重组人尿胰蛋白酶抑制剂的生产方法

专利名称：重组人尿胰蛋白酶抑制剂的生产方法
重组人尿胰蛋白酶抑制剂的生产方法技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种重组人尿胰蛋白酶抑制剂的生产方法。
背景技术：
早在1985年，日本就将从人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制剂(h-UTI)用于临床实践，而国内1994年广州天普(Techpool)生化医药股份有限公司也将提取的h_UTI用于临床。h-UTI的主要适应症为急性胰腺炎，慢性胰腺炎的急性发作，急性循环衰竭，肿瘤、休克和外科手术中辅助用药，防治顺钼化疗时对肾功能的损伤，AIDS的辅助治疗以及先兆流产的预防和治疗等。该提取成分临床疗效明确、副反应小、生产成本低，但是作为从人尿中提取的一类药物，由于其含量低、收集人尿困难、分离纯化成本高；再加上不可避免各种病毒污染的可能性，限制了该产品的广泛应用。
能采用基因重组的手段获得重组人尿胰蛋白酶抑制剂(Recombinant Human Urinarytrypsin irmibitor, rh-UTI)是一项能将基础和应用研究有机结合的工作,但是， 早年有报道称h-UTI糖蛋白分子中的硫酸软骨素分子是h-UTI发挥胰蛋白酶抑制剂作用的必要部分(Selloum, L.，etal.，Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 368 4755,1987)，因此,在非哺乳动物细胞表达系统(如，E. coli，酵母)中产生的rh-UTI能不能形成正确的糖基化修饰是非常关键的。但是，德国的Bayer Aktiengesellschaft公司1995年申请的美国专利(US5407915, Human bikunin variants as proteinase inhibitors, and medicaments containingthese)就很好地证明了糖基化并非是其活性所必须的,该专利中还描述 了啤酒酵母表达的rh-UTI分子的N-端有严重的不均一性问题60% rh-UTI具有天然的N-端， 而40%的N-端少一个丙氨酸(Ala)。之后，有许多研究都表明，E. coli重组表达的rb-UTI 同样具对胰蛋白酶等酶抑制作用(fcithma :nn，T.，etal J Biol Chem. ,272(17) :1117111175，1997)，很明显，糖基化修饰在h-UTI分子中的作用需要重新审视。不过用现有的酵母或大肠杆菌生产rh-UTI的产量太低，加之蛋白的均一性不能保证，虽有一些研究报道， 但是一直没有规模化生产和动物模型试验方面的研究报道，因此，有关rh-UTI的临床价值仍然十分难以确定。发明内容
本发明的目的在于克服现有的生产重组人尿胰蛋白酶抑制剂的缺陷，提供一种产量高，质量有保证的生产重组人尿胰蛋白酶抑制剂的方法。
本发明是这样实现的
一种生产重组人尿胰蛋白酶抑制剂(th-UTI)的方法，包括
将人的h-UTI基因与人血白蛋白的第一个结构域基因序列(SEQ ID N0:1)融合后，插入到专门的表达载体PlCZa中表达,构造的工程菌种按照Invitrogen的发酵操作手册中的程序，在30L发酵罐中进行发酵，其中发酵过程的关键性参数是pH6. 0、30°C、溶氧在 20% -30%之间，诱导时间为50小时；诱导结束后离心收集发酵上清液，添加NaCl，用NaOH调节发酵上清液的PH至7. 4，添加磷酸盐至终浓度为50mM，膜过滤即得可用于Ni2+_螯合层析上样的发酵液；50mM咪唑洗脱下Do1-UTI融合蛋白，脱盐并将Do1-UTI转换到肠激酶的酶切缓冲溶液中，酶切完成后再过螯合层析介质和离子交换介质就可以得到th-UTI。
更进一步的方案是所述的专门的表达载体PlCZa是指线性化的PlCZa-Dol-UTI 表达载体。
更进一步的方案是所述的表达菌株是65115.^11，65115.^12和65115.^18菌株中的任意一种。
