专利名称：重组二聚化人尿胰蛋白酶抑制剂、其制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及一种具有与天然人尿胰蛋白酶抑制剂类似或更高生物活性的重组人尿胰蛋白酶抑制剂二聚体、其制备方法及应用。
背景技术：
人尿膜蛋白酶抑制剂(human Urinary Trypsin Inhibitor, hUTI),也称为乌司他丁或尿抑素，是含有两个Kunitz结构域的蛋白酶抑制剂类的糖蛋白。hUTI存在于正常人的尿液和血液中，分子量约为40kD。hUTI具有多种生理活性，如对丝氨酸蛋白酶家族的抑制作用，其中丝氨酸蛋白酶家族包括胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、血纤维蛋白溶酶、组织蛋白酶-G和白细胞弹性蛋白酶。hUTI还具有免疫调节作用，可下调促炎症细胞因子的释放，例如肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白介素-1 (IL-1)和白介素(IL_6)(参见Park等，J Korean Med Sci, 25 :128_34，2010 ;Sato 等，Jpn J Thorac Cardiovasc Surg, 48 428-34,2000 ;Park 等，Korean J Anesthesiol, 58 334-37,2010 ；Inoue 等，Expert OpinInvestig Drugs, 19 513-20 2010 ;Yang 等，Biologicals 38:552-6,2010 ;Pugia 等，ClinChem Lab Med43 :1-16，2005 ;Pugia 等，Adv Clin Chem 44:223_245，2007)。此外，hUTI还通过中和I3DGF-D (PDGF-DD) /PDGF-BBR活性二聚体而干扰其介导的信号通路，进而抑制恶性间皮瘤细胞的转移，通过抑制肿瘤细胞的增殖和下调CXCL4和MMP-9蛋白的表达，可显著降低乳腺癌移植裸鼠模型中的乳腺肿瘤的生长(参见Yaguchi等，Cancer Lett 288 214-18,2010 ;Sun 等，J Int Med Res 38 :967_76，2010 ;Kobayashi 等，Biol Chem 384 749-754，2003)，提示hUTI在肿瘤治疗方面具有潜在用途。此外，进一步研究证实hUTI可抑制多种组织中胰蛋白酶和其它蛋白酶的水解活性，并发挥局部或全身抗炎作用(参见Bae 等，Inflammation35 176-82, 2012 ;Takano 等，Lab Invest 89 833-9, 2009 ;Inoue 等，J Clin Biochem Nutr43 :139-142，2008 ;Ueki 等，J Biosci Bioeng 104:315-20,2007;Molor-Erdene 等，Thromb Haemost 94 136-45, 2005 ；Hirose 等，Biol Pharm Bull 21 651-56,1998 ;Wu等，Hepatobiliary Pancreat Dis Int 8 :53_8,2009)。在对实施全身麻酉卒的高危手术患者体内静脉注射hUTI，可以改善血液微循环，缓解炎症反应。此外，hUTI还可用于多种急性炎症的治疗，包括急性胰腺炎、系统性炎症反应综合症、急性循环衰竭、弥散性血管内凝血(DIC)和多器官功能障碍综合征(参见Jong In Han,Korean J Anesthesiol,58 325-327,2010)。动物模型研究显示， hUTI对内毒素介导的休克反应以及肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用(参见 Inoue 等，Expert Opin Investig Drugs, 19 :513_20，2010 ;Wu 等，Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 8 :53_58, 2009)。hUTI 还在其它多种肺,肝脏,心脏,肾脏病感染模型中发挥作用(参见Bao等，Eur J Pharmacol 603 :114_9，2009 ;Kim等，Cardiology I14:264_70，2009 ;Matsuo 等，Thromb Res 52 :237_45，1988 ;Saitoh 等，Anesth Analg 89 :1565-9,1999 ；Mastumoto 等，Masui 38 :531_9，1989 ；Aoike 等，Nephron52 368-9,1989)。在一项临床研究中，hUTI联合胸腺素α -1可增加重度脓毒症患者的存活率(参见 Li 等，JIntensive Care Med, 24 =47-53,2009) 另一项临床研究中，hUTI 对治疗由SARS病毒引起的急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫症(ARDS)显示有效(参见美国专利 US 7，470，666)。早在1985年，日本Mochida公司从人尿中提取的hUTI就获得上市许可，商品名"Miraclid"。其主要适应症为胰腺炎和休克所致的急性循环衰竭。其它类似的产品包括中国的广州天普生化医药公司(Techpool)生产的“注射用尿抑素”、韩国Han Lim制药公司生产的"Ulistin"、韩国Kolon制药公司生产的"Ustatin"，和韩国Yu Young制药公司生产的"Statin"。目前，临床上hUTI被广泛用于治疗急性胰腺炎、慢性胰腺炎的急性发作、急性循环衰竭、弥散性血管内凝血(DIC)、肿瘤、休克和外科手术中辅助用药，防治顺钼化疗时对肾功能的损失、AIDS的辅助治疗以及先兆流产的预防和治疗等。目前，市场上商品化的hUTI制剂产品都从人尿中提取，但作为从人尿中提取的一类药物，如何避免病毒污染和保证产品的质量稳定性是很大的技术难题，因检测方法及病毒灭活技术的局限性以及一些不可预知的新致病病毒感染时有发生，并不能完全杜绝尿源性产品发生病毒污染的可能性。此外，尿源hUTI还存在原料来源有限、采集困难及纯化过程复杂的问题。目前，尿源hUTI虽然在适应症上取得了突破，并在中国、日本、韩国获准上市，但在美国和欧洲等发达国家仍不允许动物提取的成分作为药品进行临床试验和最终上市。相比而言，重组hUTI在其纯度、抗原性、安全性、无自身尿源性病毒感染等方面具有尿源hUTI无法比拟的优点，展示出广阔的医用前景。因此，用基因重组技术来获得大量高活性hUTI蛋白是较好的选择,而迄今世界上尚未有重组hUTI药品上市。
