专利名称：一种定点突变的耐高温植酸酶基因tp及其表达载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学饲料添加剂领域，具体涉及一种定点突变的耐高温植酸酶基因TP及其表达载体和应用。
背景技术：
植酸(肌醇六磷酸)是植物中磷的主要储存形式，植酸及其盐类是谷物、豆类及油料等作物中磷的主要贮存形式。由于单胃动物的胃内缺乏相应的酶而不能水解利用植酸，这造成了磷源的浪费，而且不能被利用的植酸中的磷被直接排出体外，造成了土壤及水域的磷污染。另外，植酸还能与矿质元素及蛋白质螯合，使这些营养元素不能被有效利用，导致了植物性饲料营养价值的降低，因此植酸也被普遍认为是饲料中的一种抗营养因子。 植酸酶广泛存在于动物、植物和微生物中，目前实际应用的植酸酶均来源于微生物。天然微生物中植酸酶含量太低，难以大量获得廉价的植酸酶产品，不能满足饲料工业发展的要求。目前利用基因工程菌来获得高表达量的植酸酶，对植酸酶的广泛应用及降低生产成本发挥了重要作用。目前已经有多种微生物来源的植酸酶基因得到分离，如黑曲霉、芽孢杆菌、大肠杆菌等。根据研究对比，来源于大肠杆菌的植酸酶(appA植酸酶)是迄今所知的分解植酸能力最强的植酸酶。1985年首次克隆出了大肠杆菌植酸酶编码基因appA ；1990年对该基因进行了序列分析；1992年通过定点突变的方法实现了 appA基因的过量表达。目前，植酸酶制剂在应用上的一个关键问题即酶的热稳定性始终没有得到很好地解决，制粒高温对植酸酶酶活产生极大的破坏，虽然研究者已从不同的方面对植酸酶的耐热性进行了许多富有成效的研究，如通过筛选产耐热植酸酶的菌株、运用蛋白质工程、改进生产工艺等方法来获得耐热植酸酶，但是获得的植酸酶耐热效果仍然不理想。
发明内容
本发明提供了一种定点突变的耐高温植酸酶基因TP及其表达载体和应用，本发明通过定点突变大肠杆菌的植酸酶(appA植酸酶)氨基酸序列，来提高植酸酶的热稳定性，并按照毕赤酵母密码子偏好性改造其基因，以获得植酸酶突变体的高效表达。为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现本发明提供了一种定点突变的耐高温植酸酶基因TP，其碱基序列如SEQ ID No 4所示；所述对应的耐高温植酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID No 5所示。本发明还提供了含有所述的耐高温植酸酶基因TP的载体，具体所述载体为PPIC9K-TP。本发明提供了所述的耐高温植酸酶在作为饲料添加剂中的应用，所述耐高温植酸酶的用量为100-200克/吨饲料。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是为提高植酸酶热稳定性，本发明选择了迄今所知的分解植酸能力最强的植酸酶-大肠杆菌植酸酶(appA植酸酶)，先将植酸酶氨基酸序列中特定区域的氨基酸突变成脯氨酸(P)和精氨酸(R)，使植酸酶具有特殊的稳定蛋白质结构，后将植酸酶氨基酸序列反方向翻译获得基因序列，在对植酸酶氨基酸序列的部分区域进行定点突变的同时对其基因序列按毕赤酵母菌密码子偏好性、GC含量对其基因序列进行优化，同时按照毕赤酵母密码子偏好性人工合成植酸酶基因后，将其克隆到真核载体PPIC9K中，构建了重组质粒pPIC9K-TP。将重组质粒pPIC9K_TP线性化后经电击转化法转到毕赤酵母GS115中，将筛选获得阳性转化子进行诱导表达获得耐高温且表达量高的植酸酶。用分光光度法检测植酸酶的酶活性，并在不同反应温度条件下检测植酸酶的酶活比率。经实验证明，由毕赤酵母表达后获得的植酸酶可以耐受85°C以上的高温制粒，存留率达到85%。本发明通过改造氨基酸序列获得的植酸酶突变体具有很好的耐热性，在毕赤酵母中获得高表达量。这种植酸酶的推广应用，不仅对我国饲料畜牧业的发展产生可观的经济效益和社会效益，同时也可产生巨大的生态效益。结合附图阅读本发明的具体实施方式
后，本发明的其他特点和优点将变得更加清
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图I是本发明中重组质粒PUC18-T-TP的PCR鉴定电泳图谱，M表示DL2000 DNAmarker ；1 表示质粒 pUC18_T_TP 的 PCR 产物。图2是本发明中重组表达质粒pPIC9K-TP的PCR鉴定电泳图谱，M表示DL2000 DNAmarker ；1表示质粒pPIC9K_TP的PCR产物。图3是本发明中植酸酶突变体蛋白SDS-PAGE的凝胶图谱，图中M表示蛋白丽Marker ;1表示重组菌株GS115/pPIC9K_TP表达上清；2表示重组菌株GS115/pPIC9K诱导上清。图4是本发明中改造后植酸酶在不同反应温度条件下植酸酶酶活图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明的技术方案作进一步详细的说明。