专利名称：一个鉴别海带雌配子体的特异性issr-scar标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说，是ー个鉴别海带雌配子体的特异性ISSR-SCAR标记，该标记可特异性地鉴定出海带雌配子体，理论上可用于単性生殖海带孢子体亲本来源及其后代的性别鉴定。
背景技术：
对于大多数植物来说，性别的鉴定主要是通过植物的外部形态、生理生化差异、同エ酶图谱、特异蛋白、染色体组型等方面来进行。伴随分子生物技术的发展，特别是分子标记技术的日趋成熟，使得分子标记在植物性别鉴定中的作用显得越来越重要。这主要是由于分子标记能够直接从DNA水平上来反映植物的差异，其测定过程不受植物发育阶段的影响。
自1974年Grozdicker等人首创第一代DNA分子标记-限制性片断长度多
态性标记(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)以来，各种分子标记如雨后春笋般地发展起来，现已发展到近几十种。如随机扩增产物多态性DNA (RandomlyAmplified Polymorphic DNA, RAPD)、简单重复序列[(Simple Sequence Repeat, SSR,又称微卫星(Microsatellite)序列)]、表达序列标签(Expressed Sequence Tag, EST)、扩增的限制性片断长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)、简单序列重复区间(Inter-simple Sequence Repeat, ISSR)、单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism, SNP)、单链构象多态性(Single-stranded Conformation Polymorphism,SSCP)等。这些标记技术在植物分子遗传图谱构建、遗传多祥性分析与种质鉴定、重要农艺性状基因定位与图位克隆、转基因植物鉴定和分子标记辅助选择育种等方面发挥重要作用。目前，用于鉴定植物性别的分子标记主要有狀 0、30ム1 、4 1^、331 及1551 。相对于陆生植物来说，由于藻类细胞的特殊性，在藻类上利用分子标记鉴定其性别的报道相对较少。Haring et al. (1996)利用衣藻(fiWa焊性别相关的ー些性状，构建了部分连锁图谱，为运用遗传图谱研究与性别相关的工作奠定了基石出。Sim et al. (2007)认为随机扩增多态性 DNA (random amplified polymorphic DNA,RAPD)技术可用于张氏江蓠cAaflgii)雌、雄株及孢子体的鉴定。Martinez etal. (1999)利用RAPD技术从细江蓠(Cracihria中分别获得I个雌性相关PCR标记和2个雄性相关分子标记。最近,根据地钱polymorpha L. ) Y染色体特异序列(GenBank登录号AB069714)设计引物，Liu et al. (2009)从海带雌配子体中扩增出一条差异片段，并在国际上率先将该片段成功转化为ー个命名为FRML-494的SCAR标记；通过微卫星引物筛选，Shan & Pang (2010)从裙带菜(fet/aria pj'nnat/f/ds)中也获得一个与雌配子体相关的分子标记。ISSR标记是1994年由Zietkiewicz建立起来的分子生物学技术,是ー种新型的分子标记，它是在PCR技术的基础上发展起来的一种检测技术，具有PCR技术的高效率、DNA用量少、特异性强、检测方便等优点。用于ISSR-PCR的引物通常是16 23个碱基序列，由f 4个碱基组成的串联重复或几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与SSR的5’-和3’ -末端结合，通过PCR扩增SSR之间的DNA片段。与SSR-PCR相比，用于ISSR-PCR可能在某些特定基因组DNA上无配对区域而无扩增产物。ISSR通常为显性标记，呈Mendel式遗传，具有良好的稳定性和多态性，因而是ー种理想的分子标记技木。可用于构建PCR为基础的分子图谱。ISSR已经被广泛用于遗传多祥性分析、绘制DNA指纹图谱、品种的鉴定。