尿胰蛋白酶抑制剂被用作治疗性蛋白药物，必备的条件是要有正确的三维构像，有生理活性和无抗原性应答。对于用基因重组技术制备出来的蛋白，宿主在生产过程中应包括糖基化和二硫键形成，以及其他翻译后修饰过程。重组制备药用rhUTI需考虑上述问题。随着基因重组技术的广泛应用，采用酵母表达系统，纯化的rhUTI在体外具有抑制胰蛋白酶的活性。德国拜耳公司(参见美国专利US 5,407,915)用啤酒酵母表达rhUTI蛋白具有体外活性，但其N-端有严重的不均一性问题60% hUTI具有天然N-端，而40% N-端少一个丙氨酸(Ala)。此外，酵母表达的重组rhUTI蛋白，其表达量很低，目前报导的最高产量仅为 55mg/L (参见 Jian-qiu Wang 等，Protein Expr Purif, 60 :127-31, 2008 ;美国专利 US5，407，915)。此外，酵母表达的rhUTI蛋白易产生不同于天然蛋白的翻译后修饰过程，可能导致体外活性的降低和/或其它副作用，例如诱发免疫反应。之后，有许多研究都表明，细菌表达的rhUTI同样具有抑制胰蛋白酶的作用(参见Brinkmann T等，J Biol Chem, 272 11171-11175，1997)，但原核系统对蛋白没有剪切及加工功能，其表达的蛋白在结构与活性等方面与天然蛋白有较大差异，同时也存在产量太低的问题。因此，酵母或大肠杆菌都不是重组 rhUTI 的理想表达系统(参见 Brooks SA, Mol Biotechnol，28 :241_55，2004)。事实上,工业上仅有少数治疗性蛋白药物,如白蛋白(Recombumin ，由Novozymes公司生产)和快速起效胰岛素类似物(Humalog ，由Eli Lilly公司生产)因翻译后修饰过程简单，选用酵母作为表达系统。现有技术中，虽有一些采用酵母系统表达rhUTI的研究报道，但是一直没有rhUTI规模化生产和动物模型试验方面的研究数据被公开。具有完善翻译后修饰功能是哺乳动物细胞被选作大多数生物药表达宿主的主因。总体来说，由哺乳动物细胞表达的重组蛋白具有正确的三维折叠构象以及类似于天然蛋白分子的糖基化修饰。其中，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell7CHO)是用于真核生物外源基因表达最为成功的宿主细胞，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，很多药物已投放市场，如EPO、G-CSF等。与其它表达系统相比，它具有许多优点(1)准确的翻译后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子；(2)表达产物能胞外分泌，便于分离纯化；(3)具有外源基因的高效扩增和表达能力；(4)有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中高密度生长，培养体积能达到1000L以上；(5) CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，有利于外源蛋白的分离纯化。然而，有报道称由中国仓鼠卵巢细胞表达的rhUTI会产生大量凝集，导致活性大部分丧失。其蛋白凝集是由蛋白间非天然二硫键之间的共价交叉连接所致(参见 Seefeldt MB 等，Pr`otein Sci, 13 =2639-50,2004) 在健康受试者中，静脉注射(1. v.)hUTI后的O至3小时，其血浆半衰期约为33分钟，约占90%的注射仙11已被清除。在之后的4个小时，此阶段清除速率放缓，其半衰期约为2小时。在注射7小时后，血浆中残留的hUTI仅剩1% (参见Jonsson-Berling等，Scand J Clin Lab Invest，51 :549_57，1991)。对输注hUTI的大鼠进行药代动力学及组织学分布研究显示，肾脏是hUTI主要的降解和排泄器官。此外，采用免疫组化的方法，观察到hUTI在人正常组织以及病变组织中分布和定位于肾小球(参见Yoshida等，Cancer，64 860-9，1989)。虽然hUTI在血浆中的清除机制尚不明确，肾脏应是其主要的分解代谢器官。由于hUTI的体内循环半衰期较短，且hUTI在使用过程中安全性好，副作用少，目前国内报道的诸多应用文献中，仅有几例出现皮疹，未出现过敏性休克和重要脏器损害。市售hUTI的推荐临床使用剂量为5 20万单位，每天I 3次。在临床应用中，证实随着hUTI剂量的加大，其疗效更显著，且无明显副作用。这使得可以开发其长效类似物，以减少给药次数，降低药物在体内的波动，提高患者的依从性。为了延长hUTI的体内循环半衰期，可通过增加hUTI的分子量，来减缓肾脏的清除作用。该策略被应用于多种长效制剂的开发，例如增加EPO ( Aranesp^由Amgen公司研发)的N-糖基化位点，或将PEG分子连接于G-CSF ( Neulasta*,由 Amgen 公司研发)。IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质。它们的半衰期可高达21天，而Fe片段是IgG保持体内较长半衰期的主要原因，同时具有稳定蛋白的作用。重组hUTI在其纯度、抗原性、安全性、无自身尿源性病毒感染等方面具有尿源hUTI无法比拟的优点，展示出良好的医用前景。但目前仍存在rhUTI表达量低、体内半衰期短以及活性差等技术问题。
发明内容