实施例I一、大肠杆菌植酸酶(appA植酸酶)蛋白质突变体基因的获得I、选择大肠杆菌菌株Escherichia coli str. K-12中的植酸酶基因序列如SEQ IDNo 2所示，appA植酸酶氨基酸序列如SEQ ID No 1所示,植酸酶的活性位点保守序列为RHGXRXP。NCBI中植酸酶氨基酸序列(SEQ IDNo 1)QSEPELKLESVVIVSRHGVRAPTKATQLMQDVTPDAWPTWPVKLGWLTPRGGELIAYLGHYQRQRLVADGLLAKKGCPQSGQVAIIADVDERTRKTGEAFAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPLKTGVCQLDNANVTDAILSRAGGSIADFTGHRQTAFRELERVLNFPQSNLCLKREKQDESCSLTQALPSELKVSADNVSLTGAVSLASMITEIFLLQQAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFYLLQRTPEVARSRATPLLDLIKTALTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALELNWTLPGQPDNTPPGGELVFERWRRLSDNSQWIQVSLVFQTLQQMRD
KTPLSLNTPPGEVKLTLAGCEERNAQGMCSLAGFTQIVNEARIPACSLNCBI中植酸酶碱基序列(SEQ IDNo 2)CAGAGTGAGCCGGAGCTGAAGCTGGAAAGTGTGGTGATTGTCAGTCGTCATGGTGTGCGTGCTCCAACCAAG |GC Cl· ACGCMCTGATGCAGGATGTCACCCCAGACGCATGGCCAACCTGGCCGGTA —|AAA| 丨 CTGGGTTGGCTGACACCGCGCGGTGGTGAGCTAATCGCCTATCTCGGACATTACCAACGCCAGCGTCTGGTAGCCGACGGATTGCTGGCGAMAAGGGCTGCCCGCAGTCTGGTCAGGTCGCGATTATT |GCT|' GATGTCGACGAGCGTACCCGTAMACAGGCGAAGCCTTCGCCGCCGGGCTGGCACCTGACTGTGCAATAACCGTACATACCCAGGCAGATACGTCCAGTCCCGATCCGTTATTTAATCCTCTAAAAACTGGCGTTTGCCAACTGGATAACGCGAACGTGACTGACGCGATCCTCAGCAGGGCAGGAGGGTCAATTGCTGACTTTACCGGGCATCGGCAAACGGCGTTTCGCGAACTGGAACGGGTGCTTAATTTTCCGCAATCAAACTTGTGCCTTAAACGTGAGAAACAGGACGAAAGCTGTTCATTAACGCAGGCATTACCATCGGAACTCAAGGTGAGCGCCGACAATGTCTCATTAACCGGTGCGGTAAGCCTCGCATCAATGCTGACGGAGATATTTCTCCTGCAACAAGCACAGGGAATGCCGGAGCCGGGGTGGGGAAGGATCACCGATTCACACCAGTGGAACACCTTGCTAAGTTTGCATAACGCGCAATTTTATTTGCTACAACGCACGCCAGAGGTTGCCCGCAGCCGCGCCACCCCGTTATTAGATTTGATCAAGACAGCGTTGACGCCCCATCCACCGCAAAAACAGGCGTATGGTGTGACATTACCCACTTCAGTGCTGTTTATCGCCGGACACGATACTAATCTGGCAAATCTCGGCGGCGCACTGGAGCTCAACTGGACGCTTCCCGGTCAGCCGGATAACACGCCGCCAGGTGGTGAACTGGTGTTTGAACGCTGGCGTCGGCTAAGCGATAACAGCCAGTGGATTCAGGTTTCGCTGGTCTTCCAGACTTTACAGCAGATGCGTGATAAAACGCCGCTGTCATTAAATACGCCGCCCGGAGAGGTGAAACTGACCCTGGCAGGATGTGAAGAGCGAAATGCGCAGGGCATGTGTTCGTTGGCAGGTTTTACGCAAATCGTGAATGAAGCACGCATACCGGCGTGCAGTTTGTAA2、对apppA植酸酶氨基酸序列进行定点突变耐热酶蛋白中亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、谷氨酸(E)和精氨酸(R)含量均高于常温菌所产植酸酶。其中脯氨酸结构熵小而易折叠，且一经折叠后则需要很高的能量才能解开，从而提高蛋白质稳定性。所以通过定向突变技术，将植酸酶邻近活性中心的部分氨基酸突变为脯氨酸，能有效提高植酸酶的热稳定性。由于脯氨酸易形成β折叠，从而使构象更稳定牢固，在稳定蛋白质结构和提高酶热稳定性方面具有不可忽视的作用。