一种实时热启动Taq酶及其制备方法
【专利摘要】一种实时热启动Taq酶及其制备方法，它涉及Taq酶的制备技术，即通过噬菌体表面展示肽技术，淘选出一种与Taq酶在65℃以下都有亲和性的阳性噬菌体，通过扩增该噬菌体并用胰蛋白酶处理后经超滤而得到含有亲和配体肽的滤液。或进一步分析该配体的序列组成，人工合成这一多肽配体。两种配体可各自按一定比例与Taq酶混合，制备出一种实时热启动Taq酶。由于配体分子量小，热变性过程不会降解，随着温度降至65℃以下，该配体又可以与Taq酶结合而封闭后者的酶活性，所以实现了实时热启动Taq酶的功能。同时短肽对整个PCR反应体系的影响也小的多。
【专利说明】一种实时热启动Taq酶及其制备方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及生物学【技术领域】，具体涉及一种实时热启动Taq酶及其制备方法。
【背景技术】 [0003]热启动Taq酶已越来越多地被用于PCR之中，特别是在多位点基因复合扩增，如人或动植物的微卫星基因，也叫短串联重复序列(short tandem repeat, STR)分析中用的更多，因为这种酶与普通Taq酶相比其最大的特点是:酶活是在反应体系由高温(95°C)降至退火温度的过程中释放恢复的，也就是说；是在反应体系中引物与模板处于一种严谨性配对结合状态下开始PCR的，所以这种DNA扩增是一种更严谨真实的扩增，杂带更少，本底更少，噪音更低，扩增效率更高[1]。到目前为止，制备热启动Taq酶的方法有；1、石蜡包被法，
2、抗体介导抑制法，3、化学修饰法，4、ssDNA链(适配子)结合法,5、肝素盐法。在我国有关研究热启动DNA聚合酶的报道文章还很少，更未见过用噬菌体展示肽亲和配体(或短肽)结合普通Taq酶，来制备热启动Taq酶的报道。用短肽制备的热启动Taq酶与常规意义上的热启动Taq酶还有所不同，它无需95 °C预热十几分钟，而是像普通Taq酶一样直接进入PCR循环，缩短了反应时间。同时，短肽热稳定性好，它的热启动不是反应初始阶段的一次性热启动，而是在整个PCR的每个循环中的热启动。短肽与抗体相比较，分子量小得多，稳定性好，短肽可以通过胰蛋白酶水解Taq酶亲和性噬菌体而获得，也可直接通过人工合成来制备，免去了动物免疫、饲养、检测、提取和纯化……等一系列繁琐的抗体生产程序，也降低了成本。选到的噬菌体表面展示肽亲和配体及其肽序列可以一直沿用，一次投入终生受用。同时短肽对整个PCR反应体系的影响也小的多热启动Taq酶已越来越多地被用于PCR之中，特别是在多位点基因复合扩增，如人或动植物的微卫星基因，也叫短串联重复序列(shorttandem repeat, STR)分析中用的更多，因为这种酶与普通Taq酶相比其最大的特点是:酶活是在反应体系由高温(95°C)降至退火温度的过程中释放恢复的，也就是说；是在反应体系中引物与模板处于一种严谨性配对结合状态下开始PCR的，所以这种DNA扩增是一种更严谨真实的扩增，杂带更少，本底更少，噪音更低，扩增效率更高[1]。到目前为止，制备热启动Taq酶的方法有；1、石蜡包被法，2、抗体介导抑制法，3、化学修饰法，4、ssDNA链(适配子)结合法，5、肝素盐法。在我国有关研究热启动DNA聚合酶的报道文章还很少，更未见过用噬菌体展示肽亲和配体(或短肽)结合普通Taq酶，来制备热启动Taq酶的报道。用短肽制备的热启动Taq酶与常规意义上的热启动Taq酶还有所不同，它无需95 °C预热十几分钟，而是像普通Taq酶一样直接进入PCR循环，缩短了反应时间。同时，短肽热稳定性好，它的热启动不是反应初始阶段的一次性热启动，而是在整个PCR的每个循环中的热启动。短肽与抗体相比较，分子量小得多，稳定性好，短肽可以通过胰蛋白酶水解Taq酶亲和性噬菌体而获得，也可直接通过人工合成来制备，免去了动物免疫、饲养、检测、提取和纯化……等一系列繁琐的抗体生产程序，也降低了成本。选到的噬菌体表面展示肽亲和配体及其肽序列可以一直沿用，一次投入终生受用。同时短肽对整个PCR反应体系的影响也小的多。
[0004]
【发明内容】
:
本发明的目的是提供一种实时热启动Taq酶及其制备方法，它可以取代金牌Taq酶，淘选到的具有表面展示肽亲和配体的噬菌体及其亲和配体肽序列可以一直用于该实时热启动Taq酶的制备，一次投入终生受用。
