专利名称：一种奇异变形杆菌菌株及其转化大豆苷元生产s-雌马酚的方法
技术领域：
本发明涉及一种奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)菌株(LH-52)及该菌株将大豆中富含的大豆苷元(daidzein)直接转化为高活性植物雌激素S-雌马酚(S-equol)的方法，属于生物化工领域。
背景技术：
大豆异黄酮具有与雌激素雌二醇类似的结构，被广泛称为“植物雌激素(phytoestrogen)”。大量的研究发现以大豆苷元(daidzein)和染料木素(genistein)为主要成分的大豆异黄酮具有非常广泛的生物学活性，除了雌激素样作用外还具有抗氧化、调节细胞周期等功能。雌马酚(equol)为大豆苷元的肠道菌代谢产物，相对于大豆苷元和染料木素而言，雌马酚具有更高的雌激素活性和抗氧化活性。病理学研究表明equol在预 防乳腺癌，前列腺癌，骨质疏松症以及更年期综合症方面有显著疗效。特别是作为雌二醇类似物，可以与雌激素受体结合，在治疗更年期综合症以及乳腺增生、乳腺癌等雌激素分泌失调疾病上有显著疗效。然而Lampe Jff, Karr SC, Hutchins AM等的研究表明，由于肠道菌群、饮食结构等的不同，大约只有309Γ45%的人群体内能产生equol，也就是说人类摄入大豆制品或者大豆异黄酮后，并非所有人都能在体内产生equol，对于非雌马酚产生者而言摄入大豆制品或大豆异黄酮所产生的健康效应相对弱于雌马酚产生者。因此研究雌马酚的合成机制及筛选生产菌种，进一步合成高生物活性的雌马酚对人类健康而言具有重要的意义。雌马酹具有两种不同的手性结构R-equol和S-equol,其中S_equol是生物天然合成的形态，与雌激素受体具有更强的结合力。S-equol对β_人体雌激素受体(β -Estrogen Receptor,简称β-ER)的亲和力要比R-型雌马酹高13倍、比消旋体雌马酹(equol)高两倍。雌马酚的合成途径目前主要有化学合成和生物合成两种，其中化学方法合成的雌马酚为外消旋体雌马酚，而生物合成的雌马酚全部为S-equol，因而生物合成法更适用于相关药物和食品添加剂的生产。韩国专利PTC/KR2005/001285公布了一种能将二氢大豆苷元转化为S-雌马酚的革兰氏阴性菌株Eggerthella Julong 732,但该菌株却不能直接将大豆苷元转化为S-雌马酚。二氢大豆苷元是大豆苷元的加氢还原产物，目前虽然能以大豆苷元为原料通过化学氢转移法进行合成，但价格昂贵。此外有文献报道通过混合菌培养，先将大豆苷元转化为二氢大豆苷元然后再使用Eggerthella Julong 732将二氢大豆苷元转化为S-雌马酚，但此方法混合菌的接种比例以及接种时机难以控制，并且培养条件苛刻，比较难以实现。国内专利CN 101338294B和CN 102021130A描述的不动杆菌AUH-JLM455以及双酶梭菌菌株为严格厌氧菌，相比较而言本发明的奇异变形杆菌为兼性厌氧菌，培养条件更为粗放，更适合于工业化生产。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种奇异变形杆菌菌株LH-52及其转化大豆苷元(daidzein)生产S-雌马酚的方法。本发明解决了现有技术中存在的转化制备S-雌马酚难以实现的问题，提供一种能将潜手性化合物大豆苷元直接转化为手性化合物S-雌马酚的单一功能微生物菌株及其制备方法。相对于以往报道的严格厌氧雌马酚转化菌株以及混合菌转化，本发明得到的奇异变形杆菌Proteus mirabilis LH-52菌株为兼性厌氧菌，更适合于工业生产。本发明为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案—种奇异变形杆菌菌株LH-52,该LH-52菌株保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC M 2011390，保藏日期为2011年11月13日。所述的奇异变形杆菌Proteus mirabilis菌株LH-52的制备方法如下I.样品的采集 取大鼠肠道盲肠5厘米内的肠道内容物，悬浮于生理盐水中，过滤去除其中的固形物，然后取滤液200微升接种于新鲜灭菌的液体培养基中37°C厌氧活化培养24小时。