专利名称：一个能辨别海带雌配子体的scar分子标记的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种植物性别鉴定的特异性分子标记，尤其 涉及一种辨别海带雌配子体的SCAR分子标记。
技术背景对于大多数植物来说，性别的鉴定主要是通过植物的外部形态、生理生化差异、同工 酶图谱、特异蛋白、染色体组型、核酸等方面来进行的。随着分子生物技术的发展，特别 是分子标记技术的日趋成熟，使得分子标记在植物性别鉴定中的作用显得越来越重要。因 为分子标记能够直接从基因组DNA水平上来反映植物的差异，其测定过程不受植物发育 阶段的影响，极大地提高经济效益。自1974年Grozdicker等人首创第一代DNA分子标记——限制性片断长度多态性标记 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)以来，各种分子标记如雨后春等般地 发展起来，到目前为止，已经发展到近几十种。如随机扩增产物多态性DNA (Randomly Amplified Polymorphic DNA， RAPD)、简单重复序列[(Simple Sequence Repeat, SSR，又 称微卫星(Microsatellite)序列)]、表达序列标签(Expressed Sequence Tag, EST)、扩增 的限制性片断长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)、锚定简单序 列重复(Inter-simple Sequence Repeat, ISSR)、单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)、单链构想多态性(Single-stranded Conformation Polymorphism, SSCP) 等。这些标记技术在植物分子遗传图谱构建、遗传多样性分析与种质鉴定、重要农艺性状 基因定位与图位克隆、转基因植物鉴定和分子标记辅助选择育种等方面发挥重要作用。目 前，用于鉴定植物性别的分子标记主要有RAPD、 SCAR、 AFLP、 SSR。但是在藻类上利用分子标记鉴定其性别的报道非常少。Haring等利用衣藻 (C/j/am>^omowas ewgametoy)性别相关的一些性状，构建了具有15个RAPD标记、3个 形态学标记和1个RFLP标记的部分连锁图谱，为运用遗传图谱研究与性别相关的工作打 下了基础。Martinez等利用RAPD来鉴定红藻门江蓠(Gra"7an'" gradfc)的性别，其中 OPD13 (5'-TCGTCACCCC-3') —条引物就同时在江蓠雌、雄个体中扩增出两个差异片断， 可应用于早期性别鉴定。Paran首次提出序列特异性扩增区(Sequence characterized ampl迅ed region, SCAR)， 通过对多态性RAPD产物进行克隆和测序，设计更长的引物将RAPD-PCR转变成经典的 PCR可以提高稳定性、重复性和特异性。目前，国内外未见关于辨别海带雌配子体的SCAR分子标记的报导。 发明内容本发明的目的在于提供一种能海带雌酏子体的SCAR分子标记。本发明根据地钱Y染色体保守区域设计引物(SEQ.ID.NOl)，对海带雌、雄配子体基因 组DNA进行PCR扩增，获得了一个与海带雌配子体性别相关的差异分子标记，通过胶回收、 克隆、测序、引物设计及PCR等过程，进一步转化为SCAR分子标记(SEQ.ID.N04)。该分 子标记可用于海带配子体性别的快速有效鉴定、单性生殖海带孢子体亲本来源及其后代的 性别鉴定。本发明利用特别设计的引物(SEQ.ID.NOl)分别对海带雌、雄配子体中提取的基因组 DNA进行PCR扩增。根据扩增产物的测序结果，将原引物SEQ.ID.N01延伸为新的引物 (SEQ.ID.N03)。利用新的引物，再对海带雌、雄配子体基因组DNA进行PCR扩增，扩增 产物中得到一条大约为500bp的特异条带(见图2所示)，此谱带仅在海带雌配子体基因组 扩增中出现，而在海带雄配子体基因组扩增中没有此条带出现。经测序，该海带雌配子体 特异条带的大小为494bp，记为F-494，作为海带雌配子体特异性分子标记，序列为 SEQ.ID.N04。本发明提出的辨别雌配子体的SCAR分子标记的获取方法如下(1) 在17il。