精氨酸比带同样电荷的氨基酸有更大的侧链，侧链所提供的疏水作用及离子间互相作用能提高蛋白质的稳定性。因此本发明在植酸酶成熟蛋白氨基酸序列中的第25位、第87位的丙氨酸(A)对应的密码子突变成脯氨酸(P)的密码子，第43位氨基酸赖氨酸(K)对应的密码子突变为精氨酸(R)的密码子，由获得的碱基序列根据毕赤酵母密码子偏好性，将其碱基序列进行密码子改造，后经毕赤酵母表达获得耐高温、高表达量的植酸酶。突变后的植酸酶碱基序列如SEQ IDNo :3所示，突变并优化后的植酸酶碱基序列如SEQ ID No :4所示，突变后植酸酶氨基酸序列如SEQ ID No 5所示。突变后的植酸酶基因序列如下所示(SEQ ID No :3)，下划线部分为活性位点保守序列对应的基因序列。方框部分碱基分别对应第25、43和87位氨基酸。CAGAGTGAGCCGGAGCTGAAGCTGGAAAGTGTGGTGATTGTCAGTCGTCATGGTGTGCGTGCTCCAACC
aag|cca]acgcaactgatgcaggatgtcaccccagacgcatggccaacctggccggta.|aga|'CTGGGTTGGCTG
ACACCGCGCGGTGGTGAGCTAATCGCCTATCTCGGACATTACCAACGCCAGCGTCTGGTAGCCGACGGATTGCTGGCGAAAAAGGGCTGCCCGCAGTCTGGTCAGGTCGCGATTATT |C C Af GATGTCGACGAGCGTACCCGTAAAACAGGCGAAGCCTTCGCCGCCGGGCTGGCACCTGACTGTGCAATAACCGTACATACCCAGGCAGATACGTCCAGTCCCGATCCGTT
ATTTAATCCTCTAAAAACTGGCGTTTGCCAACTGGATAACGCGAACGTGACTGACGCGATCCTCAGCAGGGCAGGAG
GGTCAATTGCTGACTTTACCGGGCATCGGCAAACGGCGTTTCGCGAACTGGAACGGGTGCTTAATTTTCCGCAATCA
AACTTGTGCCTTAAACGTGAGAAACAGGACGAAAGCTGTTCATTAACGCAGGCATTACCATCGGAACTCAAGGTGAG
CGCCGACAATGTCTCATTAACCGGTGCGGTAAGCCTCGCATCAATGCTGACGGAGATATTTCTCCTGCAACAAGCAC
AGGGAATGCCGGAGCCGGGGTGGGGAAGGATCACCGATTCACACCAGTGGAACACCTTGCTAAGTTTGCATAACGCG
CAATTTTATTTGCTACAACGCACGCCAGAGGTTGCCCGCAGCCGCGCCACCCCGTTATTAGATTTGATCAAGACAGC GTTGACGCCCCATCCACCGCAAAAACAGGCGTATGGTGTGACATTACCCACTTCAGTGCTGTTTATCGCCGGACACG
ATACTAATCTGGCAAATCTCGGCGGCGCACTGGAGCTCAACTGGACGCTTCCCGGTCAGCCGGATAACACGCCGCCA
GGTGGTGAACTGGTGTTTGAACGCTGGCGTCGGCTAAGCGATAACAGCCAGTGGATTCAGGTTTCGCTGGTCTTCCA
GACTTTACAGCAGATGCGTGATAAAACGCCGCTGTCATTAAATACGCCGCCCGGAGAGGTGAAACTGACCCTGGCAG
GATGTGAAGAGCGAAATGCGCAGGGCATGTGTTCGTTGGCAGGTTTTACGCAAATCGTGAATGAAGCACGCATACCG
GCGTGCAGTTTGTAA优化后的植酸酶基因序列如下所示(SEQ ID No 4) CAATCTGAACCAGMTTGAAGTTGGAATCTGTTGTTATCGTTTCTAGACACGGTGTTAGAGCTCCAACTAAGCCAACTCAATTGATGCAAGACGTTACTCCAGACGCTTGGCCAACTTGGCCAGTTAGATTGGGTTGGTTGACTCCAAGAGGTGGTGAATTGATCGCTTACTTGGGTCACTACCAAAGACAAAGATTGGTTGCTGACGGTTTGTTGGCTAAGAAGGGTTGTCCACAATCTGGTCAAGTTGCTATCATCCCAGACGTTGACGAAAGAACTAGAAAGACTGGTGAAGCTTTCGCTGCTGGTTTGGCTCCAGACTGTGCTATCACTGTTCACACTCAAGCTGACACTTCTTCTCCAGACCCATTGTTCAACCCATTGAAGACTGGTGTTTGTCAATTGGACAACGCTAACGTTACTGACGCTATCTTGTCTAGAGCTGGTGGTTCTATCGCTGACTTCACTGGTCACAGACAAACTGCTTTCAGAGAATTGGAAAGAGTTTTGAACTTCCCACAATCTAACTTGTGTTTGAAGAGAGAAAAGCAAGACGAATCTTGTTCTTTGACTCAAGCTTTGCCATCTGAATTGAAGGTTTCTGCTGACAACGTTTCTTTGACTGGTGCTGTTTCTTTGGCTTCTATGTTGACTGAAATCTTCTTGTTGCAACAAGCTCAAGGTATGCCAGAACCAGGTTGGGGTAGAATCACTGACTCTCACCAATGGAACACTTTGTTGTCTTTGCACAACGCTCAATTCTACTTGTTGCAAAGAACTCCAGAAGTTGCTAGATCTAG