中国专利文献CN101280339B公开了ー个能辨别海带雌配子体的SCAR分子标记，可以对海带配子体性别进行快速有效的鉴定，也可对单性海带孢子体亲本来源及其后代的性别进行鉴定。中国专利文献CN101280340B公开了能辨别海带雌、雄配子体的特异分子标记，可以对 海带配子体性別、単性生殖海带孢子体亲本来源及其后代性别进行鉴定，也可以在细胞核分子水平上对海带性别分化进行研究。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一个鉴别海带雌配子体的特异性ISSR-SCAR 标记。本发明的第二个目的是，提供一种用于扩增海带雌配子体基因组DNA的引物对。本发明的第三个目的是，提供一种鉴别海带雌配子体的特异性ISSR-SCAR标记的提取方法。本发明的第四个目的是，提供一种鉴别海带雌配子体的特异性ISSR-SCAR标记的用途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一个鉴别海带雌配子体的特异性ISSR-SCAR标记，所述的特异性ISSR-SCAR标记具有SEQ ID NO. 5所述的核苷酸序列。所述的特异性ISSR-SCAR标记的提取方法包括以下步骤
(1)在17±l°C、30-40μ mo I m_2 s—1光照条件下培养海带雌、雄性配子体的无性繁殖系，收集材料并提取配子体基因组DNA ；
(2)利用引物SEQID NO. I分别对海带雌、雄配子体基因组进行PCR扩增，PCR产物用2. 0%的琼脂糖凝胶电泳，溴化こ锭染色，凝胶成像系统进行观察和拍照；
(3)參照回收引物SEQID NO. I在雌配子体扩增的差异片段DNA，利用pMD19_T载体、大肠杆菌感受态菌株JM109，先后进行连接和转化，挑选白色菌落，使用菌落PCR确认载体中是否插入目的片段，将含有目的片段的菌液进行测序，得测序结果SEQ ID NO. 2；
(4)根据测序结果，将引物SEQID NO. I向3’-端正向延长至32个碱基及反向引物向5，-端分别延长至29个碱基，得到I对ISSR-SCAR引物正向引物SEQ ID NO. 3和反向引物SEQ ID NO. 4，对海带雌、雄配子体基因组DNA进行PCR扩增，扩增结果在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统进行观察与拍照；
(5)按照步骤(3)进行DNA胶回收、连接、转化、蓝白斑筛选、插入片段确认等，最后将含有目的片段的菌液进行测序，获得ー个能鉴别海带雌配子体的ISSR-SCAR分子标记，它的DNA 序列为 SEQ ID NO. 5。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种用于扩增海带雌配子体基因组DNA的引物对，所述的引物对的序列正向引物SEQ ID N0.3和反向引物SEQ IDNO. 4。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是一种鉴别海带雌配子体的特异性ISSR-SCAR标记的提取方法，所述的提取方法包括以下步骤
(1)在17±l°C、30-40μ mo I m_2 s—1光照条件下培养海带雌、雄性配子体的无性繁殖系，收集材料并提取配子体基因组DNA ；
(2)利用引物SEQID NO. I分别对海带雌、雄配子体基因组进行PCR扩增，PCR产物用2. 0%的琼脂糖凝胶电泳，溴化こ锭染色，凝胶成像系统进行观察和拍照；
(3)參照回收引物SEQID NO. I在雌配子体扩增的差异片段DNA，利用pMD19_T载体、大肠杆菌感受态菌株JM109，先后进行连接和转化，挑选白色菌落，使用菌落PCR确认载体中是否插入目的片段，将含有目的片段的菌液进行测序，得测序结果SEQ ID NO. 2；
(4)根据测序结果，将引物SEQID NO. I向3’-端正向延长至32个碱基及反向引物向5，-端分别延长至29个碱基，得到I对ISSR-SCAR引物:正向引物SEQ ID NO. 3和反向引物SEQ ID NO. 4，对海带雌、雄配子体基因组DNA进行PCR扩增，扩增结果在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统进行观察与拍照；