本发明旨在提供一种重组二聚化hUTI蛋白、其制备方法及应用，以解决现有技术中rhUTI表达量低、体内半衰期短以及活性差的技术问题。为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种重组二聚化hUTI蛋白。该重组二聚化hUTI蛋白从N端到C端依次包含人UT1、肽接头和人IgG Fe变体的氨基酸残基序列，其中，人IgG Fe变体选自如下组(i)含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；(ii)含有Ser228Pro和heu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域；(iii)含有 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突变的人 IgGl 绞链区、CH2 和 CH3 区域。进一步地，肽接头含有2-20个氨基酸残基，且肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸残基。进一步地，肽接头的氨基酸残基序列如SEQ ID NO : 7所示。进一步地，重组二聚化hUTI蛋白的氨基酸残基序列如SEQ ID NO :2、4或6所示。进一步地，重组二聚化hUTI蛋白的氨基酸残基序列是去除了 I到19位氨基酸残基的hUTI前导肽之后的SEQ ID NO :2、4或6所示的氨基酸序列。根据本发明的另一方面，提供了一种编码上述重组二聚化hUTI蛋白的DNA序列。进一步地,该DNA序列具有SEQ ID NO :1、3或5所示的DNA序列。根据本发明的再一方面,提供一种载体,该载体包含上述DNA序列。根据本发明的再一方面，提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含上述载体。进一步地，宿主细胞是CHO的衍生细胞株，即包含上述载体的CHO细胞株。根据本发明的再一方面，提供一种药物组合物，该药物组合物包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效量的上述重组二聚化hUTI蛋白。根据本发明的再一方面，提供一种上述重组二聚化hUTI蛋白的制备方法，该方法是米用上述宿主细胞制备而来。
根据本发明的又一方面，上述重组二聚化hUTI蛋白在制备用于治疗肿瘤、急性胰腺炎、慢性胰腺炎的急性发作、急性循环衰竭、弥散性血管内凝血、多器官功能性障碍综症、系统炎症反应综合症、休克的药物，外科手术中辅助用药，改善血液微循环、缓解炎症、防治顺钼化疗时对肾功能的损失、AIDS的辅助治疗以及先兆流产的预防和治疗的药物中的应用。以下具体介绍本
发明内容
Fe 元件Fe元件来自免疫球蛋白的Fe区域，Fe在消灭病原体的免疫防御中具有重要作用。IgG的效应子功能由Fe介导，通过两种主要机制(I)与细胞表面Fe受体(FcyRs)的结合，通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)途径消化病原体，或(2)与第一补体成分Cl的Clq部分的结合，引发依赖于补体的细胞毒性(CDC)途径，从而裂解病原体。在四种人IgG同种型中，IgGl和IgG3能有效的结合Fe Y Rs0 IgG4与Fe Y Rs的结合亲和力比IgGl和IgG3的低一个数量级，而IgG2与Fe YRs的结合低得难以测定。人IgGl和IgG3还能有效地结合Clq，并激活补体级联反应。人IgG2对补体的固定很弱，而IgG4表现极端缺乏激活补体级联的能力(参见Jefferis R等，Immunol Rev，163 :59_76，1998)。对于医疗用途而言，重组二聚化蛋白的Fe区域必须不会介导效应子功能而裂解或除去这些细胞。因此，hUT1-L-Fc的Fe区域必须是非裂解性的，即在结合Fe Y Rs和Clq而触发效应子功能方面，Fe最好是无活性的。显然，没有一种天然的IgG同种型适合产生hUT1-L-Fc重组二聚化蛋白。为了得到非裂解性的Fe，必须使天然Fe区域中的一些氨基酸突变，以减少其效应子功能。通过比较人和鼠的IgG同种型的氨基酸序列，CH2区域氨基末端附近的Fe部分显示在IgG Fe与Fe Y Rs的结合中起作用。基因工程抗体已经证明在234位至237位基序的重要性 Duncan AR 等，Nature, 1988, 332 :563_564)。按 Kabat 等人(参见 Sequences ofProteins of Immunological Interest,第 5 版，United States Department of Healthand Human Services, 1991)所述的EU编号体系将氨基酸残基编号。在四种人IgG同种型中，IgGl和IgG3%FcyRs的结合最好，且具有相同的序列Leu234-Leu_Gly-Gly237 (图1仅显示了 IgGl)。在以低亲和力与FcyRs结合的IgG4中，其序列含有单个氨基酸取代，Phe取代234位的Leu。在不结合FcyRs的IgG2中，两个取代和一个缺失形成Val234-Ala-Gly237 (图1)。为了减少Fe与Fe Y Rs的结合和ADCC活性，用Ala替代IgG4中的 Leu235(参见 Hutchins JT 等，Proc Natl Acad Sci USA，92 :11980_11984，1995)。IgGl抗体内的Glu233-Leu-Leu235序列曾被用IgG2中的Pro233-Val_Ala235相关序列来替换。这种改变使IgGl变体在小鼠中失去了透过Fe Y R-介导除去靶点细胞的能力(参见Isaacs JD 等，J Immunol,161 :3862_386，1998)。对于Fe Y R与Clq结合非常重要的第二部分位于人IgG的CH2区域羧基端附近(Duncan AR等，Nature，332 :738_740，1988)。在四种人IgG同种型中，这部分中仅有一个位点显示取代用IgGU IgG2和IgG3中的Ala330和Pro331替代IgG4中的Ser330和Ser331 (图1)。Ser330的存在不影响Fe Y R与Clq的结合。用Ser替代Pro331使IgGl失去了与Clq的结合亲和力，而用Pro替代Ser331部分保留了 IgG4补体固定活性(参见TaoMH 等，J ExpMed, 178 :661_667，1993 ；Xu Y 等，J Biol Chem, 269 :3469_3474，1994)。肽接头