其中所述的新鲜液体培养基配方为蛋白胨27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化钠5. O克/升，磷酸氢二钠2. 5克/升。2.样品的抗生素抑制与特定功能菌株的分离筛选(I)样品的抗生素抑制取100微升活化后菌株分别接种于新鲜灭菌并添加大豆苷元(终浓度为100微摩尔/升)以及分别对应以下一种抗生素(所述的抗生素采用诺氟沙星、土霉素、琥乙红霉素、硫酸庆大霉素)的液体培养基内，于37°C培养4天后用高效液相色谱仪检测是否有雌马酚产生，从而得出结论为添加土霉素的一组有雌马酚产生。其中所述的新鲜液体培养基配方为蛋白胨27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化钠5. O克/升，磷酸氢二钠2. 5克/升。(2)单一菌落的分离筛选用新鲜灭菌的液体培养基(所述的新鲜液体培养基配方为蛋白胨27.5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化钠5. O克/升，磷酸氢二钠2. 5克/升。)将添加土霉素组的菌群液进行梯度稀释，分别稀释为 10-1、10_2、10' 10_4、I O-5、10' 10' 10_8、10_9、ΙΟ—1。倍，再分别取 40微升上述稀释倍数的微生物菌群稀释液均匀涂布在预先准备好的固体培养基(上述液体培养基添加15克/升的琼脂)上，将涂布微生物菌群稀释液的固体培养基于37°C厌氧培养12小时之后，从固体培养基上挑取单菌落并划线在斜面培养基上(培养基成分同上述固体培养基)，37°C厌氧培养18 24小时，同时对单菌落进行随机编号。(3)具有转化功能的单菌落筛选准备含100微摩尔/升大豆苷元并灭菌的新鲜液体培养基(所述的新鲜液体培养基配方为蛋白胨27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化钠5. O克/升，磷酸氢二钠2. 5克/升。)，分装入10毫升的厌氧瓶内，分别接种入已编号的单菌落并于37°C培养4天，然后用高效液相色谱仪检测，结论为有雌马酚生成的对应单菌落即为具有转化功能的单菌落。3.单一功能微生物菌种的纯化培养、菌种初步鉴定与保藏(I)单菌落的纯化培养
将筛选出的单一微生物菌落在固体培养基(上述液体培养基添加15克/升的琼月旨)上反复纯化培养3次，确保菌落形态一致，将纯化的单一菌株接种到已灭菌的液体培养基活化培养24小时，之后菌液添加30%甘油混合均匀并保藏在-83°C的超低温冰箱内，并定期进行复壮培养和转化活性测定。(2)对筛选出的单一功能微生物菌株进行菌种鉴定根据菌落及菌体形态、革兰氏染色、常规生化鉴定以及16S rDNA基因测序等多项指标，将分离到的功能菌株LH-52初步鉴定为奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)菌株。本发明的奇异变形杆菌(Proteus mirabilis) LH-52具有以下微生物学特性I、形态学特征在显微镜下观察在液体培养基中培养的菌株时，菌体呈杆状，具有运动能力，菌体长度3飞微米，革兰氏染色阴性。 2、培养学特征在37°C下，固体培养基中培养时，本发明菌株呈膜状的白色干燥菌落。3、生理特征本发明的菌株是一种兼性厌氧菌，在35 37°C下显示最佳生长能力，本发明的奇异变形杆菌(Proteus mirabilis) LH-52与奇异变形杆菌的生理生化特征上的异同见表I。一种奇异变形杆菌菌株转化大豆苷元生产S-雌马酚的方法，包括以下步骤I)奇异变形杆菌菌株LH-52的培养将保藏号为CCTCC M 2011390的奇异变形杆菌菌株LH-52，37°C厌氧活化培养12 18小时后，接种于已灭菌的新鲜液体培养基。2)底物的加入采用大豆苷元(daidzein)作为底物；按照I : 100的接种量将步骤I)中菌液接种于含100微摩尔/升底物大豆苷元的灭菌液体培养基，继续厌氧37°C培养4天，即可转化底物为S-雌马酚。3)代谢产物的分离纯化将步骤2)中得到的培养物浓缩后用3倍体积的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液并用旋转蒸发仪蒸干，然后加入100%纯甲醇溶解，在半制备型高效液相色谱仪上可分离制备得到S-雌马酚。