(5)按照步骤(3)进行DNA胶回收、连接、转化、蓝白斑筛选、插入片段确认等，最后将含有目的片段的菌液进行测序，获得ー个能鉴别海带雌配子体的ISSR-SCAR分子标记，它的DNA 序列为 SEQ ID NO. 5。为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是所述的特异性ISSR-SCAR标记在鉴别海带雌配子体和単性生殖海带孢子体亲本来源及其后代的性别鉴定中的应用。本发明优点在干
本发明根据筛选的ISSR引物，对海带雌、雄配子体基因组DNA进行PCR扩增，获得了一个与海带雌配子体性别相关的差异分子标记，通过胶回收、克隆、测序、引物设计及PCR等过程，进ー步转化为ISSR衍生的稳定SCAR标记。为海带配子体性别的快速有效鉴定、単性生殖海带孢子体亲本来源及其后代的性别鉴定提供了ー种快速可行的方法。
图I.海带雌配子体ISSR差异分子标记的电泳图谱。1-5泳道不同个体的雄配子体；6-10泳道不同个体的雌配子体；11泳道空白对照；12泳道GeneRuler 100 bpDNA Marker Plus。图2.海带雌配子体ISSR-SCAR分子标记的电泳图谱。1-10泳道不同个体的雄配子体；12-21泳道不同个体的雌配子体；22泳道空白对照；11和23泳道D2000的DNA标准。图3.海带配子体DNA酶切电泳图谱(左)及Southern杂交图谱(右)。Ml D2000的DNA标准；M2 :1 kb的DNA标准；I 和I早是使用Pstl酶切的基因组DNA ；2 和2早是使用沿ο I和Afoi I双酶切的基因组DNA。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。
实施例I鉴别海带雌配子体的特异性ISSR-SCAR标记的提取方法 1)在17±1で、30 40 μ mo I m_2 s—1光照条件下培养海带雌、雄性配子体的无性繁殖系，收集材料并利用CTAB法提取配子体基因组DNA。2)从加拿大British Columbia大学购置的ISSR随机引物中选出10对引物。通过PCR反应条件优化，确定反应程序为先进行94°C变性3 min ;接着45个循环包括94°C变性45 s、50 54°C退火I. 5 min、72°C延伸I min ;最后在72°C下延伸10 min。25 yL的PCR 反应体系2. 5 μ L 10XPCR 缓冲液[50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8. 3)，I. 5 2. 5mM Mg2+，100 μ M dNTP], O. 2 μ M ISSR 引物，I. I 单位 Taq DNA 聚合酶，30 ng DNA 模板。PCR产物用2. 0%的琼脂糖凝胶电泳，溴化こ锭染色，凝胶成像系统进行观察和拍照。在10对引物中，发现引物UBC809 (SEQ ID NO. I)可以自雌配子体中扩增出一条大小在1500 bp左右的差异条带(图I)。3)參照北京艾德莱生物公司的DNA胶回收试剂盒操作说明，回收引物UBC809(SEQID NO. I)在雌配子体扩增的差异片段DNA。利用购于TaKaRa公司的pMD19-T载体、北京天根公司的大肠杆菌{Escherichia coli )感受态菌株JM109,先后进行连接和转化。挑选白色菌落，使用菌落PCR确认载体中是否插入目的片段，将含有目的片段的菌液送至上海生物工程公司进行测序。4)根据测序结果(SEQ ID NO. 2)，将引物UBC809引物(SEQ ID NO. I)向3，-端正向延长至32个碱基及反向引物向5’ -端分别延长至29个碱基，得到I对ISSR-SCAR引物(正向引物SEQ ID NO. 3和反向引物SEQ ID NO. 4)，对海带雌、雄配子体基因组DNA进行PCR扩增。25 μ L 反应体系含12. 5 μ L 2 X Taq PCR MasterMix [O. I 单位 Taq Polymerase/μ L,500 μ M dNTP, 20 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM KC1，3 mM MgCl2](天根公司)，10μ M的上下游引物各5 μ L,模板DNA约30 ng。扩增反应程序包括94°C预变性3 min ;然后30个循环包括94°C变性30 s、64°C退火45 s、72°C延伸I min ;最后72°C延伸10 min。扩增结果在I. 