噬菌体。通过添加ABTS产生信号并使用TECANELISA读数仪在A4tl5nm测量该信号。结果表明PVII-BirA肽是可接近的并已经生物素酰化，并且因而充当噬菌体基因组衍生的病毒粒子的固定和检测标签(图13)。C-fUSE5-scTCRpill-融合物的官能性该ELISA分析旨在检验具有和没有基因组编码的AviTag-pVII的噬菌体基因组衍生病毒粒子制备物的PlII融合物官能性。通过分别识别scTCRVaβ4Β2Α1)(SEQIDNO:28)的两种不同抗体MABGB113和F23.2捕获噬菌体病毒粒子开展ELISA分析。使用脱脂乳作为阴性对照。简而言之，抗体在4°C包被于ELISA平板上。洗涤该平板并将滴度归一化的噬菌体制备物在室温于该平板上孵育2小时。将该平板洗涤并与抗M13胃结合抗体进一步孵育，随后添加100μ1ABTS并在室温孵育。20分钟后，使用TECANELISA读数仪在A4tl5nm测量吸光度。结果显示scTCR表型在两种fUSE5形式之间是不可区分的。因而，pVII修饰似乎在任何方面没有影响噬菌体的表型(图14)。实施例4:pVII上的噬菌粒展示试剂全部培养基和缓冲液基本上如Sambrook等人《分子克隆实验手册》(Molecularcloning-.alaboratorymanual(ColdSpringHarborLaboratoryPress))中Β^ΙΙΙο抗M13-HRP抗体从GEHealthcareBio-SciencesAB(乌普萨拉，瑞典)购买，并且GB113抗体是来自B.Bogen教授(挪威奥斯陆大学免疫学研究所)的友好惠赠。限制酶(RE)从NewEnglandBiolabs(Ipswich,MA,USA)购买，DpnI例夕卜，它从Stratagene(Lajolla，CA，美国)获得。DNA寡聚物从MWGBiotechAG(埃伯斯伯格，德国)购买。BSA和Tween20从Sigma-Aldricn(奥斯陆，挪威)购买。PfuTurboDNA聚合酶从Stratagene(LaJolla，CA，美国)购买。基本上如其他处(Makela等人，PMID;722243)所述制备与BSA结合的半抗原2-苯基噁唑基-5-酮(phOx)和5-硝基苯乙酰(NIP)。异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖昔(IPTG)从Fermentas(力口拿大Burlington)购买。细菌菌株，噬菌体和噬菌粒大肠杆菌菌株XLl-Blue从Stratagene(LaJolla，CA，美国)购买。M13K07辅助噬菌体从GEHealthcareBio-SciencesAB(乌普萨拉，瑞典)购买。携带scFv的噬菌粒pSEX81(SEQIDNO29)由AffitechAS(奥斯陆，挪威)友好提供，其中所述的scFv具有针对偶联于牛白蛋白的2-苯基噁唑-5-酮(phOx)的特异性。fUSE5-scTCRVa^4B2AlpIII展示噬菌粒在他处(LOset等人2007，PMID17925331)描述。携带scFv抗NIP的原核表达载体pSGl(SEQIDNO27)(未发表)基于pH0G21(Kiprianov等人，PMID=9005945)并且从抗体可变基因自行产生，所述的抗体可变基因衍生自PLN0H2和pLNOK(Norderhaug等人，PMID9202712)。新pVII展示噬菌粒载体pGALD7和pGALD7ΔL的构建选择上述的pSEX81(SEQIDNO29)噬菌粒(GenBank登录号Y14584)作为载体主链的起始模板。首先，为除去该载体中的原核PelB信号序列(N-MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA-C)(SEQIDNO:33)编码片段，使用引物对a41g-frwd/a41g-rev(5'-AGAGGAGAAATTMCCATGGAATACCTATTGCCTACGGC-3'/5'-GCCGTAGGCAATAGGTATTCCATGGTTAATTTCTCCTCT-3‘)(分别是SEQIDN0:13iPSEQIDNO:14)通过QuikChange体外诱变将限制酶位点NcoI导入氨基最末端，因而将pelBORF中第二密码子的第一核苷酸从A改变成G。