所述步骤I)和步骤2)中的液体培养基配方为蛋白胨27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化钠5. O克/升，磷酸氢二钠2. 5克/升。代谢产物的手性纯度检测将培养物萃取液蒸干后，用100%纯甲醇溶解，在Daicel OJ-H手性柱上进行检测，检测条件如下A相为正己烷，B相为异丙醇，A:B=70:30，检测器波长280nm。对比外消旋标准品以及S-雌马酚标准品的HPLC图谱确定产物的手性，并计算对映体过量值(％e. e)。本发明的有益效果是本发明解决了现有技术中存在的转化制备S-雌马酚难以实现的问题，提供一种能将潜手性化合物大豆苷元直接转化为手性化合物S-雌马酚的单一功能微生物菌株及其制备方法。相对于以往报道的严格厌氧雌马酚转化菌株以及混合菌转化，本发明得到的奇异变形杆菌Proteus mirabilis LH-52菌株为兼性厌氧菌,更适合于工业生产。
本发明的奇异变形杆菌LH-52菌株已于2011年11月13日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC M 2011390 ；表I是本发明奇异变形杆菌菌株LH-52与奇异变形杆菌的生理生化特征比较表；图I为本发明实施例中大鼠肠道分离菌株LH-52转化大豆苷元为S-雌马酚的代谢过程图；图2为本发明实施例中大鼠肠道分离菌株LH-52转化大豆苷元的发酵萃取液的HPLC图谱；图3为本发明实施例中大豆苷元与雌马酚标准品的HPLC图谱；图4为本发明实施例中大鼠肠道分离菌株LH-52转化大豆苷元代谢产物的质谱图；
图5为本发明实施例中外消旋雌马酚和大豆苷元的混合标准品手性柱HPLC图谱；图6为本发明实施例中S-雌马酚标准品手性柱HPLC图谱；图7为本发明实施例中发酵萃取液手性柱HPLC图谱。
具体实施例方式下面通过附图和具体实施对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。本实施例的一种奇异变形杆菌菌株LH-52,该LH-52菌株于保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC M 2011390，保藏日期为2011年11月13日。所述的奇异变形杆菌Proteus mirabilis菌株LH-52的制备方法如下I.样品的采集取大鼠肠道盲肠5厘米内的肠道内容物，悬浮于生理盐水中，过滤去除其中的固形物，然后取滤液200微升接种于新鲜灭菌的液体培养基中37°C厌氧活化培养24小时。其中所述的新鲜液体培养基配方为蛋白胨27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化钠5. O克/升，磷酸氢二钠2. 5克/升。2.样品的抗生素抑制与特定功能菌株的分离筛选( I)样品的抗生素抑制取100微升活化后菌株分别接种于新鲜灭菌并添加大豆苷元(终浓度为100微摩尔/升)以及分别对应以下一种抗生素(所述的抗生素采用诺氟沙星、土霉素、琥乙红霉素、硫酸庆大霉素)的液体培养基内，于37°C培养4天后用高效液相色谱仪检测是否有雌马酚产生，通过液相色谱图比对，得出结论为添加土霉素的一组有雌马酚产生。其中所述的新鲜液体培养基配方为蛋白胨27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化钠5. O克/升，磷酸氢二钠2.5克/升。(2)单一菌落的分离筛选用新鲜灭菌的液体培养基(所述的新鲜液体培养基配方为蛋白胨27.5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化钠5. O克/升，磷酸氢二钠2. 5克/升。)将添加土霉素组的菌群液进行梯度稀释，分别稀释为 10-1、10_2、10' 10_4、I O-5、10' 10' 10_8、10_9、10_10 倍，再分别取 40微升上述稀释倍数的微生物菌群稀释液均匀涂布在预先准备好的固体培养基(上述液体培养基添加15克/升的琼脂)上，将涂布微生物菌群稀释液的固体培养基于37°C厌氧培养12小时之后，从固体培养基上挑取单菌落并划线在斜面培养基上(培养基成分同上述固体培养基)，37°C厌氧培养18 24小时，同时对单菌落进行随机编号。