一种山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及超低温保存领域，具体涉及一种山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方 法。
【背景技术】
[0002] 超低温保存是上世纪70年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术。通常 在液氮中保存，被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的 生物学状态，达到长期保存种质的目的，超低温保存是目前唯一不需要连续继代的中长期 保存方式。玻璃化法超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护 剂组成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻 璃化态，并以这种玻璃态在低温下保存。玻璃化法因操作简单快捷，成本低，适宜保存种类 广泛，保存材料遗传性稳定，保存效果好等优点，是近十年来用于优良种质资源中长期保存 的首选方法。
[0003] 山葡萄（VitisamurensisRupr.)，是葡萄科（Vitaleae)葡萄属（Vitis)多年生 落叶藤本浆果类果树，起源于我国东北、俄罗斯远东地区，朝鲜半岛亦有分布。山葡萄品种 基本不发生白腐病、黑痘病和穗轴褐枯病，霜霉病发生较轻或不发生，不需喷布农药防治病 害，用其浆果酿造"绿色山葡萄"酒己成为现实，由于山葡萄浆果含糖量（可溶性固形物）可 达18% -23%，由酿造低档甜红山葡萄酒上升到酿造高档干红山葡萄酒已成为现实。随着 山葡萄酿酒业的不断发展，对原料的需求量越来越大，因而，对山葡萄苗木的需求量也将越 来越大。建园繁殖山葡萄苗木的常规方法有压条繁殖、嫁接繁殖、扦插繁殖和实生繁殖。压 条繁殖的繁殖系数低；嫁接繁殖受到接穗来源的限制；扦插繁殖不易生根；而实生繁殖中， 山葡萄为多基因杂合体，种子播种育苗，会出现90%左右的低产单株。而40年代兴起的组 培繁殖技术实用于山葡萄工厂化育苗，该技术在育种方面具有重要的意义。①加快繁殖，② 病原脱除，③种质资源的交换和保存。因此，通过体细胞胚胎发生的离体快速繁殖和种质资 源的保存对山葡萄优质种苗的需求至关重要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法，用于山葡萄 种质资源的保存，为体细胞胚发生成苗以及新品种培育材料供给提供了一条有效途径。
[0005] -种山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法，包括诱导愈伤组织、风干、超低温保 存、化冻的步骤。
[0006] 进一步地，如上所述的山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法，所述诱导愈伤组 织包括：
[0007] 步骤1 :以山葡萄茎段为材料接种在下列培养基中：
[0008] MS培养基；
[0009]
[0010] 培养条件：温度25±2°C，光照强度1200LUX-1600LUX，每天光照16h诱导愈伤组 织。
[0011] 进一步地，如上所述的山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法，所述风干包括：将 愈伤组织切块并进行风干；所述超低温保存包括：
[0012] 将风干后的山葡萄愈伤组织浸入到含有冷冻保护液的冻存管中，然后将冻存管迅 速投入到液氮中进行超低温保存；所述化冻包括：将液氮中保存的愈伤组织取出置于水浴 锅中化冻。
[0013] 进一步地，如上所述的山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法，在化冻之后，还包 括以下步骤：
[0014] 步骤a:用MS培养基添加质量百分比含量为3%的蔗糖液体作为最终培养基冲洗 两次，每次10~12分钟；
[0015] 步骤b:洗涤后，转移到下列培养基中：
[0016]MS培养基
[0017]
[0018] 培养条件：在25°C进行暗培养2周，然后移到光照强度1200Lux~1600Lux，每天 光照16h。
[0019] 进一步地，如上所述的山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法，所述冷冻保护液 按质量百分比计，包括DMS010%、乙二醇10%、葡萄糖8%，余量：超纯水。
[0020] 进一步地，如上所述的山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法，所述将愈伤组织 切块并进行风干包括：将愈伤组织切成0. 2*0. 2cm小块置于超净工作台中鼓风干燥30min。
[0021] 进一步地，如上所述的山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法，步骤4中，所述水 浴锅的温度为40°C。
[0022] 有益效果：
[0023] 1、山葡萄愈伤组织的繁殖率高。
[0024] 2、避免了田间圃位保存易受自然灾害影响而导致种质丢失或毁灭的危险。
[0025] 3、避免了试管苗组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险。
[0026] 4、山葡萄愈伤组织不需经过长期继代保存，降低人工劳动强度。
【附图说明】
[0027] 图1为实施例2干燥时间对山葡萄愈伤组织存活率的影响图；
[0028] 图2为实施例3装载液对山葡萄愈伤组织存活率的影响图；
[0029] 图3为实施例4化冻温度对山葡萄愈伤组织存活率的影响图；
[0030] 图4为实施例5暗培养时间对山葡萄愈伤组织存活率的影响图。
【具体实施方式】
[0031] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0032] 本发明提供一种山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法，包括以下步骤：
[0033] 步骤1:以山葡萄茎段为材料接种在MS培养基中添加BA(6_苄氨基腺嘌 呤）2mg?L\NAA(萘乙酸）0?Img?L\蔗糖30g?L\琼脂7g?L1中，温度25±2°C，光照 强度1200Lux~1600Lux，每天光照16h的条件下诱导愈伤组织；
[0034] 步骤2 :将愈伤组织切成0. 2*0. 2cm小块置于超净工作台中鼓风干燥30min;
[0035] 具体地，将愈伤组织切成0. 2*0. 2cm小块置于超净工作台中鼓风干燥30min，使愈 伤组织适当脱水，可在超低温保存过程中防止组织内冰晶的形成。
[0036] 步骤3 :然后浸入到装有冷冻保护液的冻存管中，然后将冻存管迅速投入到液氮 中进行超低温保存；
[0037] 具体地，所述冷冻保护液对愈伤组织起到保护作用。
[0038] 步骤4 :将液氮中保存的愈伤组织取出置于40°C水浴锅中化冻；
[0039] 步骤5 :用MS添加3 %蔗糖液体培养基冲洗两次，每次10~12分钟；
[0040] 步骤6 :洗涤后，转移到MS培养基中添加BA(6-苄氨基腺嘌呤）Img?L1、NAA(萘 乙酸）0. 5mg?L\蔗糖30g?L\琼脂7g?L1中，在25°C进行暗培养2周，然后移到光照强 度1200LUX~16