[0005]为了解决【背景技术】所存在的问题，本发明是采用以下技术方案:它通过噬菌体表面展示肽技术，从噬菌体展示肽库中淘选出一种与Taq酶有亲和性，而且在65°C以下这种亲和性都很稳定的阳性噬菌体，通过扩增该噬菌体并用胰蛋白酶处理并经过超滤而得到含有亲和配体肽的滤液 ；进一步分析该噬菌体表面展示肽亲和配体的序列组成，人工合成这一多肽配体，两种配体可各自按一定比例与Taq酶混合。
[0006]它的制备方法如下:1、用Taq酶蛋白包被酶标板，通过噬菌体表面展示肽技术，生物淘选使与Taq酶具有亲和性的噬菌体富集；
2、利用ELISA法进行阳性噬菌体克隆的鉴定，再通过提高ELISA法中洗涤缓冲液的温度，筛选出与Taq酶在65°C以下亲和性稳定的阳性噬菌体，扩增该噬菌体并用胰蛋白酶处理之，再通过超滤得到含有亲和配体肽的滤液；
3、或分析筛选到的噬菌体表面展示肽亲和配体的序列组成，人工合成这段配体的序列
肽；
4、将含有亲和配体肽的滤液或人工合成的肽与Taq酶蛋白按比例混合，即得到实时热启动Taq酶。
[0007]本发明是通过是通过噬菌体表面展示肽技术淘选到与Taq酶具有亲和性的噬菌体表面展示肽亲和配体。
[0008]本发明是通过提高ELISA法中洗涤缓冲液的温度，筛选出与Taq酶在65°C以下亲和性稳定的阳性噬菌体。
[0009]本发明是通过扩增该噬菌体并用胰蛋白水解该噬菌体，再通过超滤得到含有亲和配体肽的滤液。
[0010]本发明是通过分析该噬菌体表面展示肽亲和配体的序列组成为七肽。
[0011]本发明具有以下有益效果:它可以取代金牌Taq酶，淘选到的具有表面展示肽亲和配体的噬菌体及其亲和配体肽序列可以一直用于该实时热启动Taq酶的制备，一次投入终生受用。
【具体实施方式】
[0012]本【具体实施方式】采用以下技术方案:它通过噬菌体表面展示肽技术，从噬菌体展示肽库中淘选出一种与Taq酶有亲和性，而且在65°C以下这种亲和性都很稳定的阳性噬菌体，通过扩增该噬菌体并用胰蛋白酶处理并经过超滤而得到含有亲和配体肽的滤液；进一步分析该噬菌体表面展示肽亲和配体的序列组成，人工合成这一多肽配体，两种配体可各自按一定比例与Taq酶混合。
[0013]它的制备方法如下:1、用Taq酶蛋白包被酶标板，通过噬菌体表面展示肽技术，生物淘选使与Taq酶具有亲和性的噬菌体富集；
2、利用ELISA法进行阳性噬菌体克隆的鉴定，再通过提高ELISA法中洗涤缓冲液的温度，筛选出与Taq酶在65°C以下亲和性稳定的阳性噬菌体，扩增该噬菌体并用胰蛋白酶处理之，再通过超滤得到含有亲和配体肽的滤液；
3、或分析筛选到的噬菌体表面展示肽亲和配体的序列组成，人工合成这段配体的序列
肽；
4、将含有亲和配体肽的滤液或人工合成的肽与Taq酶蛋白按比例混合，即得到实时热启动Taq酶。
[0014]本【具体实施方式】步骤I中是通过噬菌体表面展示肽技术淘选到与Taq酶具有亲和性的噬菌体表面展示肽亲和配体。
[0015]本【具体实施方式】步骤2中是通过提高ELISA法中洗涤缓冲液的温度，筛选出与Taq酶在65°C以下亲和性稳定的阳性噬菌体。
[0016]本【具体实施方式】步骤2中是通过扩增该噬菌体并用胰蛋白水解该噬菌体，再通过超滤得到含有亲和配体肽的滤液。
[0017]本【具体实施方式】步骤3中是通过分析该噬菌体表面展示肽亲和配体的序列组成为七肽。
[0018]本【具体实施方式】步骤4中Pfu=IO8 -1O9的曬菌体胰蛋白酶酶解超滤液与10μ/Pg/? Taq酶等体积混合即成实时热启动Taq酶。而人工合成的配体序列肽与Taq酶蛋白混合的摩尔比为5一50:lo
[0019]本【具体实施方式】具有以下有益效果:它可以取代金牌Taq酶，淘选到的具有表面展示肽亲和配体的噬菌体及其亲和配体肽序列可以一直用于该实时热启动Taq酶的制备，一次投入终生受用。
[0020]实施例:
实施例一、制备实时热启动Taq酶一
