海带配子体低温冷冻保存方法
【专利摘要】本发明公开了一种海带的配子体低温冷冻保存方法，包括以下步骤：（1）将培养保存的配子体克隆系进行超声粉碎后，在温度8-10℃、光强500-800Lux、光时24h条件下预培养10天；（2）取体积分数为10%DMSO溶液1mL加入冻存管中，进行预先冷冻，向预先冷冻的冻存管中再加入0.8mL的10%DMSO溶液，使冻存管中DMSO处于固液混合物状态，加入步骤1处理好的配子体克隆系材料，0-4℃下平衡30min；（3）将平衡后的配子体材料放入-80℃低温冰箱冷冻；（4）将-80℃低温冷冻保存的冻存管快速放入恒温水浴中快速解冻，解冻后将配子体材料经煮沸后冷却的低温海水洗涤去除DMSO，移入培养液中培养。本发明操作极其简便，在有限的空间能进行大量资源的保存，并且不受时间季节限制，可随时进行高效冻存。
【专利说明】海带配子体低温冷冻保存方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及大型经济藻类低温冷冻保存方法，具体涉及一种海带配子体低温冷冻保存方法，属于海洋生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]海带是我国海水养殖的重要经济藻类之一，在海带的生活史中出现孢子体和配子体两种独立生活的藻体，它们在外形和大小上有明显差别，通常我们所见的是孢子体，分为叶片、柄和固着器，而配子体微小，在显微镜下可见，雌、雄配子体是由单个或多个细胞组成的藻体，将单个配子体取出，给予一定的温度光照条件，单个配子体细胞能进行细胞分裂，形成无性繁殖系，即克隆。配子体克隆技术的建立为海带的种质保护奠定了基础。
[0003]海带的种质保存传统方法是在低温弱光条件下进行配子体的液相培养保存，2005年山东东方海洋科技股份有限公司与烟台大学共同开发了海带配子体固相保存技术及超低温(_196°C )液氮冷冻保存技术，使海带的种质保存技术体系得到进一步完善。
[0004]但从操作难易程度、工作量、是否容易导致污染、成本消耗、种质保存的永久性等诸多因素考虑，任何一种保存技术均存在一定的局限性或不足。
[0005] 常规液相保存一般15-30天需更换培养液，长期频繁的继代培养可能引起遗传性状的改变，工作量大，种质污染、混杂机会相应增加，并且所需的培养液需煮沸后冷却的海水进行配制，能源消耗大，成本高；固相培养保存可大大延长培养基的更换周期，在低温弱光条件下I年甚至2-3年不用更换固体培养基，仅在固体培养基表面添加适量培养液即可满足配子体的保存需要，固相培养克服了液相培养频繁更换培养液的不足，但固相培养前期的药敏实验、抑菌浓度梯度实验、大量培养基的制备使接种前期工作量大增；-196 °C液氮冷冻保存可使配子体的代谢完全停止，可实现配子体的永久保存，液氮冷冻保存有程序降温法、逐级冷冻法及包埋脱水法三种方法，其中程序降温法对仪器设备要求高，成本高；逐级冷冻保存法不需昂贵的仪器设备，在液氮面以上2cm处预冻30min再入液氮；包埋脱水法不需使用抗冻保护剂和昂贵的程序降温仪，冻存材料的脱水速率是冻存成功的一个关键，对脱水环境的温度、湿度要求较高，并非脱水率达到要求，就能保证冻存成功；这三种方法最终都是在液氮中进行保存，液氮冻存需定期向液氮罐添加液氮，后续成本增大，若夏季进行海带配子体克隆系的保存，环境气温很高，液氮罐的频繁开启，极易造成液氮的大量挥发，此期液氮消耗更大，一旦液氮得不到及时补充，冻存的材料露出液氮面，将导致冻存失败，采集的种质得不到有效保护，同时一个液氮罐仅有6个提桶，I个提桶内如果已有冻存的材料，则不能被再次使用，所以保存的次数及保存量大受限制。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种海带配子体低温保存方法，该方法操作简便、低成本、省时高效、极易推广。
[0007]本发明解决上述技术问题的技术方案如下:一种海带配子体低温冷冻保存方法，包括以下步骤:
[0008](1)材料处理:将培养保存的配子体克隆系进行超声粉碎后，在温度8-10°C、光强500-800Lux、光时24h条件下预培养10天，得处理好的配子体克隆系材料；
[0009](2)平衡:取体积分数为10%DMS0溶液ImL加入冻存管中，进行预先冷冻，向预先冷冻的冻存管中再加入0.8mL的10%DMS0溶液，使冻存管中DMSO处于固液混合物状态，然后向冻存管中加入步骤I处理好的配子体克隆系材料，0-4°C下平衡30min ；
[0010](3)冷冻保存:将平衡后的配子体材料放入-80°C低温冰箱冷冻；
[0011](4)复苏:将_80°C低温冷冻保存的冻存管快速放入恒温水浴中进行快速解冻，解冻后配子体材料经煮沸后冷却的低温海水洗涤去除DMS0，移入培养液中培养。
[0012]作为本发明的进一步优化，步骤(1)中所述的配子体克隆系为雌雄小団状配子体克隆系来源于国家海藻工程技术研究中心种质资源室；所述的超声粉碎是在超声6s、间隔5s，超声2次，功率200-300w的程序进行超声波处理I次。
[0013]作为本发明的进一步优化，步骤(2)中所述的预先冷冻是指在_20°C冰箱中冷冻。
