一种利用蓝莓莱格西叶片诱导产生微不定芽的繁育方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用蓝莓莱格西叶片诱导产生微不定芽的繁育方法。
【背景技术】
[0002]蓝莓(Blueberry)属杜鹊花科(Ericaceae)越桔属(Vacciniumspp.)，多年生绿叶或常绿灌木，其蓝色浆果富含多种维生素及微量元素，具有抗氧化、延缓脑神经衰老、增强人机体免疫等功能。正是由于蓝莓的营养及药用保健功能，国际粮农组织已将其列为人类的五大健康食品之一。
[0003]我国于80年代由吉林农业大学率先开展蓝莓的研究工作，在对我国蓝莓野生资源充分调查的基础之上，于1983年开始从国外引种，到目前引入优良品种150多个，其中包括蓝莓莱格西(Legacy)，属于北高丛蓝莓(Vac cinium corymbosum)，北高丛蓝莓是越桔属中经济价值最高的I个种(顾姻等，2001)。莱格西(Legacy)，1993年美国新泽西州培育的中晚熟品种，树干直立型，果粒中?大，甜度BX14.0%，酸度pH3.44，有香味。丰产性强。果实甜中带酸，较受人们喜爱。果实贮藏性好，便于运输。
[0004]国外关于蓝莓的微繁和离体再生研究相对较早，已有大量的报道[GRAHAM J，1996 ；CA0 X 1,2002 ；GU0-QING SONG，2004 ;等]，但也存在如品种间微繁其不定芽再生差异较大，叶片、茎段再生率低，生根率低等诸多问题。国内在这方面的研究大多还处于微繁研究的起步阶段[刘树英，2002、2004 ;黄文江2004]，对离体诱导不定芽再生植株仅有少量报道[马怀宇，2004]，再生率均未达到100%，也没有对影响叶片再生的一些因素进行系统的研究。陶建敏
[2006]以高丛蓝楽果(Vaccinium corymbosum) ‘伯克利’ (Berkly)和‘蓝丰’(Bluecrop)的叶片为外植体，研究了影响离体再生的多个因素，建立了高效的再生体系，再生率达到100%。崔广荣
[2008]以‘蓝丰’试管苗叶片为外植体、以改良WPM为基本培养基，研究了外源激素TDZ、ZT及其组合对离体叶片胚状体发生的影响，同时也探讨了蔗糖浓度、水解酪蛋白、椰汁等对胚状体发生、丛芽形成的影响。赵建萍
[2007]以北高丛越桔优良品种‘晚蓝’、‘蓝丰’带芽茎段的离体培养进行了系统研究，成功地建立了高效快繁体系，每个茎段上的有效苗(高1.5cm以上且生长健壮的小苗)数最高达9.8。国内外有关蓝莓莱格西组培快繁的文献较少，且利用蓝莓莱格西叶片诱导微不定芽及微不定芽成苗的繁育方法尚未见报道。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种利用2种基本培养基和4种植物生长调节剂不同浓度配比诱导蓝莓莱格西叶片微不定芽以及提高微不定芽成苗率的繁育方法，即一种利用蓝莓莱格西叶片诱导产生微不定芽的繁育方法。
[0006]本发明所述利用蓝莓莱格西叶片诱导产生微不定芽的繁育方法，步骤包括:(I)无菌试管苗培育；(2)叶片愈伤组织培养；(3)叶片微不定芽分化；(4)微不定芽成苗；(5)试管苗生根；(6)试管苗移栽；
[0007]其特征在于:
[0008]步骤(I)所述无菌试管苗培育的方法是:选取当年生幼嫩枝条顶梢长10±lcm，去掉叶片，剪成带2个芽茎段，消毒后接种到茎段侧芽启动培养基中，置于组培室，白天光照强度为2000?2500Lux，光照时间12?14h.d \温度25±1°C ;夜间温度18±1°C，20?25d后侧芽萌发，获得无菌苗；
[0009]步骤(2)所述叶片愈伤组织培养的方法是:将步骤(I)培育的无菌苗叶片切去叶缘，沿叶脉横着划伤2刀，接种于培养叶片愈伤组织培养基中，置于培养箱中暗培，温度25±1°C，15?20d后获得叶片淡黄色愈伤组织；
[0010]步骤(3)所述叶片微不定芽分化的方法是:将步骤(2)培养的叶片淡黄色愈伤组织切成0.2?0.5cm3块状，转接种到叶片微不定芽分化培养基中，以步骤(I)所述昼夜光照周期条件培养10?15d获得带有微不定芽愈伤块；
[0011]步骤(4)所述微不定芽成苗的方法是:将步骤(3)培养的带有微不定芽愈伤块转接到微不定芽成苗培养基中，以步骤(I)所述昼夜光照周期条件培养15?20d获得3?5cm成苗植株；
[0012]步骤(5)所述试管苗生根的方法是:将步骤(4)获得的成苗，将其从基部切下，接种到生根培养基中，以步骤(I)所述昼夜光照周期条件培养12?15d获得生根数5?6条、根长I?2cm的生根植株；
