专利名称：肝素酶ii在解聚肝素前体制备低分子量肝素中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肝素酶Ii在解聚肝素前体制备低分子量肝素中的应用，以及一种利用重组肝素酶II解聚肝素前体制备低分子量肝素的方法。背景技术：
肝素是有糖醛酸和D-氨基葡萄糖以α (I — 4)糖苷键连接而成的重复双糖单位组成的糖胺聚糖家族中的一员，是具有不同链长即不同分子量的各种大小分子所组成的混合物，其分子量具有多分散性，一般在300(T30000D之间，平均分子量15000D(大约为45个单糖)。作为目前世界上使用最广泛最有效的抗凝抗血栓试剂之一，它用于临床诊断已有60 多年的历史。但其副作用也越来越明显，如大量的使用肝素会引起出血、骨质疏松等症状。
低分子量肝素(Low Molecular Weight Heparin,LMWH)是分离肝素得到的一些组分或肝素裂解产生的小片段，它可以克服肝素的一些副作用而仍保持其抗凝抗血栓活性， 因此低分子量肝素在临床上得到了广泛的应用。英国药典规定=LMWH是指重均分子量不得大于8000，分子量低于8000的物质不少于60%的肝素。
目前LMWH常用制备方法包括物理分离法和化学裂解法，但其中收率低，环境污染问题却不容忽视。
肝素酶是自然界中唯一一类能够特异性裂解肝素大分子中糖苷键的酶类，可以用来解聚肝素制备低分子量肝素，目前肝素黄杆菌(F. h印arinum)中已发现三种肝素酶 (Heparinase,简称Hep):肝素酶I,肝素酶II，和肝素酶III,各有其不同的底物特异性,主要是作用位点不同。目前大量的商业化低分子量肝素是通过以肝素酶部分解聚普通肝素获得，这同样有可能发生肝素污染等危机以及会出现肝素的硫酸化基团丢失或减少。
肝素前体(Heparosan)是某些病原菌荚膜中的糖胺聚糖成分，表达式为 [-GlcUA-β (I, 4)-GlcNAc-α (1，4)-]η (其中 GlcUA 是葡萄糖醛酸；GlcNAc 是葡萄糖乙酰胺)，是构成大肠杆菌K5和巴斯德菌D型的荚膜多糖的成分，利用巴斯德菌D型产生的 hepa rosan的分子量为200 300 KDa,而利用大肠杆菌K5产生的heparosan的分子量为 3^150 KDa，更接近于肝素的分子量大小。因此，利用大肠杆菌K5荚膜多糖h印arosan作为前体合成肝素以及硫酸乙酰肝素得到人们的广泛关注。
由于酶的特异性，目前肝素酶仅用于解聚肝素，还未有以肝素酶对肝素前体进行解聚的报道。
发明内容
本发明目的是提供肝素酶II解聚肝素前体制备低分子量肝素中的应用，并提供一种利用重组肝素酶II解聚肝素前体制备低分子量肝素的方法。
本发明采用的技术方案是
肝素酶II在解聚肝素前体(Heparosan)制备低分子量肝素(Low Molecular Weight Heparin, LMWH)中的应用。
具体的，所述应用为以肝素前体为反应底物，加入肝素酶II进行解聚，解聚后的产物再经进一步常规脱乙酰、硫酸化和异构化修饰，制得所述低分子量肝素。虽然肝素前体的多糖骨架与肝素多糖骨架类似，但是未将葡萄糖醛酸异构化为艾杜糖醛酸，也未硫酸化修饰，因此，解聚后的产物需再经进一步脱乙酰、硫酸化和异构化修饰，才能获得本发明低分子量肝素。脱乙酰方法指利用氢氧化钠脱去N-乙酰葡萄糖胺的乙酰基；硫酸化指通过与三甲基铵三氧化硫共聚物和碳酸钠反应在脱乙酰位硫酸化；所述异构化，是指利用C5-异构酶将D-GlcA异构化为L-1doA。
优选的，所述解聚在25°C下进行，反应时间1. 5h。
优选的，所述解聚在缓冲液中进行，缓冲液组成如下乙酸钠100 mM, BSA O. 01%, 乙酸钙10 mM，溶剂为水，ρΗ7· O。
优选的，所述肝素酶II为重组肝素酶II。
本发明还涉及一种利用重组肝素酶II解聚肝素前体制备低分子量肝素的方法， 所述方法包括