诱变后，该载体用NcoI消化、再连接并用做第二PCR中的模板，其中所述的第二PCR使用引物对pH0G_EcoRI_frwd/scTCR_rev(5'-TAGCTCACTCATTAGGCACCC-3/5‘-TTTGGATCCAGCGGCCGC-3‘)(分别是SEQIDN0:15和SEQIDNO16)回收该载体的相关部分。随后使用标准技术将该PCR片段移入原始的pSEX81(SEQIDNO29)的相容性限制酶位点EcoRI/Hindlll并通过DNA测序证实。该步骤完全除去PelB信号序列编码部分，不过保留起始密码子和与对于转录和翻译重要的IacPO和Shine-Dalgarno序列(SD)的相对位置，以及仅在原始pSEX81(SEQIDNO29)中存在的限制酶位点NcoI/NotI所限定的外源性序列之前添加一个Ala残基。新构建体称作PSEX81ΔL0其次，使用5'末端加限制酶位点标签的引物对pVH_EC0RV/pVII_NheI(5‘-ATATGATATCAGAATGGAGCAGGTCGCGGATTTCG-3/5‘-ATATGCTAGCTTATCATCTTTGACCCCCAGCGATTATACC-3‘)(分别是SEQIDNO17和SEQIDNO18)从M13K07扩增pVII编码序列。随后将该PCR片段移入pSEX81(SEQIDNO29)和pSEX81ΔL噬菌粒的相容性限制酶位点，因而交换这二者中的PlII编码区并产生原始PSEX81(SEQIDΝ0:29)中NcoI/Notl限定的表达盒的氨基端符合可读框的pVII融合物。所述新构建体通过DNA测序证实并分别称作PGALD7和pGALD7ΔL。为了将如上所述噬菌粒中的scFv抗phOx(SEQIDNO26)单位转换成分别来自pFKPDN和pSGl的scTCRVaβ4Β2Α1和scFv抗NIP(SEQIDNO27)单位，使用准技术如交换NcoI/Notl限定的表达盒那样做到这一点。使用标准技术，通过电穿孔法将本文所述的全部噬菌粒导入大肠杆菌XLl-Blue。噬菌体颗粒的制备通过如(Welschof等人，PMID9050877和Koch等人，PMID11126120)描述的点滴定法监测利用M13K07辅助噬菌体的从大肠杆菌XLl-Blue拯救噬菌粒和病毒粒子装配。噬菌体捕获酶联免疫吸附测定(ELISA)单克隆抗体GB113、ph0x-BSA或NIP-BSA以pH7.4的PBS中2.5μg/ml至5μg/ml的浓度在4°C吸附至MaxiSorp微量定平板板孔(Nunc，Roskilde,Denmark)过夜。板孔用PBS中的2%脱脂乳或2%BSA(w/v)在室温封闭1小时，随后添加病毒粒子制备物并使其在室温反应1至2小时，随后用抗M13-HRP(15,000)在室温检测捕获的病毒粒子。在每个步骤之间，用PBST板孔洗涤3次。板孔以ABTS底物显色并在30分钟后于A4tl5nm处读取吸光度。结果受到来自上文所述修饰的辅助噬菌体的结果鼓舞，还评估了折叠结构域的pVII展示。由于Gao等人和Kwasnikowski等人均已经证实与信号序列指导的周质靶向作用组合使用时，允许这种展示，故我们构建了两种称作PGALD7和pGALD7ΔL的新噬菌粒，它们分别允许具有和没有这种信号序列的氨基端PVII展示(图15)。初始构建体含有基于人抗体可变区段并对半抗原结合物phOx-BSA特异的scFv单位。就先前所述PVII修饰的辅助噬菌体而言，scFv的pVII展示不应当干扰正常病毒粒子装配。因而，使用如材料与方法中所述的标准噬菌粒拯救和滴定，我们比较了具有和没有信号序列的这些scFv抗phOxpVII展示噬菌粒的性能并且还与具有和没有信号序列的标准PlII展示比较。