C、 30-40|amolm—2s—i光照条件下培养海带雌、雄性配子体无性繁殖系，收 集材料并提取配子体基因组DNA。(2) 根据地钱(M^r/7a油'a /7ofymwp/^) Y染色体保守区域碱基序列(GenBank登录 号AB069714)设计引物SEQIDNO.l，利用此引物分别对海带雌、雄配子体基因组DNA 进行PCR扩增，PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统进行 观察和拍照。(3) 回收特异扩增片段的DNA。利用购于Takara公司的pMD19-T载体、大肠杆菌 (五wte 7'cWfl co/z')感受态菌株JM109，进行克隆(根据Takara公司连接转化试剂盒说明书)。挑选白色菌落，使用PCR确认载体中插入片段的长度大小，将含有目的片段的菌液进行测 序，得SEQIDN0.2;(4) 根据测序结果，将原正向引物向3'端及反向引物向5'端延长至29个碱基，获得 SCAR特异引物的序列SEQIDN0.3，对海带雌、雄配子体基因组DNA进行PCR扩增。 扩增结果在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统进行观察与拍照。(5) 按照步骤(3)进行DNA胶回收、连接转化、白色菌落筛选、插入片段的长度 大小确认等，最后对含有目的片段的菌液进行测序，获得一个能鉴别海带雌配子体的SCAR 分子标记，它的DNA序列见SEQ ID N0.4。本发明提出的SCAR分子标记利用该标记可以快速有效的鉴定海带雌配子体，并可用 于单性生殖海带孢子体亲本来源及其后代的性别鉴定。
图l 海带雌配子体差异分子标记的电泳图谱。M: GeneRulerTM100bp DNA Marker Plus; l-2泳道雄配子体；3-4泳道雌配子体。图2海带雌配子体SCAR分子标记的电泳图谱。M: DL250; 0泳道空白对照，1-10 泳道雌配子体；11-20泳道雄配子体。
具体实施方式
1) 取鲜重为0.1g的海带配子体无性繁殖系。2) 在液氮中轻柔地将配子体无性繁殖系研磨成粉末后，立即转移入预热的0.6 ml CTAB提取缓冲液中，该缓冲液含有重量体积比为3%的CTAB、 1.4 M NaCl、20 mM EDTA、 10 mM pH为7.8的Tris-HCl和重量体积比为2%的巯基乙醇，于涡旋混匀仪上混匀1 min。3) 65 。C温浴30-60 min，每5 min颠倒摇动1次。4) 加入等体积的体积比为24:1的氯仿:异物醇混合液，轻轻颠倒混匀3-5 min，至出 现乳化层为止。5) 室温下12 000rpm (转/分钟)离心10min，上清液转移到另一灭菌的离心管中。6) 向离心管中加入2/3体积-20。C预冷的异丙醇，颠倒混匀，至出现沉淀为止。7) -20 。C下放置15 min左右后，0-4 。C下8 000 rpm离心10 min。沉淀于70%乙醇 洗涤并在无菌操作台中通风干燥后，溶解于200 pl灭菌的TE缓冲液中，该缓冲液内含有 1 mM EDTA和10 mM pH为8.0的Tris-HCl。8) 待完全溶解后加入1/3体积的7.5 M的醋酸铵和2倍体积-20 。C预冷的无水乙醇。 颠倒混匀，至出现沉淀为止。9) -20 。C下放置30 min以上，0-4 。C下12 000 rpm离心10 min后，再用70%的乙醇 洗涤沉淀。最后将沉淀溶解于40-100 ^左右的TE缓冲液中，该缓冲液含有1 mM EDTA 和10 mM pH为8.0的Tris-HCl， -20 。C保存备用。10) 根据地钱(Man^awto/7o/ymo^p/wr) Y染色体保守区域碱基序列(GenBank登录号AB069714)设计引物SEQIDNO.l，通过优化PCR反应条件，最后确定反应程序为先进行一轮94 。C变性1 min、 53 。C退火1 min、 72 。C延伸2 min的PCR反应，接着进行30个包括94 。C变性30s、 53。C退火2min、 72 。C延伸2 min的反应循环，最后在72 。C下延伸7 min。 25 pl的PCR反应体系含2.5 mM Mg2+、 0.4 SEQ ID NO.l引物、0.2 mMdNTPs、 2U r叫酶及30 ng模板DNA。 PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统进行观察和拍照。11) 使用上海生物工程有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，参照商家实验步 骤说明操作。将海带雌、雄配子体基因组DNA扩增产物在1.5X的琼脂糖凝胶上进行电泳， 使雌、雄差异片段与其他扩增条带尽可能分开，然后用干净的刀片割下差异条带，放入2.0 ml离心管中。12) 每100mg凝胶加入700(il吸附缓冲液，50-60 。C温浴15min，使凝胶彻底融化，每 2min颠倒混匀一次。。13) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加 入500 jLil漂洗液，8 000 rpm室温离心l min。14) 重复步骤13) —次。15) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12 000 rpm室温离心15 s。16) 将UNIQ-10柱放入一个新的1.5 m啲离心管中，在柱子膜中央加40 pl溶解液，室 温放置2 min。17) 12 000rpm室温离心l min，离心管中的液体即为回收的DNA片断，保存于-20 。C备用o18) 在微量离心管中加入l plpMD19-T质粒载体，0.1-0.3 pmol待插入DNA片段，再加 犯20至5 pl。19) 加入5 nl的连接混合液，16 。C反应30 min。20) 将上述10 pl反应液加入至lOO nl的大肠杆菌JM109感受态细胞中，冰中放置30 min。 轻轻摇动离心管2-3次，以充分混匀。21) 冰浴后将离心管转入42 。C水浴中热激90 s,然后立即冰浴3-5 min。22) 加入890 pl的LB液体培养基，37。C下150rpm的速度振荡培养45-60min。每升LB 液体培养基含10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，最后用5M的NaOH调节pH到7.0 后，用单蒸水定容至一升，灭菌即可。23) 取O.l ml含有连接产物的菌液涂布于LB琼脂平板培养基上培养，37 。C培养过夜， 形成单菌落。LB琼脂平板制备在每100mlLB液体培养基中加L5 g琼脂，待灭菌的琼脂 培养基冷却到50 。C左右时加入4 mg的5-溴-4-氯-3-吲哚-P-半乳糖苷(X-Gal)、 2.4mg的异丙 基硫代-卩-D-半乳糖苷(IPTG)和10mg的氨苄青霉素(Amp)，制作成X-Gal、 IPTG、 Amp 平板培养基，摇匀后倒平板。24) 挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。25) 挑取在含氨苄青霉素的LB固体培养基上生长的白色菌落，接种到0.5-l ml的含氨 苄青霉素的LB液体培养基中。26) 37。C下150rpm的速度震荡培养过夜。27) 取100(al菌液于12 000rpm离心2min。28) 弃去上清液，向沉淀中加入40pl5。/。的TritonX-100水溶液。 39)煮沸5min，冰上放置5 min， 12 000 rpm离心5 min。30)取2 pl上清液作为模板DNA，进行PCR反应。25 pl PCR基本反应体系组成包含50 mMKCl， 10mMpH为8,3的Tris-HCl缓冲液、2,0 mM Mg2+、 200pMdNTPs、 M13正向和反 向通用引物各0.2 pM、 1.0 U 7hg DNA聚合酶及30 ng模板DNA。扩增程序包括94 。C预变性 3min，紧接着按照94 。C变性45 s、 57。C退火45 s、 72 。C延伸1.5 min的程序进行30个循环， 最后72 。C延伸10 min。 PCR反应结束后，取产物6 ^1在1.5%的琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲 液为1XTAE，该缓冲液包括40mMTris-HAc和2mMEDTA。电压为5Vcm—、凝胶成像系 统观察并拍照。32) 将含有目的片段的菌液送至上海生物工程公司进行测序。