连接肽的长度对重组二聚化蛋白的活性非常重要。已有人报道了促红细胞生成素(EPO)衍生物(如二聚物)，与EPO单体相比，含有2个完整的EPO区域(相隔3到7个氨基酸肽接头)的重组二聚化蛋白表现出减弱的活性(参见Qiu H等，J Biol Chem,273 :11173-11176，1998)。然而，当这两个EPO区域间的肽接头的长度为17个氨基酸时，二聚体EPO分子的体外和体内生物活性明显提高(Sytkowski AJ等，J Biol Chem, 274 24773-24778，1999 ;美国专利No. 6，187，564)。这可能解释为重组二聚化蛋白两部分间增加的连接肽，使该分子的两部分能分别行使其功能(参见Ashkenazi A等，Curr Opin inImmunol,9 :195-200,1997)。本发明人经过长期而深入的研究，首次设计了一种独特的绞链区肽接头来降低空间位阻效应，可以制得hUTI的C端与Fe变体偶联的重组二聚化蛋白，中间有柔软的肽接头。此重组二聚化蛋白不仅不会导致hUTI的功能丧失，反而能够维持、甚至提高hUT1-Fc重组二聚化蛋白的生物活性。优选肽接头的氨基酸残基序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer0此外，本发明还发现，在hUTI和人IgG Fe变体间添加的肽接头以两种方式提高hUT1-L-VFc的体外生物活性(I)使Fe区域远离hUTI上的结构域，和(2)使一个hUTI远离另一个hUTI的结构域，从而降低空间位阻效应。且人的IgG Fe变体在CH2区域在228、234、235、331位点含有氨基酸突变，从而降低Fe的效应子功能。重组二聚化蛋白及其制备方法本发明重组二聚化蛋白由CHO细胞生产，经标准化纯化程序制备。根据本发明所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，通过分段合成核苷酸序列再进行基因亚克隆拼接的方法来构建本发明的全长基因编码核酸序列。
本发明还提供了一种表达载体，包含编码本发明的重组二聚化蛋白的DNA序列以及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。表达载体可采用市售的例如但不限于pcDNA3、pIRES、pDR、pBK、pSP0RT等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的重组二聚化蛋白的DNA编码序列插入合适的限制性位点，获得本发明的重组表达载体。本发明还提供了表达本发明重组二聚化蛋白的宿主细胞，其中含有本发明的重组二聚化蛋白的DNA编码序列。所述的宿主细胞优选的是真核细胞，例如但不限于CHO，COS细胞，293细胞，RSF细胞等。作为本发明的优选方式，所述的细胞是CHO细胞，其可较佳地表达本发明的重组二聚化蛋白，可获得生理活性良好，稳定性良好的重组二聚化蛋白。
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本发明还提供一种用重组DNA技术制备本发明重组二聚化蛋白的方法，其步骤包括I)提供编码重组二聚化蛋白的核酸序列；2)将I)的核酸序列插入到合适的表达载体，获得重组表达载体；3)将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；4)在适合表达的条件下培养宿主细胞；5)筛选高表达的稳定细胞系；6)收集上清液，并纯化重组二聚化蛋白产物。将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。有关宿主细胞的培养和表达可参见Olander RM Dev Biol Stand 1996 ;86 :338。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集上清液。可通过琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定。可将上述制备获得的重组二聚化蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。例如，当重组蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜来分离所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司产品，首先将表达上清浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析(DEAE等)或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。可利用含有所述重组二聚化蛋白的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的重组二聚化蛋白进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。可选择地，所述的重组二聚化蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA, c-Myc,6-His或8_His等。这些标签可用于对重组二聚化蛋白进行纯化。