[0013]步骤(6)所述试管苗移栽的方法是:把步骤(5)获得的生根植株移到温室中适应2?3d后，用镊子将苗轻轻夹出，放到盛有清水的容器中，用清水洗去根部残留的培养基，移栽到装有育苗基质的营养杯中，放置于遮光度70%?80%遮荫网温室内，利用自动间歇喷雾装置保持室内空气相对湿度在85 %以上，炼苗12?15d后，温室内逐渐通风，再继续培养12?15d，移栽的试管苗成活率90%以上；其中所述育苗基质的成分以体积比计为:蛭石:珍珠岩:草炭土 = 2:3:5，且营养杯中育苗基质上面放置有1.5?2cm厚的处理过的笞藓；
[0014]上述各步中使用的培养基及其配方具体是:
[0015]茎段侧芽启动培养基是指:WPM培养基+6-BA 03?0.5mg -L k蔗糖20?25g-L '+琼脂4?5g.L ^ pH值5.4?5.6 ;
[0016]叶片愈伤组织培养基是指:MSB培养基+苯基噻二唑基脲(TDZ) 0.5?2.0mg-L '+玉米素(ZT) 3.5 ?4.5mg.L1+ 蔡乙酸(NAA)0.5 ?1.0mg.L 1+25 ?35mg.L 1 鹿糖 +4 ?5mg.L1琼脂，pH 值 5.2 ?5.4;
[0017]叶片微不定芽分化培养基是指:MSB培养基+苯基噻二唑基脲(TDZ)0.1?1.0mg.L1+ 玉米素(ZT) 3.0 ?5.0mg.L1+ Π引噪丁酸(IBA) 0.3 ?0.5mg.L 1+25 ?35mg.L 1鹿糖+4?5mg.L 1琼脂，pH值5.2?5.4 ;
[0018]微不定芽成苗培养基是指:WPM培养基+玉米素(ZT) 3.0?5.0mg-L '+吲哚丁酸(IBA) 0.2 ?0.4mg.L 1+25 ?35mg.L 1 鹿糖 +4 ?5mg.L 1 琼脂，pH 值 5.2 ?5.4 ;
[0019]试管苗生根培养基是指:1/2WPM培养基+0.2?0.5mg.L 1剛哚丁酸(IBA) +0.01 ?0.03mg.L 1 蔡乙酸(NAA)+0.1 ?0.2mg/L 玉米素(ZT)+20 ?25g.L 1 鹿糖+4 ?5g.L 1 琼脂，pH 值 5.4 ?5.6 ;
[0020]其中MSB 培养基的组分为:KN031900mg.L、NH4N0316 50mg.L \ MgSO4.7H20370mg.L、KH2PO4170mg.L、CaCl2.2H204 40mg.L、MnSO4.4H20 22.3mg.L \ ZnSO4.7H208.6mg.L \ H3B036.2mg.L \ KI 0.83mg.L \ NaMoO4.2H200.25mg.L \ CuSO4.5H20
0.025mg.L \ CoCl2.6H20 0.025mg.L \ Na2-EDTA 37.3mg.L \ FeSO4.7H2027.8mg.L \盐酸硫胺素1mg.L \盐酸比卩多醇1.0mg.L \烟酸1.0mg.L \肌醇10mg.L S
[0021]WPM 培养基的组分为:NH4N03400mg.L \ Ca (N03) 2 *4H20556mg.L 1^K2SO4QgOmg.L \CaCl2.2H20 96mg.L \ KH2P04170mg.L \ Na2MoO4.2H20 0.25mg.L ^ MgSO4.7H20370mg.L \ MnS04.4H20 22.4mg.L \ ZnS04.7H20 8.6mg.L \ CuS04.5H20 0.25mg.L \FeS04.7H20 27.8mg.L \ Na2-EDTA 37.3mg.L \ 盐酸硫胺素 1.0mg.L \ 烟酸 0.5mg.L \盐酸比卩多醇0.5mg.L、肌酉享10mg.L \甘氨酸2.0mg.L S
[0022]1/2WPM培养基是指WPM培养基组分中大量元素减半且其余为WPM全量元素，其具体组分为:NH4N03400mg.L、Ca (N03) 2.4H20556mg.L、K2S04990mg.L \ CaCl2.2H2096mg.L 1,KH2P04170mg.L 1^Na2MoO4.2Η20 0.25mg.L 1^MgS () 4 *7H20370mg.L 1,MnS04.4H2022.4mg.L \ ZnS04.7H20 8.6mg.L \ CuS04.5H200.25mg.L \ FeS04.7H20 27.8mg.L \Na2-EDTA 37.3mg.L \ 盐酸硫胺素 1.0mg.L \ 烟酸 0.5mg.L \ 盐酸比唆醇 0.5mg.L \ 肌醇 10mg.L \ 甘氨酸 2.0mg