(图16)滴定结果确实显示在全部情况下产生了含有噬菌粒的病毒粒子。然而，在pVIIAL噬菌粒产生低于标准PlII展示约30倍的滴度的情况下，信号序列指导的pVII展示存在大约IO5倍降低。由于pVII的野生型互补作用因该系统中的辅助噬菌体而存在，该研究结果是令人惊讶且重要的，因为这表明信号序列指导的PVII展示(pVII)严重干扰病毒粒子装配过程，而在无信号序列的PVII展示(ρνΙΔ)的情况下这种作用仅是微小的。与之相比，具有和没有信号序列的PiII展示之间的滴度差异仅是微小的。基于以上测定的滴度，我们随后在使用滴度归一化的输入物的phOx-BSA特异性ELISA中评估这些病毒粒子样品上的功能scFv展示，除了未稀释即使用的pGALD7-衍生样品之外，因为该噬菌粒滴度极低(图17)。该结果清楚地显示来自无信号序列的pVII形式和标准pill的有功能scFv展示，而其余样品呈阴性。因2000倍更少的病毒粒子输入量，故期望信号序列指导的pVII展示产生阴性结果。已知PlII经SEC途径输出至周质，因而无信号序列的pill形式产生周质靶向作用缺陷的PiII融合物，其中所述的周质靶向作用是掺入病毒粒子的前提。因而，来自该样品的病毒粒子仅含有辅助噬菌体衍生的PiIι(物理表型-基因型关联丢失)，尽管噬菌粒包装效率接近正常并且产生正常滴度(如图16中所见)。尽管无信号序列的PVII形式和标准pill展示产生功能展示，然而显而易见具有pill的抗原结合能力似乎更强。这实际上不反映PlII形式的官能性更高，因为已经充分报道标准PlII展示使得SCFv单位的单价至多价展示混合，这导致亲和力效应(Bradbury和Marks，PMID:15261570)。此类效应掩蔽了所述相互作用的真实的内在亲和力，并且尽管scFv单位经常因优异的表达谱而优选，然而广泛报道的是例如较低表达的Fab形式(意味较少单位/每个病毒粒子)在亲和选择时产生强得多的结合物(deHaard等人，PMID10373423和Hoogenboom，PMID16151404)。因而来自PGALD7ΔL的较低信号反倒可能更接近于单价scFv展示，这可能对众多应用是有利的。本文所用的全部噬菌粒中的scFv-pVII/pIII表达盒由Iac启动子控制并且使用标准方案在无IPTG诱导下进行病毒粒子包装(Welschof等人，PMID=9050877)，因而，通过包装期间使用IPTG驱动更强的表达增加scFv展示应当是可能的。另外，噬菌粒噬菌体展示的一个重要特征是以下事实功能展示依赖于辅助噬菌体介导的噬菌粒拯救。因此，与基于噬菌体基因组的展示相反，存在可以从给定细胞-噬菌粒或辅助噬菌体基因组被包装到病毒粒子中的两种ssDNA来源。重要地，两种类型的病毒粒子将获得完全相同的衣壳蛋白结合，因为它们在完全相同的宿主细胞中产生和存在。为确保形成组合噬菌体展示技术真正基础的物理基因型_表型联系的保护，噬菌粒-对-辅助噬菌体比例有利于噬菌粒因而是最重要的。在一个新实验中，我们制备了与上文所述相同的噬菌粒衍生样品，不过现在还在具有和没有包装期间所包含的IPTG情况下比较病毒粒子装配。在滴定期间，我们此时还通过辅助噬菌体基因组上存在的卡那霉素抗性将辅助噬菌体基因组滴度作图。就噬菌粒滴度而言，当在标准条件比较不同的噬菌粒时，现有滴定结果(图18A)显示与先前包装作用(图16)完全相同的趋势，不过这次ρ6Α)7Δ(ρνΙΔ)和pGALD7(pVII)均具有更高的滴度。当IPTG诱导pVII或pill表达时，全部噬菌粒均表现滴度下降，不过这种效应对信号序列指导的pVIIpGALD7噬菌粒是最严重的。在将噬菌粒-对-辅助噬菌体比率作图(图18B)并在标准条件(IPTG不存在)下比较不同噬菌粒时，全部样品表现在正常范围内并有利于噬菌粒的比率，除了信号序列指导的pVIIpGALD7噬菌粒之外，该噬菌粒表现表型-基因型联系的完全丢失。