药物组合物本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量(如O. 000001-90wt% ;较佳的O. 1-5(^七％;更佳的，5_40wt%)的本发明的重组二聚化蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将有效量的本发明重组二聚化蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中PH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。药学上可接受的载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。本发明所述的重组二聚化蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验。所述的因素包括但不限于所述的重组二聚化蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。根据本发明一种典型的实施方式，重组二聚化hUTI蛋白从N端到C端依次含有人UT1、肽接头和人Ig G Fe变体(表示为hUT1-L-vFc)。其中，IgG Fe变体是无裂解性的，且与天然IgG Fe相比含有氨基酸突变。较佳地，其中人Ig Fe变体含有选自以下的变体绞链区、CH2和CH3区域(A)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgGl ； (B)含有 Pro331Ser 突变的人 IgG2 ;和(C)含有 Ser228Pro 和 Leu235Ala 突变的人IgG4。较佳地，使用约2-20个氨基酸长度的、含有以下2种或多种氨基酸构成的柔性肽接头甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸，如本发明一实施例中所公开的优选序列为SEQ ID 7 (GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGly GlySerGlyGlyGlyGlySer)。优选地，本发明所述的重组二聚化hUTI蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2、4或6所示，其成熟蛋白为去除了 hUTI前导肽(I到19位氨基酸残基)之后SEQ ID N0:2、4或6所示的氨基酸序列，其中，人Ig Fe变体含有绞链区、CH2和CH3区域。其CH2区域在228、234、235和331位(由EU编号体系确定的位置)含有氨基酸突变，从而降低Fe的效应子功倉泛。根据本发明一种典型的实施方式，提供一种编码上述重组二聚化hUTI蛋白的DNA序列。优选地，该DNA序列具有SEQ ID NO :1、3或5所示的DNA序列。根据本发明一种典型的实施方式，提供一种载体，该载体包含上述DNA序列。根据本发明一种典型的实施方式，提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含上述载体。优选地，宿主细胞是CHO的衍生细胞株。
根据本发明一种典型的实施方式，本发明的药物组合物包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的本发明所述的重组二聚化hUTI蛋白。本发明的重组二聚化hUTI蛋白一般地应用于急性胰腺炎、慢性胰腺炎的急性发作、急性循环衰竭、肿瘤、休克和外科手术中辅助用药，防治顺钼化疗时对肾功能的损失、AIDS的辅助治疗以及先兆流产的预防和治疗等。根据本发明一种典型的实施方式，提供一种从哺乳动物细胞系如CHO衍生的细胞系制备或生产这种重组二聚化hUTI蛋白的方法。培养转染的细胞系，使得重组二聚化hUTI蛋白在其生长培养基中在24小时期间以超过100 (最佳的为300) yg/io6(百万)个细胞的水平下表达。这些hUT1-L-vFc 二聚体蛋白显示出高度的体外和体内生物活性和延长的体内血清半衰期而无不良副作用，从而改善了药物动力学和药效，进而降低了实现类似药效所需的剂量和注射次数。此外，本发明所公开的重组二聚化hUTI蛋白的制备方法，表达产量高且因与IgGFe变体的偶联,所形成的重组二聚化蛋白可以通过Protein A亲和层析得到高效便捷的纯化。本发明一优选实施例中，将CHO细胞株在IOOmL摇瓶中培养15天，其表达的重组二聚化蛋白累积产量为3g/L(图6)。在细胞培养的第5天至第11天间，活细胞数目最多约为6 X IO6个/mL，在此条件下，分泌率测定为50 μ g/106个细胞/24小时。本发明的重组二聚化hUTI蛋白及其制备方法的优点概括如下1. Fe与hUTI偶联形成的二聚体蛋白，在CHO细胞中具有很高的表达量，比hUTI在CHO细胞中表达量高30倍，比在酵母细胞中的表达量高60倍。2.纯化工艺 高效便捷、大大降低生产成本。3.本发明所表达的重组二聚化hUTI蛋白与天然hUTI具有类似的体外生物学活性和高出38倍的体内生物学活性(摩尔比活性)。4.本发明所表达的重组二聚化hUTI蛋白体内循环半衰期延长，血清中药物浓度波动的减少，安全性提高，耐受性的改善，降低注射频率而提高患者的生活质量。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
图1显示了人IgGl、IgG2、IgG4和它们变体的绞链区和CH2区域的氨基酸序列的比对。比较这三部分氨基酸序列氨基酸区域228、234-237和330-331。这些变体的氨基酸突变以粗斜体显示。氨基酸残基编号是根据EU编号体系标定。图2显示了在PCDNA3表达载体内HindII1-EcoRI片段的hUT1-L-vFc Y 2的核苷酸序列(同SEQ ID 1)及推导的氨基酸序列(同SEQ ID 2)。hUTI由信号肽(1_19)、成熟hUTI蛋白(20-162)构成。成熟的重组二聚化蛋白含有hUTI (20-162)、肽接头(163-178)和 Fe Y 2 变体(179-401)。图3显示了在PCDNA3表达载体内HindII1-EcoRI片段的hUT1-L-vFc Y 4的核苷酸序列(同SEQ ID 3)及推导的氨基酸序列(同SEQ ID 4)。hUTI由信号肽(1_19)、成熟hUTI蛋白(20-162)构成。