(I)根据已报道Flavobacterium heparinum肝素酶 II 基因序列(Genbank access number U27585.1)和氨基酸序列(Genbank access number AAB18277.1)设计引物，从肝素黄杆菌基因组DNA扩增得到肝素酶II基因片段，克隆到pET-15b表达载体中，获得重组载体 pET15b-h印B，pET15b-h印B 转化 E. coli BL21 (DE3)获得重组菌 E. coli BL21(DE3) /pET15b-hepB,重组菌经乳糖诱导后，菌液经细胞破碎后提取目标蛋白，获得重组肝素酶 II ;
(2) Heparosan与重组肝素酶II在缓冲液中于25°C下反应1. 5h,反应液经分离纯化，得到解聚后的Ifeparosan ;所述缓冲液组成为乙酸钠100 mM, BSA O. 01%,乙酸钙10 禮，溶剂为水，ΡΗ7· O ;缓冲液中Ifeparosan初始浓度为O. θΓθ. lg/mL，重组肝素酶II初始添加量为10(T500U/mL ；
(3)解聚后的Heparosan进一步进行脱乙酰、硫酸化和异构化反应,制得所述低分 子量肝素。
具体的，所述脱乙酰、硫酸化方法可如下
解聚后的Ifeparosan溶解于f 3M氢氧化钠溶液，在6(T90°C下反应3飞h，反应液进一步稀释，冷却并用盐酸调PH至7，再一步加入羧酸钠和三甲基铵三氧化硫共聚物反应12h后再加入等体积的羧酸钠和三甲基铵三氧化硫共聚物在50°C继续反应12h。反应液冷却至室温，3500 Da截留分子量cellulose membrane透析过夜,透析液冻干即获脱盐、 N-硫酸化 heparosan。
具体的，所述异构化方法可如下
20^160 ng/ml C5 差向异构酶(C-5 印imerase，C5Epi)和适量底物在含 0. 05 M Hepes, 0. 015 M EDTA,0.1 M KCl, 0. 05% TritonX-100，ρΗ7· 4 的反应系统中混合，并在37°C 反应30分钟。然后加入冷的0.05 M醋酸钠、0.05 M LiCl至pH 4. O停止反应，反应混和液进行DEAE-cellulose柱层析纯化，即得所述低分子量肝素。
本发明的有益效果主要体现在提供了肝素酶II在解聚肝素前体中的新用途，提供了一种肝素酶法制备LMWH的新途径，该方法反应条件温和，产品和酶易于分离，生产方便，而且酶可以反复使用，可进一步节约成本，具有重大应用前景。
图1为Heparinase II表达情况验证；
A中Iane1:标准蛋白分子量标记(MBI) ；lane 2、3 :无和有IPTG诱导的LB培养基培养菌体总蛋白；lane 4、5 :无和有IPTG诱导的LB培养基培养菌体超声裂解后上清液；
B中Iane1:标准蛋白分子量标记(MBI); Iane 2 :无IPTG诱导LB培养基培养的菌体总蛋白；lane3:乳糖自诱导培养基培养的菌体总蛋白；lane 4:乳糖自诱导培养基培养的菌体超声裂解后上清液5 :乳糖自诱导培养基培养的菌体超声裂解后细胞碎片。
图2为Heparinase II的N1-NTA亲和层析效果；
Iane I, 7:标准蛋白分子量标记(MBI);lane 2 :无IPTG诱导LB培养基培养的菌体总蛋白lane 3:乳糖自诱导培养基培养的菌体总蛋白；lane 4:乳糖自诱导培养基培养的菌体超声裂解后上清液；lane 5 :乳糖自诱导培养基培养的菌体超声裂解后细胞碎片； lane 6 =N1-NTA亲和柱纯化所得肝素酶II。
图3 为！feparinase II SDS-PAGE 分子量分析。
图4为Bradford法测定蛋白质含量标准曲线。