O酶标板的包被及封闭:用包被buffer (0.1MNaHCO3 pH8.6)将Taq酶蛋白的浓度稀释至100ug/ml，作为第一轮淘选用的包被液，第二轮至第四轮包被液的浓度分别为:50ug/ml、25ug/ml和10ug/ml,酶标板经15W紫外灯间距IOcm照射15mim后，包被液按IOOul/孔分装至四个孔中，另外用包被buffer包被两个预处理孔，置自封袋中，4 一 8°C孵育过夜，弃包被液，用 TBST(50mMTris-HCl ρΗ7.5 150mMNaCl 0.5 % Tween20)洗板 4 次，每次3min,拍干,每孔加入350ul封闭液(I % BSA-包被buffer)，37°C封闭60min,弃封闭液，用 TBST (50mMTris-HCl ρΗ7.5 150mMNaCl 0.1 % Tween20)洗板 4 次，每次 3min,拍干。
[0021]2)噬菌体展示肽的预结合和亲合:向上述步骤I)的两个预处理孔中分别加入95ul的TBST和5ul的噬菌体展示肽库(试剂盒内容物)，混匀，室温下与预处理孔中的BSA预结合20min，以除去肽库中与BSA有亲和性的噬菌体展示肽。然后再将该噬菌体展示肽库液均分转移至四个包被孔中(内有50ulTBST)置37°C IOOrpm结合60min
3)噬菌体的洗脱及扩增:将上述步骤2)的酶标板包被液弃之，用TBST洗板10次，洗去未结合及低亲和力的噬菌体。每孔加入IOOul0.2M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.2含ImgBSA/ml)洗脱液，室温，IO Orpm维持15min，解离已结合的噬菌体，吸出洗脱液立即加入60ul中和液(IMtris-HCl pH9, I),即得到第一循环淘洗物。
[0022]4)噬菌体的扩增:上述步骤3)的淘洗物除留下20ul用作滴度测定，其余的都转入20mlER2738敏感态菌液中，置37°C 230rpm扩增4.5小时，。扩增液转入离心管，4°C9000rpm离心10min，上清转入新离心管，同条件再次离心。由上而下收集80 %上清液加入 1/6 体积的 PEG/NaCl(20 % PEG-8000 2.5M NaCl)，4°C孵育过夜。4°C 1000Orpm 离心15min,弃上清,沉淀重悬于ImlTBS中，室温下1000Orpm离心5min,上清加入1/6体积的PEG/NaCl，冰浴60min, 4°C 1000Orpm离心 IOmin,沉淀重悬于 200ul TBS 0.02% NaN3 中，室温下1000Orpm离心5min,上清即为第一循环扩增洗脱物。
[0023]5)重复上述步骤I)至4):如此反复“亲和一淘洗一扩增”过程，通过4轮筛选直至洗脱的噬菌体滴度稳定在一定数量级，铺板，挑取单克隆噬菌斑。其中后3轮筛选时TBST中的Tween 20浓度增加为0.5 %。结果第4轮筛选后与第I轮相比，富集了 400倍(富集倍数=第4轮回收率/第I轮回收率)。
[0024]6)噬菌斑的扩增:第四轮噬菌体滴度测定时，在< 100个蓝色噬菌斑(噬菌体单克隆)的平皿上，以无菌牙签随机挑取30个(I个/管)噬菌斑，转入5mlER2738敏感态菌液中，置370C 230rpm扩增4.5小时，培养物经室温12000rpm离心5min得到上清即为扩增的单个噬菌体克隆。
[0025]7)阳性噬菌体克隆的鉴定:对上述步骤6)的单个噬菌体克隆采用ELISA法进行鉴定，即用含Taq酶(10ug/ml)的包被液，按IOOul/孔包被酶标板30孔作为检测孔，同时用含I % BSA的包被液包被30个空白对照孔，4°C一 8°C孵育过夜，经封闭、洗板后，分列30对，将30个单克隆噬菌体(上清)按IOOul/孔分别对应加入30对检测孔和空白对照孔中，37 °C 孵育 2h、用 TBST 洗板4次，每次 3min，加入 HRP/Anti_M13 (1:4000) 37 °C 孵育 Ih,用TBST洗板4次，立即加入TMB显色剂，37°C避光显色15min，用2M硫酸中止反应后，于450nm读取吸光度值(A45tl )，以(A45tl )值高于空白对照3倍以上作为阳性。结果其中有5个噬菌体克隆显示与Taq酶具有高亲和性结合能力。