成熟的重组二聚化蛋白含有hUTI (20-162)、肽接头(163-178)和 Fe Y 4 变体(179-407)。图4显示了在PCDNA3表达载体内HindII1-EcoRI片段的hUT1-L-vFc Y I的核苷酸序列(同SEQ ID 5)及推导的氨基酸序列(同SEQ ID 6)。hUTI由信号肽(1-19)、成熟hUTI蛋白(20-162)构成。成熟的重组二聚化蛋白含有hUTI (20-162)、肽接头(163-178)和 Fe Y I 变体(179-405)。图5显示了所构建hUT1-L-vFc重组二聚化蛋白基因的真核表达质粒的基因图谱。该表达质粒全长9063bp，含有10个主要基因片断，包括LhCMV启动子；2.目标基因hUT1-L-vFc ；3. EMCV IRES ；4. mDHFR 筛选基因；5. bGH 中止序列；6. SV40 启动子；7.卡拉霉素抗性基因；8. SV40中止序列；9. ColEl复制子；10.氨苄青霉素抗性基因。图6显示了 300ml摇瓶内细胞株的生长及其分泌hUT1-L-vFc蛋白的浓度趋势曲线图。图7显示了重组hUT1-L-vFc纯化蛋白(由▼表示)与天然尿源hUTI纯化蛋白(由 表示)的体外活性比较。UTI的IC50值为8L5±6.0nM，UT1-Fc的IC50值为70. 9±1· 5nM。图8显示了重组hUT1-L-vFc纯化蛋白与天然尿源hUTI在雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠动物模型的体内活性比较。尿源hUTI在很高剂量(40mg/Kg)才能看见对血清淀粉酶急剧上升期的微弱抑制作用(8% )，在低剂量(lmg/Kg)时看不见任何抑制作用；而hUT1-L-vFc在低剂量(3mg/Kg)就看见对血清淀粉酶急剧上升期的显著抑制作用(26%，p< O. 005)，在中等剂量(30mg/Kg)时抑制作用更加明显(53%，p < O. 001)。考虑它们分子大小的差别，重组二聚体hUT1-L-vFc的作用剂量要比尿源hUTI的的作用剂量低38倍，而且药效更好。图9显示了 hUT1-L-vFc纯化蛋白(Lane 2)与天然尿源hUTI (lane 3)的10%SDS-PAGE蛋白电泳图谱。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例1.构建编码hUT1-L-vFc重组二聚化蛋白的基因表达载体编码hUTI前导肽和成熟蛋白的基因采用人工合成的办法获得，将所合成的506bpDNA片段插入转移载体如PUC57中的EcoRV限制性酶切位点间，获得了 phUTI质粒，其所含hUTI基因的序列可由DNA测序验证。柔性肽Linker 与人 IgG Fe 区域 Fcy2 变体 vFcy2 (Pro331Ser 突变)、Fcy4 变体 vFcY4(Ser228Pro 和 Leu235Ala 突变)、Fcyl 变体 vFcYl (Leu234Val、Leu235Ala 和Pro331SSer突变)的融合基因由人工合成的方法获得，所合成的片段5’和3’端各有一个限制性酶内切位点，分别为BamHI和EcoRI。将获得的DNA片段插入到转移载体如PUC19的BamHI和EcoRI位点间，得到PL-vFC Y质粒。由DNA测序验证L-vFc γ基因序列。为制备hUT1-L-vFc Y融合基因，将phUTI质粒用SpeI和BamHI进行双酶切，电泳后再胶回收hUTI片段。经纯化的hUTI片段被插入到PL-VFC Y质粒中肽接头的5’ -端，连接构成phUT1-L-vFc Y质粒。所构建的融合基因由汕11、617-5虹组成的肽接头以及？(^变体基因组成。将获得的完整的编码hUT1-L-vFcy重组二聚化蛋白的基因序列经HindIII/EcoRI双酶切后，插入到哺乳动物细胞表达质粒如P⑶NA3 (Invitrogen)的相应酶切位点间。如图5所示，最终获得的融合基因表达质粒pCDNA3-hUT1-L-vFc Y，该质粒含巨细胞病毒早期启动子，它是哺乳动物细胞高水平表达外源基因所需的增强子。该质粒还含有选择性标记物，从而在细菌中可以具有氨苄青霉素抗性，而在哺乳动物细胞中可以具有G418抗性。另外，当宿主细胞是DHFR基因表达缺陷型时，P⑶NA3表达载体所含有的小鼠的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，使其在氨甲蝶呤(MTX)存在时，能共扩增hUT1-L-vFcY融合基因和DHFR基因(美国专利4，399，216)。在人UTI和Fe部分间存在的(且彼此化学结合)的肽接头(较佳地为柔性接头)增加了 UTI区域的柔性且提高了它的生物活性。对本发明而言，优选的是长度为约20个或更少(但不能少于2个)氨基酸的肽接头，当然由I个氨基酸构成的肽接头也在本发明的保护范围内。宜使用含有或由2个或更多选自以下氨基酸构成的肽接头甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。一种肽接头的例子含有Gly-Ser肽构件,如GlyGlyGlyGlySer。图2、图3、图4分别显示了含三种Fcy变体融合基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列，它们共同含有编码人 UT1、16-氨基酸肽接头(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)和各自含有编码 Fcy2 变体 vFcy2 (hUT1-L-vFc Y 2) ,Fcy4 变体 vFcY4(hUT1-L_vFc Y 4)或Fcyl 变体 vFcYl (hUT1-L-vFc y ^ 的序列。实施例2-6中具体实验时所采用的hUT1-L-vFc均为hUTI_L-VFcY2，当然可以用同样的方法对本发明要求保护的其他重组二聚化hUTI进行操作。实施例2.重组二聚化蛋白在稳定转染细胞系中的表达将重组的表达载体质 粒P⑶NA3-hUT1-L-vFcY2转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达hUT1-L-vFcY2重组二聚化蛋白。