图5 为 Heparinase II 降解 Heparosan 的 PAGE 验证；Lane 1-9,肝素酶 II 解聚肝素前体样本，反应时间依次为O小时，O. 5小时，I小时，1. 5小时，2小时，2. 5小时，3小时， 3. 5小时，4小时。
图6为Heparosan在缓冲液A和B中酶解的PAGE ；Lane 1，酶解3小时；lane 2， 酶解3. 5小时；lane 3，酶解4小·时；lane 4，酶解3h;lane 5，酶解3. 5小时；lane 6，酶解 4小时。
图7为Ifeparosan在不同酶量下解聚的PAGE ；Lane 1-9, IOOul肝素酶II解聚肝素前体样本，反应时间依次为O小时，O. 5小时，1. O小时，1. 5小时，2. O小时，2. 5小时，3. O 小时，3. 5小时，4. O小时；Iane 10-18，50ul肝素酶II解聚肝素前体样本，反应时间依次为O小时，O. 5小时，1. O小时，1. 5小时，2. O小时，2. 5小时，3. O小时，3. 5小时，4. O小时。
图8为Heparosan纯品和解聚后Heparosan的1H-NMR图谱。
图9为制得的低分子量肝素的IH-NMR图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此
实施例1:重组肝素酶II的获得
UE. coli BL21(DE3)/pET15b_h印B 表达肝素酶 II
根据已报道Flavobacterium heparinum 肝素酶 II 基因序列(Genbank access number U27585.1)和氛基酸序列(Genbank access number AAB18277.1)
设计引物(H印I1-F:5’ -CATGCCATGGATGAAAAGACAATTAT-3’
HepI1-R: 5’-GGAATTCCATATGTTATCTCAAAAAACGGT-3’部分为酶切位点，上游引物加入NcoI酶切位点，下游引物加入NdeI酶切位点)，从肝素黄杆菌Flavobacteriumh印arinum基因组DNA扩增到肝素酶II (Heparinase II)基因片段(SEQ ID No. 1)，克隆到pET-15b表达载体(Novagen，WI )，获得重组载体pET15b_h印B，该载体含有一个N-末端His6-tag标签，便于重组蛋白的后续Ni2+柱亲和层析。pET15b_hepB转化E. coli BL21(DE3)获得重组菌 E. coli BL21(DE3) /pET15b_h印B。
E. coli BL21(DE3) /pET15b_h印B 在 LB 培养基中，经过 IPTG (O.1 mmol/L)诱导培养后，Heparinase II得到了表达，经过超声破碎以后，发现其蛋白主要在细胞的碎片中 (图 1A)。
Heparinase II 在自诱导培养基(8. 95 g/L Na2HPO4, 3. 40 g/L KH2PO4, 2. 68 g/L NH4Cl, O. 710 g/L Na2SO4,0. 241 g/L MgSO4,0. 0273 g/L FeCl3, 5. 00 g/L 蛋白胨，2. 50 g/L 酵母膏，2. 00 g/L葡萄糖，1. 00 g/L乳糖，and 20.0 g/L甘油，溶剂为水，pH 7. O)中，经过乳糖诱导培养后，Heparinase II同样得到了表达,经过超声破碎可以看出，与LB培养基中经IPTG诱导相比，有更多的蛋白存在于上清中，但是同样可以发现，细胞碎片中还是有一定量的目标蛋白(图1 B)。
通过对图1两种情况的比较，可以判断，自诱导培养基中用乳糖诱导有相对较好的效果。因此，实验选用自诱导培养基和乳糖诱导作为实验的培养和诱导方法，超声破碎提取蛋白，然后利用重组质粒的His-Tag标签利用N1-NTA agarose柱层析进行纯化。