[0014]作为本发明的进一步优化，步骤(4)中所述的恒温水浴的温度为38_39°C，时间为使冻存管中冰晶完全消失为止。
[0015]本发明与已 有技术相比具有以下显著特点和积极效果:1、省时高效，能有效避免操作过程中DMSO溶液温度的升高而影响平衡效果；2、本发明操作极其简便，省时省力，成本低，在有限的空间能进行大量资源的保存，并且不受时间季节限制，可随时进行高效冻存，是最便捷高效、最适宜推广的一种冷冻保存方法，是种质保存的一种必要补充。3、在_80°C温度条件下，活细胞的生命活动几乎完全停止，避免频繁继代培养可能导致的变异，可进行种质的长期保存。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明的流程示意图。
【具体实施方式】
[0017]以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0018]下面结合实施例及图1对本发明作进一步详细说明。
[0019]实施例一:
[0020]1、材料的处理:将低温弱光液相(保存条件:温度4-10°C、光强50-100LUX)培养保存的560903010 (^),560903009 ( ? )小団状配子体克隆(来源于国家海藻工程技术研究中心种质资源室)采用超声波粉碎仪进行超声粉碎，采用超声6s、间隔5s，超声2次，功率200-300W的程序进行超声波处理I次，处理后的细胞液在温度8-10°C、光强500_800Lux、光时24h条件下预培养10天，得到处理好的配子体克隆系材料。
[0021]2、平衡:取体积分数为10%DMS0溶液ImL加入1.8mL的冻存管中，然后将冻存管置-20°C低温冰箱预先冷冻，预先冷冻工艺在配子体材料进行低温冷冻前一天进行即可。进行抗冻保护液平衡前，从_20°C低温冰箱取出预先冷冻的冻存管，向冻存管中再加入0.SmL的体积分数为10%DMS0低温溶液，使冻存管中DMSO处于固液混合物状态，然后向冻存管中加入步骤I处理好的560903010 (^),560903009 ( ? )配子体克隆系材料，冻存管置0_4°C低温冷藏箱，平衡时间30min。
[0022]3、冷冻保存:将平衡后的配子体材料直接放入-80°C低温冰箱冷冻。
[0023]4、复苏:将冻存管从_80°C冰箱取出，快速放入38-39°C恒温水浴中进行快速解冻，使冰晶完全消失，解冻后配子体材料经煮沸后冷却的低温海水洗涤3次，去除DMSO对配子体的影响，将配子体材料移入培养液(培养液制备:向煮沸后冷却至室温的海水中分别添加硝酸钠、磷酸二氢钾，使NO3-N浓度为10g/m3、PO4-P浓度为lg/m3)中培养。
[0024]采用本方法保存的海带配子体克隆，通过再培养法测定存活率，雌配子体存活率达50%左右，雄配子体存活率达60%左右。
[0025]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、`等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种海带配子体低温冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)材料处理:将培养保存的配子体克隆系进行超声粉碎后，在温度8-10°C、光强500-800Lux、光时24h条件下预培养10天，得处理好的配子体克隆系材料； (2)平衡:取体积分数为10%DMS0溶液ImL加入冻存管中，进行预先冷冻，向预先冷冻的冻存管中再加入0.8mL的10%DMS0溶液，使冻存管中DMSO处于固液混合物状态，然后向冻存管中加入步骤I处理好的配子体克隆系材料，0-4°C下平衡30min ； (3)冷冻保存:将平衡后的配子体材料放入-80°C低温冰箱冷冻； (4)复苏:将_80°C低温冷冻保存的冻存管快速放入恒温水浴中进行快速解冻，解冻后配子体材料经煮沸后冷却的低温海水洗涤去除DMS0，移入培养液中培养。
2.根据权利要求1所述的海带配子体低温冷冻保存方法，其特征在于:步骤(1)中所述的配子体克隆系为雌雄小団状配子体克隆系；所述的超声粉碎是在超声6s、间隔5s，超声2次，功率200-300w的程序进行超声波处理I次。
3.根据权利要求1所述的海带配子体低温冷冻保存方法，其特征在于:步骤(2)中所述的预先冷冻是指在_20°C冰箱中冷冻。
4.根据权利要求1所述的海带配子体低温冷冻保存方法，其特征在于:步骤(4)中所述的恒温水浴的温度为38-39°C,时间为使冻存管中冰晶完全消失为止。
5.根据权利要求2所述的海带配子体低温冷冻保存方法，其特征在于:所述的雌雄小団状配子体克隆系来源于国家海藻工程技术研究中心种质资源室。
【文档编号】A01N3/00GK103725641SQ201310738266
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】罗世菊, 钱瑞, 武瑞娜, 李言, 赛珊, 王利芹, 赵聚萍, 崔翠菊, 李晓捷, 李霞 申请人:山东东方海洋科技股份有限公司