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷型CHO-细胞(美国专利No. 4，818，679)。一种优选的转染方法是电穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸钙共沉降、脂转染和原生质融合。在电穿孔中，用设置为250V电场和960 μ Fd 电容的 Gene Pulser Flectroporator (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA),在比色杯内的2 5 X IO7个细胞中加入IOygffi PvuI线性化的质粒DNA。在转染两天后，将培养基改成含O. 6mg/mL G418的生长培养基。用抗人IgG Fe的ELISA分析方法，筛选对选择用药具有抗性的转染子。也可用抗hUTI的ELISA分析方法进行表达重组二聚化蛋白的定量。通过极限稀释96孔组织培养板，亚克隆产生高水平Fe重组二聚化蛋白的孔。实施例3.重组hUT1-L-vFc 二聚化蛋白的生产为了实现重组二聚化蛋白高水平的表达，宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中，用DHFR基因共扩增转染的重组二聚化蛋白基因。用极限稀释法亚克隆能在高达I μ g/mL MTX培养基中生长的转染子。对亚克隆细胞系的分泌率作进一步分析。筛选分泌水平超过约100(较佳地约200) μ g/106(即百万)个细胞/24小时的细胞系，使其在无血清培养基中悬浮生长。本发明筛选到的一高产量细胞株，首先在培养皿中进行无血清驯化培养，然后转移到摇瓶中进行悬浮驯化培养。在IOOmL摇瓶中培养15天，图6显示了其表达的重组二聚化蛋白累积产量为3g/L。在细胞培养的第5天至第11天间，活细胞数目最多约为6X IO6个/mL，在此条件下，分泌率测定为50 μ g/106个细胞/24小时。为了得到更多的hAT-L-vFc重组蛋白，也可以选用2000ml摇瓶培养。最后用条件培养基纯化重组二聚化蛋白。实施例4.重组hUT1-L-vFc 二聚化蛋白的纯化与定性分析用IN NaOH将含有重组二聚化蛋白的条件培养基滴定到pH 7 8，然后用O. 45微米的硝酸纤维素过滤器过滤。将滤液加样到磷酸盐缓冲液盐水(PBS)平衡的Pros印A柱上。待重组二聚化蛋白结合于Prosep A后,弃去流出的组分。用PBS洗漆该柱,直到280nm处的OD值低于O. 01。然后用O.1M pH为3. 75的柠檬酸缓冲液洗脱结合的重组二聚化蛋白。用O. 4体积的IM K2HPO4中和，合并含有纯化蛋白的组分，并用PBS透析。然后用O. 22微米的硝酸纤维素过滤器过滤，并存储在-70°C。如图9中所示，由SDS-PAGE测得的尿源hUTI (乌司他丁，天普生化)(Lane3)的分子量显示为38kD。在相同条件下，经纯化的重组hUT1-L-vFc (Lane2)迁移至约55kD处(粗条带)，因糖基化形式的差异性，另有较少量的其他高分子量蛋白迁移至约70kD处(细条带)。用BSA作为标准，通过BCA蛋白质分析定量该重组二聚化蛋白。实施例5.体外活性检测 本发明中CHO细胞培养上清中分泌的或经纯化的重组hUT1-L-vFc蛋白的生物学活性采用现有技术中公认的标准操作方法测定(参见Kakade等，Cereal Chem,46 :518-526，1969)，通过测定体系中胰蛋白酶的残留活性的来判断。反应体系中以BAPNA(N a-Benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride, Sigma-Aldrich 公司)作为猪胰蛋白酶(Sigma-Aldrich公司)的底物。反应混合物中包含20 μ I经稀释的hUTI蛋白、纯化的hUT1-L-vFc重组二聚化蛋白或hUT1-L-vFc转化子的培养上清，5 μ I胰蛋白酶(100mg/ml，溶于含2. 94g/L CaCl2的ImM HCl中)，用0. 2M三乙醇胺缓冲液调至终体积为125 μ I。将反应混合物在37°C摇床中孵育20min，加入5 μ I ΒΑΡΝΑ (25mg的ΒΑΡΝΑ溶解在最小体积的DMSO中，并用0. 2Μ三乙醇胺缓冲液调节终浓度至10mg/ml)，然后在37°C摇床中继续孵育20min。加入30μ I的30% (ν/ν)冰醋酸终止反应。反应同时需设置空白对照和胰蛋白酶对照。在405nm处读取其吸光值。图7显示了尿源hUTI或纯化的重组hUT1-L-vFc二聚化蛋白的摩尔浓度(nM)与其参比活性的对应关系。在上述条件下，hUTI的IC5tl值约为 81. 5±6· OnM，而经纯化的 hUT1-L-vFc 蛋白约为 70. 9±1· 5nM。实施例6.体内活性检测本发明中纯化的重组hUT1-L-vFc蛋白的体内活性用Caerulein(雨蛙素)诱导的急性胰腺炎小鼠动物模型来评估(参见Ding等，Hepatobiliary Pancreat. Dis.1nt. ,9 645-650,2010 ;Galuppo 等，Br J. Pharmacol. ,2011 ；162 :1186-1201)。雨蛙素注射法是目前比较常用的一种建立急性胰腺炎的动物模型的方法。其特点是不需手术，对机体内环境影响较小，操作简便，易于复制，重复性好；所致急性胰腺炎在形态、生化改变、时间进程上与人的急性胰腺炎相似。Caerulein是胆囊收缩素的类似物，可以激活CCK受体。CCK受体是G蛋白偶联受体，激活后可以通过PLC-1P3信号通路引起胰腺腺泡细胞滑面内质网中钙离子释放，进而激活NADPH超氧歧化酶，使ROS生成增加，I K B α磷酸化，最终导致NF κ B激活，炎症相关因子如TNF α，IL_6，N0等表达增加。大量炎症相关因子的相互作用促进胰腺局部炎症逐步发展系统性炎症反应(多器官衰竭综合症)。因此ROS导致的氧化应激反应被认为是急性胰腺炎发展的重要致病环节。