已经验证利用自诱导培养基在乳糖诱导的情况下，Heparinase II的比较多的部分以存在于上清中的可溶性蛋白为主。因此，在本发明中，直接利用重组质粒上构建的 His-Tag标签，通过N1-NTA层析，确定该表达的条带即为目标条带(图2)，通过UN-SCAN-1T gel 6.1分析其条带的大小，根据marker的相对迁移位置和其对应条带分子量的对数的倒数制作标准曲线，然后根据目标条带的相对迁移位置即可计算目标条带的分子量，大小约为84. 82 kDa (图3)，和文献中分析得到的大小相近。经过UN-SCAN-1T gel 6.1软件灰度分析，Iane 6中目标蛋白的含量为96. 29%，说明纯化的效果比较好。
Bradford法测定蛋白质含量的标准曲如图4所示。其线性相关性较好，计算公式 y=217. 5χ-6· 2496，R2=O. 9968。
经过测定粗酶及经过亲和层析的酶液的蛋白含量和酶活力，计算得到纯化表，如表I所示。经过N1-NTA亲和层析后，蛋白得到有效纯化，纯化了约2. 6倍，收率为41. 90%， 根据SDS-PAGE条带灰度分析，蛋白的纯度为96. 29%。
表1:Heparinase II 一步纯化表
权利要求
1.肝素酶II在解聚肝素前体(Heparosan)制备低分子量肝素(LowMolecular WeightHeparin, LMWH)中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用为以肝素前体为反应底物，加入肝素酶II进行解聚，解聚后的产物再经进一步脱乙酰、硫酸化和异构化修饰，制得所述低分子量肝素。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述解聚在25°C下进行，反应时间1.5h。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述解聚在缓冲液中进行，缓冲液组成如下乙酸钠100 mM, BSA 0. 01%,乙酸钙10 mM，溶剂为水，pH7. O。
5.如权利要求f4之一所述的应用，其特征在于所述肝素酶II为重组肝素酶II。
6.一种利用重组肝素酶II解聚肝素前体制备低分子量肝素的方法，所述方法包括 (1)从肝素黄杆菌基因组DNA扩增得到肝素酶II基因片段，克隆到pET-15b表达载体中，获得重组载体pET15b-h印B，pET15b-h印B转化E. coli BL21 (DE3)获得重组菌E. coliBL21 (DE3) /pET15b-hepB,重组菌经乳糖诱导后，菌液经细胞破碎后提取目标蛋白，获得重组肝素酶II ; (2)Heparosan与重组肝素酶II在缓冲液中于25°C下反应1. 5h,反应液经分离纯化，得到解聚后的Jfeparosan ;所述缓冲液组成为乙酸钠100 mM,BSA 0. 01%，乙酸钙10禮，溶齐[J为水，PH7. 0 ;缓冲液中Ifeparosan初始浓度为0. Of 0. lg/mL，重组肝素酶II初始添加量为 100 500U/mL ； (3)解聚后的Heparosan进一步进行脱乙酰、硫酸化和异构化，制得所述低分子量肝素。
全文摘要
本发明提供肝素酶II在解聚肝素前体制备低分子量肝素中的应用，以及一种利用重组肝素酶II解聚肝素前体制备低分子量肝素的方法。本发明提供了肝素酶II在解聚肝素前体中的新用途，提供了一种肝素酶法制备LMWH的新途径，该方法反应条件温和，产品和酶易于分离，生产方便，具有重大应用前景。
文档编号C12N9/26GK102994593SQ20121048862
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月26日 优先权日2012年11月26日
发明者钟卫鸿, 吴石金, 黄海婵, 邱乐泉, 钟莉, 吕沈聪, 赵雷, 严子琴, 王畅 申请人:浙江工业大学