0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统进行观察与拍照。5)按照3)进行DNA胶回收、连接、转化、蓝白斑筛选、插入片段确认等，最后将含有目的片段的菌液送至上海生物工程公司进行测序。从而获得一个能鉴别海带雌配子体的ISSR-SCAR分子标记，它的DNA序列见SEQ ID NO. 5。6) Southern杂交证实该SCAR分子标记的特异性。基于DNA-DNA的Southern杂交原理，利用North2South杂交试剂盒(Thermo Scientific, USA),采用生物素标记ISSR-SCAR分子标记，对限制性内切酶处理后的海带配子体基因组DNA进行Southern杂交，证实该标记为海带雌配子体特异序列。实施例2具体操作步骤
I)取鲜重为0.1 g的海带配子体无性繁殖系。2)在液氮中轻轻地将配子体无性繁殖系研磨成粉末后，立即转移入预热的0. 6 mLCTAB提取缓冲液中，该缓冲液含有重量体积比为3%的CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)、I. 4M NaCl,20 mM EDTAUO mM pH为7. 8的Tris-HCl和重量体积比为2%的巯基こ醇，于涡旋混勻仪上混勻I min。3) 65°C温浴30 60 min,姆10 min颠倒摇动I次。4)加入等体积的体积比为24:1的氯仿异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀3-5 min,至出现乳化层为止。5)室温下12 000 rpm (转/分钟)离心10 min,上清液转移到另ー灭菌的离心管中。6)向离心管中加入2/3体积_20°C预冷的异丙醇，颠倒混匀，至出现沉淀为止。7)-20°C下放置15 min左右后,8 000 rpm离心10 min。沉淀于70%こ醇洗漆并在无菌操作台中通风干燥后，溶解于200 μ L灭菌的CldH2O中。8)待完全溶解后加入1/3体积的7. 5 M的醋酸铵和2倍体积_20°C预冷的无水こ醇。颠倒混匀，至出现沉淀为止。9)-20°C下放置15 min以上，12 000 rpm离心10 min后，再用70%的こ醇洗涤沉淀。最后将沉淀溶解于4(Γ100 μ L左右的灭菌ddH20，-20°c保存备用。10)自加拿大British Columbia大学购置的引物中，选择10条引物，通过优化PCR反应条件，最后确定反应程序为先进行ー轮94°C变性3 min ;接着45个循环包括94°C变性 45s、50 54°C退火 I. 5 min，72°C延伸 Imin ;最后在 72°C下延伸 10 min。25 μ L 的 PCR 反 应体系2· 5 μ L 10XPCR缓冲液[50 mM KCl，10 mM Tris-Cl (pH 8. 3)，I. 5 2. 5 mM Mg2+，100 μ M dNTP], O. 2 μ M ISSR 引物，L I 单位 Taq DNA 聚合酶，30 ngDNA 模板。PCR 产物用2. 0%的琼脂糖凝胶电泳，溴化こ锭染色，凝胶成像系统进行观察和拍照。在10对引物中，发现引物UBC809 (SEQ ID NO. I)可以自雌配子体中扩增出一条大小在1500 bp左右的差异条带(图I)。11)使用北京艾德莱公司的DNA胶回收试剂盒，參照商家实验步骤说明操作。将海带雌、雄配子体基因组DNA扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，使雌、雄差异片段与其他扩增条带尽可能分开，然后用干净的刀片割下差异条带，放入2.0 mL离心管中。12)每100 mg凝胶加入500 μ L溶胶缓冲液，55°C温浴10 min,使凝胶彻底融化。13)将融化的液体倒入吸附柱中，静置I min，12000 rpm离心30 S，弃收集管中液体。14)加入700 μ L漂洗液，12000 rpm室温离心30 S。弃收集管液体。重复此步一次。15)倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一个收集管中，12 000 rpm室温离心2min。16)将吸附柱柱放入一个新的I. 5 mL的离心管中，超净工作台风干吸附柱EC。17)向吸附柱膜中央加40 μ L洗脱液，室温放置2 min，12 000 rpm室温离心2min，离心管中的液体即为回收的DNA片断，保存于-20°C备用。