实验中取8周龄的C57BL/6雄性小鼠30只，20-22g，随机分为5组，6只/组。提前禁食不禁水15小时。各组间隔I小时caerulein50 μ g/kg,连续注射6次。各组分别在第I次和第5次注射caerulein后,尾静脉注射不同剂量的尿源hUTI (乌司他丁)或重组hUT1-L-vFc。各组动物于最后一次注射caerulein后的不同时间点从小鼠眼眶取血约200 μ I。血液室温下放置O. 5小时，6000rpm离心10分钟，制备血清。-70°C冻存。样品送至国家上海新药安全评价研究中心，用日立7060全自动生化检测仪检测血清淀粉酶的含量，来评估受试药品的作用效果。在上述小鼠急性诱导胰腺炎动物模型中，血清淀粉酶在最后一次注射雨蛙素后迅速上升，3小时后达到峰值，然后缓慢回落，至24小时后回到起点。根据我们的实验观察，最后一次注射雨蛙素后I小时是最佳药效观测时间点。尿源hUTI在很高剂量(40mg/Kg)才能看见对血清淀粉酶急剧上升期的微弱抑制作用(8% )，在低剂量(lmg/Kg)时看不见任何抑制作用；而仙11-1^亦(3在低剂量(3mg/Kg)就看见对血清淀粉酶急剧上升期的显著抑制作用(26%，P < O. 005)，在中等剂量(30mg/Kg)时抑制作用更加明显(53%，p < O. 001)。重组二聚体hUT1-L-vFc的理论分子量是尿源单体hUTI的5倍，如果考虑两者可能的糖基化程度不同，从图9上来看，重组二聚体hUT1-L-vFc的实际分子量大约是尿源hUTI的3倍。根据以上分子量的差别，等同于尿源hUTI摩尔数的重组hUT1-L-vFc很高剂量(120mg/Kg)在实验小鼠中无法实施。考虑它们分子大小巨大差别，重组二聚体hUT1-L-vFc的作用剂量要比尿源hUTI的的作用剂量低38倍，而且药效更好。实施例7.融合蛋白的药代动力学测定SD大鼠单剂量(2mg/Kg)尾静脉注射hUT1-L-vFc样品，选取不同时间点抽取SD大鼠的血液样品，肝素抗凝，离心后的上清液用ELISA方法测定血浆中的融合蛋白含量。用ELISA测定时，用羊抗人 的Fe的多抗进行包埋、辣根过氧化物酶标记的鼠抗人hUTI的单抗来检测。实施例4中纯化hUT1-L-vFc样品的血浆半衰期约为910分钟，而纯化尿源hUTI半衰期约为182分钟，所以本发明中重组hUT1-L-vFc体内半衰期大幅度延长。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种重组二聚化hUTI蛋白，其特征在于，所述重组二聚化hUTI蛋白从N端到C端依次包含人UT1、肽接头和人IgG Fe变体的氨基酸残基序列， 其中，所述人IgG Fe变体选自如下组 (i)含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域； (ii)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域； (iii)含有Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突变的人 IgGl 绞链区、CH2 和 CH3 区域。
2.如权利要求1所述的重组二聚化hUTI蛋白，其特征在于，所述肽接头含有220个氨基酸残基，且所述肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸残基。
3.如权利要求2所述的重组二聚化hUTI蛋白，其特征在于，所述肽接头的氨基酸残基序列如SEQ ID NO 7所示。
4.如权利要求1所述的重组二聚化hUTI蛋白，其特征在于，所述重组二聚化hUTI蛋白的氨基酸残基序列如SEQ ID NO:2、4或6所示。
5.如权利要求1所述的重组二聚化hUTI蛋白，其特征在于，所述重组二聚化hUTI蛋白的氨基酸残基序列是去除了 I到19位氨基酸残基的hUTI前导肽之后的SEQ ID NO :2、4或6所示的氨基酸序列。
6.编码如权利要求1至5中任一项所述的重组二聚化hUTI蛋白的DNA序列。
7.如权利要求6所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列具有SEQID ΝΟ:1、3或5所示的DNA序列。
8.—种载体,其特征在于,包含如权利要求6或7所述的DNA序列。
9.一种宿主细胞,其特征在于,包含如权利要求8所述的载体。
10.如权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是CHO的衍生细胞株。
11.一种药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效量的权利要求1所述的重组二聚化hUTI蛋白。
12.—种如权利要求1至5中任一项所述的重组二聚化hUTI蛋白的制备方法，其特征在于，采用如权利要求9或10所述的宿主细胞制备所述重组二聚化hUTI蛋白。
13.如权利要求1至5中任一项所述的重组二聚化hUTI蛋白在制备用于治疗肿瘤、急性胰腺炎、慢性胰腺炎的急性发作、急性循环衰竭、弥散性血管内凝血、多器官功能性障碍综症、系统炎症反应综合症、休克的药物，外科手术中辅助用药，改善血液微循环、缓解炎症、防治顺钼化疗时对肾功能的损失、AIDS的辅助治疗以及先兆流产的预防和治疗的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种重组二聚化hUTI蛋白、其制备方法及应用。其中，该重组二聚化hUTI蛋白。该重组二聚化hUTI蛋白从N端到C端依次包含人UTI、肽接头和人IgG Fc变体的氨基酸残基序列。该重组二聚化hUTI蛋白具有与人尿源胰蛋白酶抑制剂类似的体外生物学活性和更高的体内生物学活性，以及延长的体内半衰期。
文档编号C12N5/10GK103044554SQ20121014690
公开日2013年4月17日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者李强, 孙乃超, 周若芸, 武栋栋, 刘瑞贤, 金宜慧 申请人:旭华(上海)生物研发中心有限公司