在本发明中，需要对有关缩写进行说明，h-UTI是人尿胰蛋白酶抑制剂的英文名 Humanurinary trypsin inhibitor的缩写,根据上下文是指人尿胰蛋白酶抑制剂蛋白或其基因，本专利中的h-UTI作蛋白含义时特指源于人尿的胰蛋白酶抑制剂，它具有特别的人源性糖基化修饰；DoI是特指人血白蛋白的三个结构域(Domain)，中的第一个结构域，所以 DoI实质是HSA DomainI的简写，是一段多肽，如果是HBSA Domainl的基因序列一般会描述为DoI基因或基因片段；Do1-UTI特指由DoI基因和h_UTI基因片段通过连接肽连接而成的融合基因或融合基因表达出的，Do1-UTI融合蛋白，一旦切开Do1-UTI融合蛋白后，释放出来的h-UTI部分就特称rh-UTI，以区别从尿中提取的天然的h-UTI ；fh-UTI是指通过重组DNA技术在非哺乳动物细胞QBE. col1、酵母、昆虫细胞等)中直接或间接表达出来的有糖基化或没有糖基化修饰，但具有同天然h-UTI或Bikunin相同或相近的氨基酸序列组成， 并且生物学功能也相当的一类基因重组入尿胰蛋白酶抑制剂蛋白分子的通称。
本发明创造性地将人的h-UTI基因与人血白蛋白的三个结构域(Domain)中的第一个结构域进行融合，从而能够解决酵母中表达h-UTI均一性以及表达产量不高等技术难题。最终制备的rh-UTI纯度可以达到99%以上，生物活性大于2500U/mg。


图1限制性核酸内切酶随机筛选重组DNA分子(表达质粒)的琼脂糖凝胶电泳分析图2SDS-PAGE分析发酵上清液中融合蛋白质的表达量及酶切分析融合蛋白质图3为SDS-PAGE分析酶切表达的融合蛋白图；具体实施方式
一种生产重组人尿胰蛋白酶抑制剂(rh-UTI)的方法，包括
将人的h-UTI基因与人血白蛋白的第一个结构域基因序列融合后，插入到专门的表达载体PlCZa中表达,构造的工程菌种按照Invitrogen的发酵操作手册中的程序,在30L 发酵罐中进行发酵，其中发酵过程的关键性参数是pH6.0、30°C、溶氧在20% -30%之间，诱导时间为50小时；诱导结束后离心收集发酵上清液，添加NaCl，用NaOH调节发酵上清液的 PH至7. 4，添加磷酸盐至终浓度为50mM，膜过滤即得可用于Ni2+_螯合层析上样的发酵液； 50mM咪唑洗脱下Do1-UTI融合蛋白，脱盐并将Do1-UTI转换到肠激酶的酶切缓冲溶液中， 酶切完成后再过螯合层析介质和离子交换介质就可以得到rh-UTI。所述的专门的表达载体PlCZa是指线性化的PICZa-Dol-UTI表达载体。所述的表达菌株是GSl 15. UTII，GSl 15. UTI2和GSl 15. UTI8菌株中的任意一种。
为了进一步增加本申请制备的rh-UTI在工业上的应用，可以对rh-UTI进行如下的纯化步骤
I)采用超滤浓缩样品，并置换缓冲液。
2) Chelating Sepharose F. F 亲和层析
3) Q Sepharose F. F 阴离子层析
4) SP Sepharose F. F 阳离子层析
通过以上几步层析，得到的样品纯度可以达到99%以上，生物活性大于2500U/mg ο
对于本发明得到的重组人尿胰蛋白酶抑制剂的性质确证
在甲醇酵母中以融合分泌表达的Do1-UTI，在SDS-PAGE电泳时的表观分子量约 45kDa，这同Do1-UTI融合蛋白的理论分子量40. 2kDa相差5kDa左右，大量研究证明DoI 分子没有糖基化修饰等蛋白后修饰发生，所以融合蛋白Do1-UTI分子中增加的5kDa是 N-糖基化和O-糖基化等修饰后糖链部分。将融合蛋白Do1-UTI酶切，再经过一系列的纯化步骤就获得了 143个氨基酸残基组成糖蛋白分子rh-UTI，其蛋白质部分的理论分子量是15. 47kDa，理论等电点pi约为4. 545，但是我们在酵母中获得的rh-UTI分子的丽在 23 24kDa之间，实际测定的pi为4. 5-5. O之间。