18)在微量离心管中加入I μ L pMD19_T质粒载体，O. Γθ. 3 pmol待插入DNA片段，再加ddH20至5 μし19)加入5 μ L的连接混合液，16°C反应过夜。20)将上述10 μ L反应液加入至100 μ L的大肠杆菌JM109感受态细胞中，轻轻摇动离心管2 3次，充分混匀。冰中放置30 min。21)冰浴后将离心管转入42°C水浴90 S，立即冰浴Γ5 min。22)加入890 μ L的LB液体培养基，37°C下150 rpm的速度振荡培养60 min。(每升LB液体培养基含10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，最后用5 M的NaOH调节PH到7. O后，用蒸馏水定容至一升，灭菌即可)。23)取O. I mL含有连接产物的菌液涂布于LB琼脂平板培养基上培养，37°C培养过夜，形成单菌落。LB琼脂平板制备在每100 mL LB液体培养基中加4 g琼脂粉，待灭菌的琼脂培养基冷却到50°C左右时加入4 mg的5-溴-4-氯-3-卩引哚-β -半乳糖苷(Χ-Gal)、2. 4 mg的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和10 mg的氨节青霉素(Amp+),制作成X_Gal、IPTG、Amp+平板培养基，摇匀后倒平板。24)挑选LB固体培养基上白色菌落，接种到2 mL的含氨苄青霉素的LB液体培养基中。25) 37 °C下200 rpm的速度震荡培养过夜。26)取I μ L菌液作为模板DNA，进行PCR反应。25 μ L反应体系含12. 5 μ L天根2XTaq PCR MasterMix [O. I 单位Taq Polymerase/μ L, 500 μ M dNTP, 20 mM Tris-HCl(pH 8.3),100 mM KC1,3 mM MgCl2], 10 μΜ 的上下游引物各 0.5 μ L, I μ L 菌液模板 DNA。扩增程序包括94°C预变性3 min，紧接着按照94°C变性45 s、52°C退火45 s、72°C延伸I. 5min的程序进行30个循环，最后72°C延伸10 min。PCR反应结束后，取产物6 μ L在I. 0%的琼脂糖凝胶电泳。27)将含有目的片段的菌液送至上海生物工程公司进行测序。28)根据测序结果SEQ ID NO. 2，将正向引物向3’ -端及反向引物向5’ -端分别延长至32和29个碱基，获得ISSR-SCAR特异引物的序列正向引物SEQ ID Ν0.3和反向引物 SEQ ID NO. 4。29)对海带雌、雄配子体基因组DNA进行PCR扩增。25 μ L反应体系含12. 5 μ L天根 2 X Taq PCR MasterMix [O. I 单位 Taq Polymerase/μ L, 500 μ M dNTP, 20 mM Tris-HCl(pH 8.3),100 mM KC1,3 mM MgCl2], 10 μ M的上、下游引物各(λ 5 μ L, I μ L菌液模板DNA。扩增程序包括94°C预变性3 min，紧接着按照94°C变性45 s、65°C退火45 s、72°C延伸I. 5min的程序进行30个循环，最后72°C延伸10 min。扩增结果在I. 0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统进行观察与拍照。30)按照11)-27)步骤进行DNA胶回收、连接转化、白色菌落筛选、插入片段的确认等，最后将含有目的片段的菌液送至上海生物工程公司进行测序，获得能鉴定海带雌配子体的ー个ISSR-SCAR分子标记，序列參见SEQ ID NO. 5。31)Southern杂交证实SCAR分子标记的特异性结果如图3所示。具体Southern杂交步骤如下
I)按照Thermo公司的North2South杂交试剂盒操作说明书标记探针将 20 μ L 生物素标记的 N4-dCTP (Biotin-dUTP)与 80 yL 的 5XdNTP mix (I mMdATP, I mM dTTP, I mM dGTP, I mM dCTP)充分混合备用。①将100 ng目的片段的PCR纯化产物于离心管中稀释至24 μ L,作为模板DNA ；