IPTG诱导时，表型-基因型解偶联对于PGALD7噬菌粒甚至更明显，并且无信号序的pill(ρΙΙΙΔ)现在也微小程度地表现这种特征(比率0.5)。然而，构建体？111^就？111展示而言仍没有功能并仅将它包含作为对照。基于图18A中所示的噬菌粒滴度，我们随后在类似于图18A中所示那样的phOx-BSA特异性ELISA中评估pGALD7DL和pGALD7病毒粒子的功能scFv展示。使用归一化的滴度输入物。该结果的确表明用无信号序列的pGALD7ΔL再次实现了功能scFv-pVII展示，并且phOx-BSA反应性在IPTG驱动的pVII融合物表达时显著升高。这种抗原反应性升高最可能反映每个病毒粒子的PVII融合物数目提高以及携带pVII融合物本身的病毒粒子的数目提高。后一种情况是可能的，因为已知在标准PlII展示中仅1至10%之间的含有噬菌粒的病毒粒子实际含有融合物(Bradbury和Marks，PMID:15261570)。另一方面，信号序列指导的PVII展示再次没有显示功能性phOx-BSA结合。基于图18B，在IPTG非诱导的样品中观察到的弱抗原反应性必定归因于含有携带低水平PVII融合物的辅助噬菌体的病毒粒子。迄今，我们清楚地展示了基于功能性pVII噬菌粒的scFv抗phOx(SEQIDNO26)单位展示并且该构建体是与相同scFv的pill展示可比较的，其中所述的pill展示仅显示噬菌粒滴度和抗原结合能力的微小下降。已经针对人抗体scFv文库选择scFv抗phOx(SEQIDNO26)并且已知它在大肠杆菌中表达得相当好(Marks等人，PMID=1748994)。为弄清pVII展示是否显示功能性展示更有挑战性的融合对应物的能力，我们因而将基于小鼠杂交瘤抗体可变基因的scFv抗NIP(SEQIDNO27)以及基于源自小鼠T细胞克隆4B2A1的可变基因的scTCR(10set等人，PMID17925331)亚克隆至pGALD7ΔL和pGALD7中。众所周知众多杂交瘤可变基因在大肠杆菌中没有良好表达并且被噬菌体展示时也是如此(Krebber等人，PMID:9032408)，并且T细胞受体归属于已证明特别难以适应噬菌体展示的折叠蛋白质(Li等人，PMID=15723046,和LOset等人，PMID17925331)。来自这些新噬菌粒的病毒粒子通过标准噬菌粒拯救制备并在ELISA中检验其抗原结合能力(图20)。该结果的确表明用scFv抗NIP(SEQIDNO27)和scTCRVaβ4Β2Α1实现了功能性pVII展示，并且与先前用SCFV抗phOX(SEQIDNO:26)观察到的结果相反，在具有和没有信号序列指导的PVII展示时情况均是如此。没有直接比较图20中观察到的信号，尽管在分析之前没有将病毒粒子滴度归一化。根据SCFV抗phOX(SEQIDNO26)的信号序列指导的pvii展示的完全无功能性本质，滴定上述样品并测定噬菌粒-对-辅助噬菌体比率(图21)。噬菌粒滴度再次证明与信号序列指导的pVII展示相比，无信号序列的pVII展示(PGALD7ΔL)显示优异性能(图21Α)。这对于scTCR和scFv抗NIP确实如此，不过与观察到的scFv抗phOx滴度相比，差异较不明显(见图6和图8)。当比较噬菌粒-对-辅助噬菌体比率时，PGALD7AL在scTCR和scFv抗NIP(SEQIDNO27)的例子中再次以极有利于噬菌粒的比率显示优异性能(图21B)。从这些比例中，对scTCR和scFV抗NIP(SEQIDNO27)没有看到随scFv抗ph0x(SEQIDNO26)所观察到的基因型-表型联系严重丧失(图18对图21B)。然而，PGALD7AL无疑是优异的。鉴于以上结果，值得注意的是在病毒粒子包装期间的宿主细胞增殖方面scTCR与scFv抗NIP之间存在极明显的差异(图22)。从图22显而易见在含有pGALD7ΔL的培养物仅微弱地影响宿主细胞增殖的情况下，宿主细胞生长被含有PGALD7噬菌粒的克隆显著抑制。