专利名称：一种热启动耐高温dna聚合酶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种热启动耐高温DNA聚合酶及其制备方法，更具体的是涉及一种通过化学修饰生产的热启动耐高温DNA聚合酶及其制备方法，属于生物化学中蛋白质化学领域。
背景技术：
目前，耐高温DNA聚合酶已广泛用于分子生物学中基因检测，基因克隆等技术领域，其主要功能是通过DNA聚合酶链式反应对待检测DNA进行信号放大。其基本原理类似于DNA的天然复制过程。DNA聚合酶链式反应由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成①模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至引物退火温度，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸DNA模板--引物结合物在耐高温DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。如此循环几十次后就能将待扩增的基因扩增放大几百万倍。在PCR反应中，热启动PCR是除了优化引物设计、PCR条件之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管耐高温DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，但该酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。目前实现PCR热启动方法包括手工热启动方法、蜡防护层包裹法、抗体修饰法以及化学修饰法等几种。其中手工热启动方法由于操作烦琐，目前已较少人使用；蜡防护层包裹法由于工艺复杂以及热启动效果较差，不是一种理想的产业化方法；抗体法通过抗体特异性封闭酶活性中心，但该方法中的酶与抗体结合属于非化学键结合，在热启动酶保存过程中易出现抗体活性下降，热启动效果丧失的风险，同时抗体修饰法很难完全封闭酶的所有活性，因此也不是一种真正意义上最佳的封闭耐高温DNA聚合酶酶活的热启动修饰方法；化学修饰法通过化学物质与耐高温DNA聚合酶肽链上氨基形成稳定的酰氨键，在常温下可完全封闭酶的活性，通过高温将酰氨键水解，耐高温DNA聚合酶活性重新显示出来，因此该方法是目前生产热启动耐高温DNA聚合酶最理想的方法之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种热启动耐高温DNA聚合酶，该DNA聚合酶在DNA聚合酶链式反应过程中，极大地降低了DNA聚合酶在低温时的3’到5’端的延伸活性，从而极大地提高了该DNA聚合酶的反应特异性、可靠性、均一性和灵敏度。这种热启动DNA聚合酶可广泛地应用于分子生物学中涉及到的各类DNA聚合酶链式反应，尤其适合于人类STR-PCR DNA复合扩增基因分型产品中。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述热启动耐高温DNA聚合酶的方法，即化学修饰法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为经化学修饰的热启动耐高温DNA聚合酶，其分子结构如下述通式(I)
其中R1，R2，R3各自代表氢、卤素、羟基、羧酸、乙酸、硫化氢、磺酸基、硝基、氨基、亚氨基、乙烯基、羰基或乙炔。
通过化学修饰制备热启动耐高温DNA聚合酶的方法，该方法包括以下步骤A将通式为(II)的化学修饰物溶解于无水乙醇、二甲基亚砜、无水四氢呋喃或甲酰胺至溶液终浓度为0.1-10mol/L；将以上化学修饰物溶液按摩尔比2-100∶1加入pH为7.5-10的耐高温DNA聚合酶溶液中，0-45℃反应2-48小时； 其中，R为琥珀酸、磺酸基、单硝基、多硝基、单氟或多氟取代的苯酚；R1，R2，R3各自代表氢、卤素、羟基、羧酸、乙酸、硫化氢、磺酸基、硝基、氨基、亚氨基、乙烯基、羰基或乙炔。
B、将反应产物采用透析、过柱或超滤方法纯化，即得到热启动耐高温DNA聚合酶；化学修饰法生产热启动耐高温DNA聚合酶反应原理如图1。
其中所述的化学修饰物溶解于无水乙醇、二甲基亚砜、无水四氢呋喃或甲酰胺至溶液终浓度优选范围为1-3mol/L，化学修饰物溶液按摩尔比为10-30∶1的优选比例加入pH为8.0-8.5的耐高温DNA聚合酶溶液中，4-10℃反应6-14小时。在该条件下整个修饰反应比较温和，修饰反应彻底，同时不会出现蛋白质变性现象。由于在低温反应，耐高温DNA聚合酶活性不易丧失，反应时间比较恰当，适合于产业化。