②加10μ L Heptanucleotide mix引物于上述离心管中，煮沸5 min以变性,然后迅速在冰水混合物放置5 min以退火；
③加10 μ L N4-dCTP 与 5 X dNTP mix(l mM dATP, I mM dTTP, I mM dGTP, I mM dCTP)混合物，5 μ L反应缓冲液，I μ L Klenow酶(IOU/ μ L)混合；
④37°C温育 60min ；
⑤加2 μ L 的 EDTA 液(500 nM, pH 8. O)使 Klenow 酶失活。II)基因组DNA酶切、将提取纯化的海带配子体基因组DNA，选择分子标记内没有限制性内切酶位点的内切酶进行酶切。本研究经预实验后确定使用ー组单酶切及一组由办ol和#oil组成的双酶切。III)转膜
①基因组DNA酶切后电泳，观察并照相，记下弥散DNA的区域；
②将凝胶置于O.2 M的HCl中处理10 min ；
③弃去HCl溶液，使用去离子水漂洗2次，随后将凝胶浸泡于20mL体积的变性液(O. 5M NaOH, I. 5 M NaCl)中，30 min后再将凝胶于中和液浸泡30 min ；④取ー瓷盘，加入转移液(20XSSC含175.3 g NaCl、88. 2 g柠檬酸钠、800 mL水、调PH 7、定容至I L)，上置ー块玻璃板作为平台，玻璃板表面铺ー层滤纸，滤纸的两边浸没在转移液中，驱出玻璃板和滤纸间的气泡；
⑤根据胶的大小裁剪大小ー样的滤纸2张先在转移液中浸没5min，然后铺在玻璃板上，将凝胶放到滤纸上，再在凝胶上放置尼龙膜(和胶ー样大小并预先在去离子水中浸没10min，后在转移液中浸没5 min)，尼龙膜上再放入2层滤纸并驱赶气泡；
⑥在滤纸上放置15cm高的吸水纸，使用玻璃板压平，并在玻璃板上放置O. 5 kg的重物。转膜10 h，期间每间隔2 h更换新的吸水纸；
⑦转膜完毕，移去吸水纸，将膜放在6XSSC溶液中浸泡5min，用滤纸吸干液体，放在新的滤纸上，80°C烤膜45 min。IV)杂交
①预杂交将转好的膜置于杂交管中，点样面朝上，加杂交液(至少O.I mL/cm2)并确保膜可被杂交液均勻覆盖，80 rpm室温下预杂交30 min ；
②热变性探针煮沸探针10min使其变性，然后迅速置于冰水混合物中退火10 min；
③杂交在杂交液中加入已经变性的DNA探针，使其浓度达到30ng/mL，充分混匀，80rpm, 55 °C杂交过夜。V)严谨洗膜
①预先将冷藏的N0rth2S0Uth杂交严谨洗膜液缓慢升温至室温，加入等体积的去离子水；
②将膜转移到新的杂交管中使用①步骤的严谨洗膜液洗膜3次，毎次用20mL洗膜液洗膜15 min。VI)化学发光法检测杂交信号
预先将冷藏的封闭液、4X漂洗缓冲液及底物平衡液缓慢升温至室温，并配置IX漂洗缓冲液。①封闭弃严谨洗膜液，加入15 mL封闭液，42°C振荡洗膜封闭15 min ；
②配置1:300(66. 7 μ L稳定的亲和素标记的HRP加入到20 mL的封闭液中)的抗体稀释液；
③抗体孵育弃封闭液，加入抗体稀释液。室温轻轻振荡15min ；
④洗膜用20mL的IX漂洗缓冲液淋洗膜，再用20 mL的IX漂洗缓冲液室温振荡轻柔漂洗膜4次，毎次5 min；
⑤平衡将杂交膜移入新的培养皿中，使用30mL的底物平衡液轻轻振荡5 min ；⑥底物工作液的配置(暗室里面操作)I:I等体积混合North2South Luminol/Enhanser溶液和N0rth2S0uth 过氧化物酶稳定溶液作为底物发光工作液；
⑦将湿润的膜放入新的培养皿中，加入⑥步骤的底物工作液(暗室中操作)5min，确保工作液淹没杂交膜；
⑧将膜从培养皿中取出，滤纸吸干膜表面液体。用保鲜膜包好杂交膜；
⑨把包好的杂交膜放在暗盒里，放入柯达X光胶片，曝光2min，(暗室操作)；