这有力地表明来自信号序列指导的PVII展示噬菌粒的宿主毒性，而一旦除去这种信号序列，则没有或很少观察到这种毒性。实施例5.大肠杆菌菌株AVBIOOFmkII的构建试剂和细菌菌株全部培养基和缓冲液基本上如Sambrook等人《分子克隆实验手册》(Molecularcloning-.alaboratorymanual(ColdSpringHarborLaboratoryPress))中Β^ΙΙΙο^ζ肠杆菌菌株XLl-Blue和AVBlOO(基于MC1061)分别从Stratagene(LaJolla，CA，美国)和Avidity(Denver,C0，美国)购买。结果为获得F质粒阳性大肠杆菌AVB100(染色体StrK)，如下文将所述细胞与XLl-Blue(F质粒TetK)交配。每个菌株的单个克隆接种至补充有适宜抗生素的LB培养基并在37°C孵育过夜，伴以剧烈振摇。次日，5ml新鲜培养物在0.IA6tltlnm上激发并在37°C培育至对数中期，伴以剧烈振摇，随后将Iml每种培养物混合并在37°C静止孵育1小时。随后，将10μ1这种混合物转移至含有100μg/ml链霉素和30μg/ml四环素的5ml新鲜LB培养基并在37°C孵育过夜，伴以剧烈振摇。次日，将这种培养物的稀释液涂布在100μg/ml链霉素和30μg/ml四环素的琼脂平板上并且所得菌落用作称作AVBIOOFmkII的F质粒阳性新AVB100菌株的来源。参考文献1Endemann，H和Model，P.丝状噬菌体次要衣壳蛋白在噬菌体和感染细胞中的定位(LoccoationofFilamentousPhageMinorCoatProteinsinPhageandinInfectedCells).分子生物学杂志(JournalofMolecularBiology)250，496-506(1995).2Gao,C.等人.产生人工抗体噬菌体展示组合异源二聚体阵列的模式(Makingartificialantibodies:Aformatforphagedisplayofcombinatorialheterodimericarrays).美国科学院院刊(PNAS)96，6025-6030(1999).3KwasnikowskiP,KristensenP,MarkiewiczWT.丝状细菌噬菌体pVII次要衣壳蛋白上的多价展不系统(MultivalentdisplaysystemonfilamentousbacteriophagepVIIminorcoatprotein).免疫方法杂志(JImmunolMethods)·2005年12月20日；307(1-2)135-43.2005年10月28日电子出版·4KhalilAS,FerrerJM,BrauRR,KottmannST,NorenCJ,LangMJ,BelcherAM.单个M13细菌噬菌体系留和拉伸(SingleM13bacteriophagetetheringandstretching).美国科学院院刊(ProcNatlAcadSciUSA).2007年3月20日；104(12)4892-7.2007年3月13日电子出版.5BaneyxF,MujacicM.大肠杆菌中的重组蛋白折叠和错误折叠(RecombinantproteinfoldingandmisfoldinginEscherichiacoli).自然生物子干丨J(NatBiotechnol.)2004年11月；22(11)1399-408.6SimonsGF,KoningsRN,SchoenmakersJG.噬菌体M13基因VI、VII和IX编码病毒粒子的次要衣壳蛋白(GenesVI,VII,andIXofphageM13codeforminorcapsidproteinsofthevirion).ProcNatlAcadSciUSA.1981年7月；78(7)4194-8.7ScottJK,SmithGP.