AGCTACTCCATTGTTGGACTTGATCAAGACTGCTTTGACTCCACACCCACCACAAAAGCAAGCTTACGGTGTTACTTTGCCAACTTCTGTTTTGTTCATCGCTGGTCACGACACTAACTTGGCTAACTTGGGTGGTGCTTTGGAATTGAACTGGACTTTGCCAGGTCAACCAGACAACACTCCACCAGGTGGTGAATTGGTTTTCGAAAGATGGAGAAGATTGTCTGACAACTCTCAATGGATCCAAGTTTCTTTGGTTTTCCAAACTTTGCAACAAATGAGAGACAAGACTCCATTGTCTTTGAACACTCCACCAGGTGAAGTTAAGTTGACTTTGGCTGGTTGTGAAGAAAGAAACGCTCAAGGTATGTGTTCTTTGGCTGGTTTCACTCAAATCGTTAACGAAGCTAGAATCCCAGCTTGTTCTTTGTAA突变后氨基酸序列如下所示(SEQ ID No 5)QSEPELKLESVVIVSRHGVRAPTKPTQLMQDVTPDAWPTWPVRLGWLTPRGGELIAYLGHYQRQRLVADGLLAKKGCPQSGQVAIIPDVDERTRKTGEAFAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPLKTGVCQLDNANVTDAILSRAGGSIADFTGHRQTAFRELERVLNFPQSNLCLKREKQDESCSLTQALPSELKVSADNVSLTGAVSLASMLTEIFLLQQAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFYLLQRTPEVARSRATPLLDLIKTALTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALELNWTLPGQPDNTPPGGELVFERWRRLSDNSQWIQVSLVFQTLQQMRDKTPLSLNTPPGEVKLTLAGCEERNAQGMCSLAGFTQIVNEARIPACSL3、将获得的植酸酶基因序列送生物公司合成，合成好的植酸酶基因克隆到PUC18-T载体上。
二、重组质粒pPIC9K_TP的构建所采用的酵母表达载体为pPIC9K，构建载体的宿主细胞是大肠杆菌DH5 α。I、设计引物根据新合成的植酸酶基因序列设计上下游引物FI、R1，所述引物均由上海生工公司合成，所述引物的序列如下，下划线部分碱基代表相应酶切位点表I :PCR扩增所用弓丨物
权利要求
1.一种定点突变的耐高温植酸酶基因TP，其碱基序列如SEQ ID Νο:4所示。
2.一种耐高温植酸酶,其氨基酸序列如SEQ ID Νο:5所示。
3.重组载体，其含有权利要求I所述的耐高温植酸酶基因ΤΡ。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于所述载体为PPIC9K-TP。
5.根据权利要求2所述的耐高温植酸酶在作为饲料添加剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的耐高温植酸酶在作为饲料添加剂中的应用，其特征在于所述耐高温植酸酶的用量为100-200克/吨饲料。
全文摘要
本发明提供了一种定点突变的耐高温植酸酶基因TP及其表达载体和应用，本发明先将植酸酶氨基酸序列中特定区域的氨基酸突变成脯氨酸和精氨酸，使植酸酶具有特殊的稳定蛋白质结构，同时对其基因序列按毕赤酵母菌密码子偏好性、GC含量对其基因序列进行优化合成植酸酶基因，构建重组质粒，并将重组质粒转到毕赤酵母中，筛选获得阳性转化子进行诱导表达获得耐高温植酸酶。经实验证明，由毕赤酵母表达后获得的植酸酶可以耐受85℃以上的高温制粒，存留率达到85%。所述耐高温植酸酶的推广应用，不仅对我国饲料畜牧业的发展产生可观的经济效益和社会效益，同时也可产生巨大的生态效益。
文档编号C12N9/16GK102943083SQ20121048905
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者张大伟, 王希辉 申请人:青岛根源生物技术集团有限公司