⑩从暗盒取出柯达X光片，进行显影和定影。X光片的条带结果如图3所示。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一个鉴别海带雌配子体的特异性ISSR-SCAR标记，其特征在于，所述的特异性ISSR-SCAR标记具有SEQ ID NO. 5所述的核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的鉴别海带雌配子体的特异性ISSR-SCAR标记，其特征在于，所述的特异性ISSR-SCAR标记的提取方法包括以下步骤 (1)在17±l°C、30-40u mo I m_2 s—1光照条件下培养海带雌、雄性配子体的无性繁殖系，收集材料并提取配子体基因组DNA ； (2)利用引物SEQID NO. I分别对海带雌、雄配子体基因组进行PCR扩增，PCR产物用 2.0%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统进行观察和拍照； (3)参照回收引物SEQID NO. I在雌配子体扩增的差异片段DNA，利用pMD19_T载体、大肠杆菌感受态菌株JM109，先后进行连接和转化，挑选白色菌落，使用菌落PCR确认载体中是否插入目的片段，将含有目的片段的菌液进行测序，得测序结果SEQ ID NO. 2； (4)根据测序结果，将引物SEQID NO. I向3’-端正向延长至32个碱基及反向引物向5，-端分别延长至29个碱基，得到I对ISSR-SCAR引物:正向引物SEQ ID NO. 3和反向引物SEQ ID NO. 4，对海带雌、雄配子体基因组DNA进行PCR扩增，扩增结果在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统进行观察与拍照； (5)按照步骤(3)进行DNA胶回收、连接、转化、蓝白斑筛选、插入片段确认等，最后将含有目的片段的菌液进行测序，获得一个能鉴别海带雌配子体的ISSR-SCAR分子标记，它的DNA 序列为 SEQ ID NO. 5。
3.一种用于扩增海带雌配子体基因组DNA的引物对，其特征在于，所述的引物对的序列:正向引物SEQ ID NO. 3和反向引物SEQ ID NO. 4。
4.一种鉴别海带雌配子体的特异性ISSR-SCAR标记的提取方法，其特征在于，所述的提取方法包括以下步骤 (1)在17±l°C、30-40u mo I m_2 s—1光照条件下培养海带雌、雄性配子体的无性繁殖系，收集材料并提取配子体基因组DNA ； (2)利用引物SEQID NO. I分别对海带雌、雄配子体基因组进行PCR扩增，PCR产物用2.0%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统进行观察和拍照； (3)参照回收引物SEQID NO. I在雌配子体扩增的差异片段DNA，利用pMD19_T载体、大肠杆菌感受态菌株JM109，先后进行连接和转化，挑选白色菌落，使用菌落PCR确认载体中是否插入目的片段，将含有目的片段的菌液进行测序，得测序结果SEQ ID NO. 2； (4)根据测序结果，将引物SEQID NO. I向3’-端正向延长至32个碱基及反向引物向5，-端分别延长至29个碱基，得到I对ISSR-SCAR引物正向引物SEQ ID NO. 3和反向引物SEQ ID NO. 4，对海带雌、雄配子体基因组DNA进行PCR扩增，扩增结果在I. 0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统进行观察与拍照； (5)按照步骤(3)进行DNA胶回收、连接、转化、蓝白斑筛选、插入片段确认等，最后将含有目的片段的菌液进行测序，获得一个能鉴别海带雌配子体的ISSR-SCAR分子标记，它的DNA 序列为 SEQ ID NO. 5。
5.根据权利要求I或2任一所述的特异性ISSR-SCAR标记在鉴别海带雌配子体和单性生殖海带孢子体亲本来源及其后代的性别鉴定中的应用。
全文摘要
本发明涉及一个鉴别海带雌配子体的特异性ISSR-SCAR标记，所述的特异性ISSR-SCAR标记具有SEQIDNO.5所述的核苷酸序列。还提供这一特异性ISSR-SCAR标记的提取方法和用途以及一种用于扩增海带雌配子体基因组DNA的引物对。本发明优点在于本发明根据筛选的ISSR引物，对海带雌、雄配子体基因组DNA进行PCR扩增，获得了一个与海带雌配子体性别相关的差异分子标记，通过胶回收、克隆、测序、引物设计及PCR等过程，进一步转化为ISSR衍生的稳定SCAR标记。为海带配子体性别的快速有效鉴定、单性生殖海带孢子体亲本来源及其后代的性别鉴定提供了一种快速可行的方法。
文档编号C12N15/11GK102660647SQ201210146698
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者周志刚, 孙育平, 毕燕会, 谷俊刚 申请人:上海海洋大学