要求所生产的耐高温DNA聚合酶比活力大于30U/ul，其中1单位的酶活力定义为在74℃，30分钟内，以活性化大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，催化10mmol的脱氧核苷酸掺入到酸不溶性物质所需酶的量。反应条件50ul体系中，包括50mM Tris-HCl(25℃，pH9.0)，50mM NaCl，10mM MgCl2，200uM的dATP、dCTP、dGTP和放射性同位素标记的dTTP，以及12.5ug活化的小牛胸腺DNA。同时该酶经SDS-PAGE检测纯度大于99％；经检测无外源核酸酶活性；PCR方法检测无宿主残余DNA；能有效地扩增人基因组中的单拷贝基因。
本发明的有益效果本发明提供的热启动耐高温DNA聚合酶是经过化学修饰的耐高温DNA聚合酶，在常温下，酶活性被封闭，在95℃加热1-20分钟才能完全恢复正常活力开始反应，由于在初始循环的热变性之前它没有活性，从而抑制了低温条件下由引物非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。扩增时具有普通耐高温DNA聚合酶的活性，同时具有更强的特异性。该方法生产的酶可广泛应用于高灵敏度和有较强背景基因组扩增(如基因组中某个特定基因位点或外源病原体的检测)、荧光定量PCR、DNA序列测定、Multiplex PCR、TA克隆等。此外，采用本发明的化学修饰物所生产的热启动耐高温DNA聚合酶其原酶活力保留率高，从而提高了生产效率，降低了产品的成本。
图1是化学修饰法生产的热启动耐高温DNA聚合酶反应原理图；图2是以人基因组DNA为模板，扩增319bp片段的琼脂糖凝胶电泳鉴别结果；图3是化学修饰法生产的热启动耐高温DNA聚合酶应用于Multiplex PCR的结果。
具体实施例方式
实施例11、以2-甲基-2-丁烯-2-酸琥珀酸酐或2-甲基-2-丁烯-2-酸-2，3，4，5，6五氟代苯酚酸酐修饰耐高温DNA聚合酶(Taq酶)蛋白，生产出热启动耐高温DNA聚合酶。具体生产步骤如下2-甲基-2-丁烯-2-酸琥珀酸酐结构式如下 2-甲基-2-丁稀-2-酸琥珀酸酐2-甲基-2-丁烯-2-酸-2，3，4，5，6五氟代苯酚酸酐结构式如下 2-甲基-2-丁稀-2-酸2，3，4，5，6-五氟代苯酚酸酐2、取Promega公司耐高温DNA聚合酶(Taq酶)，酶蛋白浓度为50mg/ml，测定Taq酶活力为180U/ul。
3、称取2-甲基-2-丁烯-2-酸琥珀酸酐或2-甲基-2-丁烯-2-酸-2，3，4，5，6五氟代苯酚酸酐50mg，加入1000ul无水乙醇中。
4、取300ul 2-甲基-2-丁烯-2-酸琥珀酸酐乙醇溶液加入3ml共150mg的Taq酶蛋白中(pH8.5)，4℃搅拌反应14小时。
5、反应液4℃8000rpm离心10min，除沉淀。
6、上清液用截留分子量为50K(5万道尔顿)的超滤管进行浓缩，4℃条件下8000rpm离心80min，除去反应副产物，浓缩液用pH8.0的TQ(20mM Tris-HCl；0.1mM EDTA；0.1M KCL；0.5％(V/V)吐温-20；pH 8.0)缓冲液稀释至反应原体积，加入与上清液等体积的甘油，混匀，即得热启动DNA聚合酶，-20℃保存。
实施例21、2，4-己二烯酸琥珀酸酐或2，4-己二烯酸-2，3，4，5，6五氟代苯酚酸酐修饰耐高温DNA聚合酶(Taq酶)蛋白，生产出热启动耐高温DNA聚合酶。具体生产步骤如下2，4-己二烯酸琥珀酸酐结构式如下 2，4-己二稀酸琥珀酸酐2，4-己二烯酸-2，3，4，5，6五氟代苯酚酸酐结构式如下 2，4-己二稀酸-2，3，4，5，6-五氟代苯酚酸酐2、取Promega公司耐高温DNA聚合酶(Taq酶)，酶蛋白浓度为50mg/ml，测定Taq酶活力为180U/ul。
3、称取2，4-己二烯酸琥珀酸酐或2，4-己二烯酸-2，3，4，5，6五氟代苯酚酸酐25mg，加入100ul二甲基甲酰胺中。
4、取100ul 2，4-己二烯酸琥珀酸酐或2，4-己二烯酸-2，3，4，5，6五氟代苯酚酸酐的甲酰胺溶液加入2.2ml共110mg的Taq酶蛋白中(pH8.5)，37℃搅拌反应2小时。
5、反应液4℃8000rpm离心10min，除沉淀。
6、上清液转移至截留分子量为50K(5万道尔顿)的透析袋中，在TQ(20mM Tris-HCl；0.1mM EDTA；0.1M KCl；0.5％(V/V)吐温-20；pH 8.0)缓冲液中透析2天以上，期间换缓冲液6次。透析完毕后，取出酶液，加入与上清液等体积的甘油，混匀，即得热启动DNA聚合酶，-20℃保存。
实施例31、以3，5-二硝基水杨酸琥珀酸酐或3，5--二硝基水杨酸对硝基苯酚酸酐修饰耐高温DNA聚合酶(Taq酶)蛋白，生产出热启动耐高温DNA聚合酶。具体生产步骤如下3，5-二硝基水杨酸琥珀酸酐结构式如下 3，5-二硝基水扬酸琥珀酸酐3，5--二硝基水杨酸对硝基苯酚酸酐结构式如下 3，5-二硝基水扬酸对硝基苯酚酸酐2、取Takara公司耐高温DNA聚合酶(Taq酶)，酶蛋白浓度为30mg/ml，测定Taq酶活力为100U/ul。