(3)具有转化功能的单菌落的筛选准备含100微摩尔/升大豆苷元并灭菌的新鲜液体培养基(所述的新鲜液体培养基配方为蛋白胨27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化钠5. O克/升，磷酸氢二钠2. 5克/升。)，分装入10毫升的厌氧瓶内，分别接种入已编号的单菌落并于37°C培养4天，然后用高效液相色谱仪检测，通过液相色谱图比对，得出的结论为有雌马酚生成的对应单菌落即为具有转化功能的单菌落。3.单一功能微生物菌种的纯化培养、菌种初步鉴定与保藏( I)单菌落的纯化培养 将筛选出的单一微生物菌落在固体培养基(上述液体培养基添加15克/升的琼月旨)上反复纯化培养3次，确保菌落形态一致，将纯化的单一菌株接种到已灭菌的液体培养基活化培养24小时，之后菌液添加30%甘油混合均匀并保藏在_83°C的超低温冰箱内，并定期进行平板划线分离复壮培养以及用高效液相色谱对菌株转化活性进行测定。(2)对筛选出的单一功能微生物菌株进行菌种鉴定根据菌落及菌体形态、革兰氏染色、常规生化鉴定以及16S rDNA基因测序等多项指标，将分离到的功能菌株LH-52初步鉴定为奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)菌株。本发明的奇异变形杆菌(Proteus mirabilis) LH-52具有以下微生物学特性I、形态学特征在显微镜下观察在液体培养基中培养的菌株时，菌体呈杆状，具有运动能力，菌体长度3飞微米，革兰氏染色阴性。2、培养学特征在37 °C下，固体培养基中培养时，本发明菌株呈膜状的白色干燥菌落。3、生理特征本发明的菌株是一种兼性厌氧菌，在35 37°C下显示最佳生长能力，本发明的奇异变形杆菌(Proteus mirabilis) LH-52与奇异变形杆菌的生理生化特征上的异同见表I。本实施例的一种奇异变形杆菌菌株转化大豆苷元生产S-雌马酚的方法，包括以下步骤I)将保藏号为CCTCC M 2011390的奇异变形杆菌菌株LH-52用接种环将2 3环奇异变形杆菌菌株Proteus mirabilis LH-52接种在10毫升灭菌的新鲜液体培养基中，37°C厌氧活化培养12 18小时；所述的新鲜液体培养基配方为蛋白胨27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化钠5. O克/升，磷酸氢二钠2. 5克/升。2)底物的加入采用大豆苷元(daidzein)作为底物；按照I : 100的接种量接种于含100微摩尔/升底物大豆苷元的灭菌液体培养基，继续37°C厌氧培养4天；即可转化底物为S-雌马酚。3)代谢产物的分离纯化将步骤2)中得到的培养物浓缩后用3倍体积的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液并用旋转蒸发仪蒸干。加入100%纯甲醇溶解，在半制备型高效液相色谱仪上可分离制备得到S-雌马酌·。A.代谢产物S-雌马酚的制备
将上述步骤得到的S-雌马酚培养液蒸干后的粗提品溶解在100%甲醇中，过O. 22 μ m尼龙滤膜后，在高效液相色谱上进行分离，最终得到8. 3毫克的S-雌马酚纯品(纯度>95%)。本发明中使用依利特P230型高效液相色谱仪，所用制备柱为Angilent 5 μ m C18色谱柱(250X9. 4mm)，选用甲醇和水作为流动相，HPLC分离制备时，A液为甲醇，B液为水，A B=55 45，流动相流速为2毫升/分，检测器波长设置为280纳米。B.代谢产物的结构鉴定(I)根据代谢产物与标准品雌马酚在高效液相色谱仪上的保留时间初步确定代谢产物为雌马酚。如图I所示，其为大鼠肠道分离菌株LH-52转化大豆苷元为雌马酚的过程图。如图2所示，其为大鼠肠道分离菌株LH-52转化大豆苷元的发酵萃取液的HPLC图