33) 根据测序结果SEQ IDN0.2，将正向引物向3'端及反向引物向5'端延长至29个碱 基，获得SCAR特异引物的序列SEQ ID N0.3。对海带雌、雄配子体基因组DNA进行PCR 扩增。扩增反应体系(20 pl)含50 mM KC1、 10 mM pH为8.3的Tris-HCl缓冲液、2.5 mM Mg2+、 100tiMdNTPs、 SEQIDNO.3引物各0.2 nM、 1.0 U DNA聚合酶及50 ng模板DNA。扩 增程序包括94 。C预变性5 min，然后按照包括94 。C变性30 s、 62。C退火45 s、 72 。C延伸l min 的程序进行30个反应循环，最后72。C延伸10min。扩增结果在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电 泳，凝胶成像系统进行观察与拍照。34) 按照ll) -30)步骤进行DNA胶回收、连接转化、白色菌落筛选、插入片段的长 度大小确认等，最后将含有目的片段的菌液送至上海生物工程公司进行测序，获得海带雌 配子体的一个SCAR分子标记，序列参见SEQ ID N0.4。SEQ ID NO.l:正向引物5 ， AAGAC AAGCGGGTGAACT3 ， 反向引物5' CGATGCGATGTCC AGTGT3 ，SEQ ID N0.2:ACCCACTGATCGACGATGCGATGTCCAGTGTSEQ ID N0.3:正向引物5 ， AAGACAAGCGGGTGAACTCAGCGAGGTCT3 ， 反向引物5，ACACTGGACATCGCATCGTCGATCAGTGT3，SEQ IDN0.4:ACACCCTGATCGACGATGCGATGTCCAGTGT
权利要求
1. 一种能辨别海带雌配子体的SCAR分子标记，其特征在于为F-494，其序列为SEQ IDNO.4。
2、 一种用于海带雌配子体基因组DNA扩增引物对，其特征在于该引物对的序列为SEQ ID N0.3。
3、 一种能辨别海带雌配子体的SCAR分子标记的提取方法，其特征在于具体步骤如下(1) 在17±1 °C、 30-40 pmolm'、"光照条件下培养海带雌、雄性配子体无性繁殖系，收 集材料并提取配子体基因组DNA;(2) 根据地钱Y染色体保守区域碱基序列设计引物SEQIDNO.l，利用此引物分别对 海带雌、雄配子体基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，溴 化乙锭染色，凝胶成像系统进行观察和拍照；(3) 回收特异扩增片段的DNA，利用pMD19-T载体、大肠杆菌感受态菌株JM109, 进行克隆，挑选白色菌落，使用PCR确认载体中插入片段的长度大小，将含有目的片段的 菌液进行测序，得SEQ IDNO. 2;(4) 根据测序结果，将原正向引物向3'端及反向引物向5，端延长至29个碱基，获得 SCAR特异引物的序列SEQ ID N0.3，对海带雌、雄配子体基因组DNA进行PCR扩增， 扩增结果在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统进行观察与拍照；(5)按照步骤(3)进行DNA胶回收、连接转化、白色菌落筛选、插入片段的长度大 小确认等，最后对含有目的片段的菌液进行测序，获得一个能鉴别海带雌配子体的SCAR 分子标记，它的DNA序列为SEQ ID N0.4。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体为一种能辨别海带雌配子体的SCAR分子标记。该分子标记的序列为SEQ ID No.4。它由下述方法提取获得根据地线Y染色体保守区域设计引物，对海带雌、雄配子体基因组进行PCR扩增。根据扩增产物的测序结果，将原引物延伸为新的引物SEQ ID No.3。利用此引物对海带雌、雄配子体基因组进行PCR扩增，得到海带雌配子体的SCAR分子标记F-494，其序列为SEQ ID No.4。利用该SCAR分子标记，可以对海带配体子性别进行快速有效的鉴定，也可对单性生殖海带孢子体亲本来源及其后代的性别进行鉴定。
文档编号C12Q1/68GK101280339SQ200810038220
公开日2008年10月8日 申请日期2008年5月29日 优先权日2008年5月29日
发明者刘艳省, 吴文凯, 周志刚, 李利华 申请人:上海海洋大学