3、称取3，5-二硝基水杨酸琥珀酸酐或3，5--二硝基水杨酸对硝基苯酚酸酐1mg，加50ul二甲基亚砜中。
4、取30ul 3，5-二硝基水杨酸琥珀酸酐或3，5--二硝基水杨酸对硝基苯酚酸酐溶液加2ml共60mg的Taq酶蛋白中(pH8.5)，37℃搅拌反应2小时。
5、反应液4℃8000rpm离心10min，除沉淀。
6、上清液过葡聚糖凝胶G25柱，TQ(20mM Tris-HCl；0.1mM EDTA；0.1M KCl；0.5％(V/V)吐温-20；pH 8.0)缓冲液为洗脱液，收集第一个蛋白峰，加入与上清液等体积的甘油，混匀，即得热启动DNA聚合酶，-20℃保存。
实施例4以人基因组DNA为模板，扩增319bp的片段，其中模板2ul(2ng)，10uM Primer(up and low)10ul，10×HotstartTaq Buffer 5ul，25mM MgCl24ul，热启动耐高温DNA聚合酶(5U/ul)1ul，补水至50ul；按如下条件反应95℃11min热变性，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃保10min。同时以未修饰前的DNA聚合酶(5U/ul)做平行对照。结束PCR反应后，取反应产物5ul，琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2，其中泳道1DL2000Marker；泳道2-5热启动DNA聚合酶扩增产物，泳道2-5普通DNA聚合酶扩增产物。从结果可知，采用热启动耐高温DNA聚合酶扩增的强度和灵敏度明显增加。
实施例5本发明的热启动耐高温DNA聚合酶应用于MultiplexPCR。以ABI公司AmpF1STRIdentifilerTMPCR扩增试剂盒为例，其中模板2.5ul(0.25ng)，Identifiler PCR ReactionMix 10ul，Identifiler Primer Set 5ul，热启动耐高温DNA聚合酶(5U/ul)0.5ul，补水至25ul；按如下条件反应95℃11min热变性，94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，最后60℃保温60min。同时以未修饰前的耐高温DNA聚合酶(5U/ul)做平行对照。反应结束后取反应产物上ABI310或3100设备检测。结果显示使用未修饰前的耐高温DNA聚合酶进行PCR，各STR位点均不能获得有效扩增(图片未显示)；而采用热启动耐高温DNA聚合酶进行PCR，各STR位点均获得了有效扩增，结果见图3。
权利要求
1.一种热启动耐高温DNA聚合酶，其分子结构如下述通式(I) 其中R1，R2，R3各自代表氢、卤素、羟基、羧酸、乙酸、硫化氢、磺酸基、硝基、氨基、亚氨基、乙烯基、羰基或乙炔。
2.制备权利要求1所述的热启动耐高温DNA聚合酶的方法，该方法包括以下步骤A将通式为(II)的化学修饰物溶解于无水乙醇、二甲基亚砜、无水四氢呋喃或甲酰胺至溶液终浓度为0.1-10mol/L， 其中，R为琥珀酸、磺酸基、单硝基、多硝基、单氟或多氟取代的苯酚；R1，R2，R3各自代表氢、卤素、羟基、羧酸、乙酸、硫化氢、磺酸基、硝基、氨基、亚氨基、乙烯基、羰基或乙炔，将以上化学修饰物溶液按摩尔比2-100∶1加入pH为7.5-10的耐高温DNA聚合酶溶液中，0-45℃反应2-48小时；B、将反应产物采用透析、过柱或超滤方法纯化，即得到热启动耐高温DNA聚合酶。
3.如权利要求2所述的制备热启动耐高温DNA聚合酶的方法，其特征在于所述的化学修饰物溶解于无水乙醇、二甲基亚砜、无水四氢呋喃或甲酰胺至溶液终浓度为1-3mol/L。
4.如权利要求2所述的制备热启动耐高温DNA聚合酶的方法，其特征在于化学修饰物溶液按摩尔比为10-30∶1加入pH为8.0-8.5的耐高温DNA聚合酶溶液中，4-10℃反应6-14小时。
全文摘要
本发明涉及一种热启动耐高温DNA聚合酶及其制备方法，通过特定的化学修饰法来可逆地封闭DNA聚合酶的活性，同时该酶在弱碱性条件下(pH＝8－9)经高温(94℃以上)处理一定时间，DNA聚合酶的活性经过解封闭逆转而得到恢复。经过该方法修饰的耐高温DNA聚合酶在DNA聚合酶链式反应过程中，极大地降低了DNA聚合酶在低温时的3’到5’端延伸的酶活性，从而极大地提高了该DNA聚合酶的反应特异性、可靠性、均一性和灵敏度。利用该方法生产的热启动耐高温DNA聚合酶可广泛地应用于分子生物学中涉及到的各类DNA聚合酶链式反应，尤其适合于人类STR－PCR DNA复合扩增基因分型产品中。
文档编号C12N15/52GK101050453SQ20071006512
公开日2007年10月10日 申请日期2007年4月4日 优先权日2007年4月4日
发明者郑卫国, 熊勇华, 陈光辉, 涂祖新 申请人:无锡中德美联生物技术有限公司