-i'Tfe P曰。如图3所示，其为混合标准品大豆苷元和雌马酚的HPLC图谱。由图2和图3所示，本实施例制备的雌马酚保留时间为13. 881分钟，标准品雌马酚的保留时间为13. 829分钟，可以初步确定为本实施例制备的产品为雌马酚。(2)代谢产物的质谱测定(ESI-TOF MS)如图4所示，菌株LH-52转化大豆苷元的代谢产物的质谱表明，该代谢产物的分子离子峰为m/z 241 [Μ-ΗΓ，这与雌马酚的分子量(C15H14O3)相一致。(3)代谢产物的核磁共振图谱大鼠肠道分离菌株LH-52转化大豆苷元的代谢产物的核磁共振氢谱和碳谱与以往报道的雌马酚的氢谱和碳谱基本一致，具体结果如下1H NMR (500MHz, CDCl3) δ 7. I 2 (d, 9. OHz, 2Η) , 6. 95 (d, 8. OHz, 1Η),6. 82 (d, 8. OHz，2Η)，6. 40 (dd, 2. 5Ηζ, 9. OHz，I H)，6. 37 (d, 2. 5Hz, 1Η)，4. 30 (dd, 10. OHz, 2. 5Hz, 1Η)，3. 97 (t, 10. 5Hz, 1Η)，3. 17 (m, 1Η)，2. 94 (m, 2Η)。13C 匪R(125MHz, CDCl3) δ 155. 1，154. 9，154. 5，133. 6，130. 4，128. 6，128. 6，115. 6，115. 6，114. 4，108. 0,103. 2,71. 1,37. 9,31. 8。C.代谢产物雌马酚手性征测定如图6所示为S-雌马酚标准品的手性柱HPLC图谱，图5为外消旋雌马酚和大豆苷元的混合标准品手性柱HPLC图谱，图7为培养萃取液的HPLC图谱，S-雌马酚的保留时间为18. 657分钟，对应的R-雌马酚保留时间为23. 397分钟，大豆苷元的保留时间为14. 973分钟，培养萃取液在14. 562分钟和18. 531分钟处出现2个峰，根据峰面积计算得到产物雌马酚的对映体过量值(％e. e.)为100%。本实施例解决了现有技术中存在的转化制备S-雌马酚难以实现的问题，提供一种能将潜手性化合物大豆苷元直接转化为手性化合物S-雌马酚的功能微生物菌株及其制备方法。相对于以往报道的严格厌氧雌马酚转化菌株以及混合菌转化，本发明得到的奇异变形杆菌Proteus mirabilis LH-52菌株为兼性厌氧菌,更适合于工业生产。表I
权利要求
1.一种奇异变形杆菌菌株，其特征在于该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2011390，保藏日期为2011年11月13日。
2.一种如权利要求I所述的奇异变形杆菌菌株转化大豆苷元生产S-雌马酚的方法，其特征在于包括以下步骤 1)奇异变形杆菌菌株的培养将奇异变形杆菌菌株，37°C厌氧活化培养12 18小时后，接种于已灭菌的液体培养基。
2)底物的加入采用大豆苷元(daidzein)作为底物；按照I: 100的接种量将步骤I)中菌液接种于含100微摩尔/升底物大豆苷元的灭菌液体培养基，继续厌氧37°C培养4天，即可转化底物为S-雌马酚。
3)代谢产物的分离纯化将步骤2)中得到的培养物浓缩后用3倍体积的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液并用旋转蒸发仪蒸干。加入100%纯甲醇溶解，在半制备型高效液相色谱仪上可分离制备得到S-雌马酚。
3.如权利要求2所述的一种奇异变形杆菌菌株转化大豆苷元生产S-雌马酚的方法，其特征在于所述步骤I)和步骤2)中的液体培养基配方为蛋白胨27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化钠5. O克/升，磷酸氢二钠2. 5克/升。
全文摘要
本发明公开了一种奇异变形杆菌菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2011390，保藏日期为2011年11月13日；以及利用奇异变形杆菌菌株转化大豆苷元生产S-雌马酚的方法。本发明解决了现有技术中存在的转化制备S-雌马酚难以实现的问题，提供一种能将潜手性化合物大豆苷元直接转化为手性化合物S-雌马酚的单一功能微生物菌株及其制备方法。相对于以往报道的严格厌氧雌马酚转化菌株以及混合菌转化，本发明得到的奇异变形杆菌Proteus mirabilis LH-52菌株为兼性厌氧菌，更适合于工业生产。
文档编号C12N1/20GK102925378SQ20121014674
公开日2013年2月13日 申请日期2012年5月11日 优先权日2012年5月11日
发明者肖美添 申请人:华侨大学