用表位文库搜索肽配体(Searchingforρ印tideligandswithanepitopelibrary).Science.1990年7月27日；249(4967):386_9.8KochJ,BreitlingF，DubelS.在消化纤维素滤膜上快速滴定丝状细菌噬菌体(M13)的多个样品(Rapidtitrationofmultiplesamplesoffilamentousbacteriophage(Ml3)onnitrocellulosefilters).生物技术(Biotechniques)·2000年12月；29(6):1196_8，2002.9KipriyanovSM,MoldenhauerG,LittleΜ.小规模大肠杆菌培养物中可溶性单链抗体的高水平产生(Highlevelproductionofsolublesinglechainantibodiesinsmall-scaleEscherichiacolicultures).JImmunolMethods.1997年1月15H；200(1-2)69-77.10WelschofΜ,TernessP,KipriyanovSM,StanescuD,BreitlingF,DorsamH,DubelS，LittleΜ,OpelzG.人IgG-抗F(ab')2自身抗体的抗原结合结构域(Theantigen-bindingdomainofahumanIgG-anti_F(ab')2autoantibody).ProcNatlAcadSciUSA.1997年3月4日；94(5)1902-7.11MichaelsenTE,AaseA,WestbyC,SandlieI.通过缺失铰链外显子增强人IgG3的补体激活禾口细胞裂解作用(EnhancementofcomplementactivationandcytolysisofhumanIgG3bydeletionofhingeexons).免疫学斯堪的纳维亚杂志(ScandJImmuhol.)1990年11月；32(5):517_28·12Nakela0，KaartinenM,PelkonenJL,KarjalainenK.^L##^个生的遗传V.小鼠中的抗2-苯基噁唑酮(InheritanceofantibodyspecificityV.Anti-2-phenyloxazoloneinthemouse).实验药物杂志(JExpMed.)1978年12月1日；148(6)1644-60.13L0setGA,LundeΕ,BogenB,BrekkeOH,SandlieI.两种小鼠α/βT_细胞受体的功能性噬菌体展示强烈地依赖于融合模式、模型和周质折叠辅助(FunctionalphagedisplayoftwomurinealphNbetaT_cellreceptorsisstronglydependentonfusionformat,modeandperiplasmicfoldingassistanc).蛋白质工禾呈设计与选择(ProteinEngDesSel.)2007年9月；20(9)461-72.电子出版2007年10月9日.14NorderhaugL,OlafsenT,MichaelsenTE,SandlieI.用于哺乳动物中瞬时及稳定表达重组抗体分子的通用载体(Versatilevectorsfortransientandstableexpressionofrecombinantantibodymoleculesinmammaliancells).JImmunolMethods.1997年4月12；204(1):77_87·15BradburyAR,MarksJD.*自if胃白勺(Antibodiesfromphageantibodylibraries).JImmunolMethods.2004年7月；290(1-2):29_49·16deHaardHJ,vanNe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