[0026]8)阳性噬菌体与Taq酶亲和性的热稳定筛选:用含Taq酶(10ug/ml)的包被液，按IOOul/孔包被酶标板，相对于上述步骤7)淘选到的5个阳性噬菌体，每个需6个孔，操作同步骤8)，只是增加了一组热处理，即；将每个阳性噬菌体(上清)按IOOul/孔分别加入6个孔和I个空白对照孔中，3个孔和空白对照孔用常温TBST洗板，另外3个孔用65°C的恒温TBST洗板，以便筛选出65°C以下与Taq酶亲和性稳定的阳性噬菌体，并用高温ELISA的OD45tl值与常温ELISA的OD45tl值比值的百分数来代表其热稳定性。结果2号噬菌体常温亲和性(OD450值)为0.91，65°C亲和性(OD45tl值)为0.83。说明2号噬菌体与Taq酶有良好的结合活性，为0.91，而且在650C以下这种结合的稳定性最高，为0.83 + 0.91 X 100%=91.2 %。
[0027]9)获取亲和配体多肽:对上述步骤8)筛到的2号噬菌体进行扩增至pfu=1013，取IOul噬菌体加IOul胰蛋白酶和碳酸氢铵等至终体积为IOOul，酶解液通过超滤得到含有亲和配体肽的滤液，再将滤液稀释至1000-10000倍
10)配制实时热启动Taq酶:将上述步骤9)的稀释滤液与lOP/^g/^LTaq酶按等体积混合即成实时热启动Taq酶。
[0028]实施例二、制备实时热启动Taq酶二
I)噬菌体表面展示肽亲和配体氨基酸序列推导；对实施例一淘选到的噬菌体，进行克隆扩增，以碘化钠溶解抽提噬菌体单链DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定和PCR检验，再进行DNA测序。根据编码链中噬菌体P III基因的阅读框架推导出与P III蛋白融合的外源多肽的氨基酸序列为7肽序列2)人工合成亲和配体多肽:将上述步骤I)的7肽序列委托相关公司进行人工合成；
3)配制实时热启动Taq酶；将上述步骤2)合成的亲和配体7肽溶解稀释并与Taq酶按摩尔比5 — 50:1混合，即为实时热启动Taq酶，
实验结果:将实施例一步骤10)制备的实时热启动Taq酶用于早期的人类14+1 STR银染检测试剂盒，15个STR基因位点分布在5个PCR反应管中全部得到扩增，而且扩增的DNA条带清晰均一。将实施例二步骤3)制备的实时热启动Taq酶用于人类17+1 STR荧光检测试剂盒，18个STR基因位点集中在一个PCR反应管中全部得到了扩增，而且扩增的DNA条带清晰，基本均一。
【权利要求】
1.一种实时热启动Taq酶及其制备方法，其特征在于它通过噬菌体表面展示肽技术，从噬菌体展示肽库中淘选出一种与Taq酶有亲和性，而且在65°C以下这种亲和性都很稳定的阳性噬菌体，通过扩增该噬菌体并用胰蛋白酶处理并经过超滤而得到含有亲和配体肽的滤液；进一步分析该噬菌体表面展示肽亲和配体的序列组成，人工合成这一多肽配体，两种配体可各自按一定比例与Taq酶混合。
2.一种实时热启动Taq酶及其制备方法，其特征在于它的操作步骤如下: (1)、用Taq酶蛋白包被酶标板，通过噬菌体表面展示肽技术，生物淘选使与Taq酶具有亲和性的噬菌体富集； (2)、利用ELISA法进行阳性噬菌体克隆的鉴定，再通过提高ELISA法中洗涤缓冲液的温度，筛选出与Taq酶在65°C以下亲和 性稳定的阳性噬菌体，扩增该噬菌体并用胰蛋白酶处理之，再通过超滤得到含有亲和配体肽的滤液； (3)、或分析筛选到的噬菌体表面展示肽亲和配体的序列组成，人工合成这段配体的序列肽； (4)、将含有亲和配体肽的滤液或人工合成的肽与Taq酶蛋白按比例混合，即得到实时热启动Taq酶。
3.根据权利要求1所述的一种实时热启动Taq酶及其制备方法，其特征在于它是通过噬菌体表面展示肽技术淘选到与Taq酶具有亲和性的噬菌体表面展示肽亲和配体。
4.根据权利要求1所述的一种实时热启动Taq酶及其制备方法，其特征在于它是通过提高ELISA法中洗涤缓冲液的温度，筛选出与Taq酶在65 °C以下亲和性稳定的阳性噬菌体。
5.根据权利要求1所述的一种实时热启动Taq酶及其制备方法，其特征在于它是通过扩增该噬菌体并用胰蛋白水解该噬菌体，再通过超滤得到含有亲和配体肽的滤液。
【文档编号】C12N9/12GK103966184SQ201410186822
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】涂祖新, 熊勇华, 郑国华, 陈媛, 张莉莉 申请人:江西省科学院微生物研究所