虽然大量的实验研究证明天然和重组的h-UTI对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白、弹性蛋白酶、纤维蛋白溶酶、精子醇素(Acrosin)、组织蛋白酶B (Cathepsin)、组 织蛋白酶H、溶酶体硫醇蛋白酶(Lysosomal thiol protease)等都有很强的抑制作用，但是我们试验研究发现天然的h-UTI对肠激酶和凝血酶均不具有抑制作用，这也正是采用融合表达并用肠激酶切割触合蛋白的这一设计思路的实验基础。用天普公司生物提取的UTI (注射用乌司他丁)作对照,采用Iketa等方法(Iketa,K. ,Agric Biol Chem, 42 (4) :309312，1978)测定 rh-UTI 的活性，发现 rh-UTI 同天然的 h_UTI 没有明显区别。
本发明得到的重组人尿胰蛋白酶抑制剂的药效学试验
rh-UTI具有天然h_UTI的全部功能，它可以抑制许多丝氟酸蛋白酶的活性。具有广泛的临床用途，用急性胰腺炎动物模型试验结果表明，rh-UTI同天然的h-UTI —样，对急性胰腺炎的诊断、防治和预后应该具有重要意义。
下面结合附图进行具体说明，附图1为限制性核酸内切酶随机筛选重组DNA分子 (表达质粒)的琼脂糖凝胶电泳分析图；其中1_4(从上到下，后相同)，6-7，9-10，12-13， 15号样品均为初步筛选的重组DNA分子；附图2为SDS-PAGE分析发酵上清液中融合蛋白质的表达量及酶切分析融合蛋白质图；其中1_3(从左至右)发酵上清液中融合蛋白质的表达量，4-5融合蛋白质酶切后释放出目的蛋白质UTI，6，蛋白质分子量标准品；附图3为 SDS-PAGE分析酶切表达的融合蛋白图；图中从左到右1-5分别是1，蛋白质分子量标准品， 2-3纯化后的UTI，4-5未纯化的融合蛋白质。
权利要求
1.一种生产重组人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于包括将人的h-UTI基因分别与人血白蛋白的第一个结构域基因序列融合后，插入到专门的表达载体PlCZa中表达,构造的工程菌种按照Invitrogen的发酵操作手册中的程序,在30L发酵罐中进行发酵，其中发酵过程的关键性参数是pH6.0、30°C、溶氧在20% -30%之间，诱导时间为50小时；诱导结束后离心收集发酵上清液，添加NaCl，用NaOH调节发酵上清液的PH至7. 4，添加磷酸盐至终浓度为50禮，膜过滤即得可用于Ni2+-螯合层析上样的发酵液；50mM咪唑洗脱下Do1-UTI融合蛋白，脱盐并将Do1-UTI转换到肠激酶的酶切缓冲溶液中，酶切完成后再过螯合层析介质和离子交换介质就可以得到rh-UTI。
2.根据权利要求1所述生产重组人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于所述的专门的表达载体PlCZa是指线性化的PlCZa-Dol-UTI表达载体。
3.根据权利要求1所述生产重组人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于所述的表达菌株是GSl 15. UTII, GSl 15. UTI2和GSl 15. UTI8菌株中的任意一种。
全文摘要
本发明公开了生产重组人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，将人的h-UTI基因分别与人血白蛋白中的第一个结构域基因序列融合后，插入到专门的表达载体PlCZa中表达，构造的工程菌种在发酵罐中进行发酵培养，诱导结束后，离心收集发酵上清液，添加NaCl，用NaOH调节发酵上清液的pH至7.4，添加磷酸盐至终浓度为50mM，膜过滤得可用于Ni2+-螯合层析上样的发酵液。50mM咪唑洗脱下DoI-UTI融合蛋白，脱盐并将DoI-UTI转换到肠激酶的酶切缓冲溶液中，酶切完成后再过螯合层析介质和离子交换介质得到rh-UTI。本发明能解决酵母中表达h-UTI均一性以及表达产量不高等难题。
文档编号C12N15/81GK103014057SQ20121048861
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者苟兴华, 邬晓用, 邹亮, 刘达玉, 王卫, 唐仁勇, 邹凯 申请人:成都大学