用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基和培养方法
【专利摘要】一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基和培养方法，包含有腋芽萌发启动培养基，其中：腋芽萌发启动培养基设置为包含有：MS、BA、IBA，在MS、BA和IBA组成的腋芽萌发启动培养基上，对苹果矮化砧木离体叶片产生不定芽的效果好，因此实现了苹果矮化砧木离体叶片高频率不定芽再生。
【专利说明】用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基和培养 方法
[0001] 一、技术领域 本发明涉及一种产生不定芽的培养基和培养方法，尤其是一种用于苹果抗寒矮化砧木 离体叶片产生不定芽的培养基和培养方法。
[0002] 二、【背景技术】 离体叶片再生不定芽技术是在细胞水平进行诱变育种、体细胞变异筛选、嵌合体分离 的基础，也是利用植物遗传工程进行外源基因转移的基础，同时也是在材料较少时实现植 物快速克隆的基础。因此用于果树离体叶片的产生不定芽的培养基和培养方法是植物繁殖 方法，被广泛地应用在植物的种质创新及新品种选育中。植物叶片培养第一个获得成功的 是1953年Steeves和Susex培养紫箕叶获得了再生不定植株。之后，由于培养基成分的不断 研究和完善，越来越多的植物种获得了叶片培养成功。特别是植物遗传工程的发展，使叶片 培养研究越来越受到植物育种研究者们的重视，因为植物遗传转化操作的成功应用依赖于 离体叶片不定芽再生体系的建立。到现在，植物叶片培养已走过了半个多世纪，获得不定芽 再生成功的植物种类也在日益增多，但由于不同物种基因型及遗传背景的复杂性，至今研 究者们还不能实现对所有植物种的叶片培养再生。即使已成功的物种，由于不同类型和不 同品种其基因型的差异，其再生的难易和所需的培养基条件也存在较大差异。特别是一些 果树的品种其离体叶片再生非常困难，因此现有的组培技术都是对特定物种的类型或品种 是适宜的，换一个品种或类型可能就是不适宜的或说不是最佳的。如苹果砧木'M26'、 'MM106'建立了高效离体叶片不定芽再生体系并利用这个再生体系获得了转基因植株，我 国吉林农科院选育的苹果抗寒矮化砧木'GM256'也获得了不定芽再生成功，但同样是吉林 农科院选育出的综合性状优于'GM256'的另一个抗寒矮化砧木'GM310'的叶片培养再生困 难。利用培养'GM256'的叶片培养基及培养条件，不能成功诱导'GM310'叶片产生不定芽。利 用已报道的苹果属其他种的叶片培养方法来培养'GM310'也未能成功。表明现有的培养条 件都不适宜'GM310'的叶片培养，需要研究开发一种适宜'GM310'叶片培养的培养基，为更 好的开发利用具有我国自主知识产权的苹果优良砧木'GM310'奠定基础。
[0003] 三、
【发明内容】
本发明的技术客体是一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养方法， 本发明的技术客体是一种用于苹果抗寒矮化砧木叶片产生不定芽的培养基。
[0004] 为了克服上述技术缺点，本发明的目的是提供一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶 片产生不定芽的培养基和培养方法，因此获得了苹果抗寒矮化砧木离体叶片高频率不定芽 再生成功。
[0005] 为达到上述目的，本发明采取的技术方案是:一种用于果树离体叶片产生不定芽 的培养基，包含有腋芽萌发启动培养基，其中：腋芽萌发启动培养基设置为包含有:MS、BA、 IBAo
[0006] 由于设计了MS、BA和IBA，在MS、BA和IBA组成的腋芽萌发启动培养基上，果树离 体叶片的产生不定芽的效果好，因此实现了果树离体叶片的产生不定芽的育苗。
[0007] 本发明设计了，按照离体叶片产生不定芽的不同阶段，还包含有绿苗增殖培养基、 不定芽诱导培养基和幼苗生根培养基； 其中：腋芽萌发启动培养基设置为包含有:MS、BA、IBA，绿苗增殖培养基设置为包含 有:WPM、BA、IBA、GA3、蔗糖，不定芽诱导培养基设置为包含有:1^、102、嫩4、山梨糖醇，幼 苗生根培养基设置为包含有:MS(MS1)、IBA、蔗糖。
[0008] 本发明设计了，腋芽萌发启动培养基设置为包含有:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L鹿糖。
[0009] 绿苗增殖培养基设置为包含有:WPM + 0.5~1.0 mg/L BA + 0.01~0.5 mg/L IBA + 0.1~0.5mg/L GA3 + 30 g/L鹿糖。
[0010] 不定芽诱导培养基设置为包含有:MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5mg/L NAA + 10g/L~50g/L山梨糖醇。
[0011] 幼苗生根培养基设置为包含有:MS(MSl) + 0.1~2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
[0012] 本发明设计了，MS(Murashige and Skoog)培养基组成：
改良MS即MSI:对MS中无机成分的大量元素进行改良，其他成分不变，改良如下： 大量元素 工作浓度(mg/L) NH4N03 825 KN03 950 KH2P04 170 MgS04 · 7H20 370 CaCl2 · 2H20 440， WPM培养基组成：
植物生长调节物质:6 -苄基氨基嘌呤(BA)，噻苯隆(TDZ)，吲哚丁烟酸（IBA)，萘乙烟 酸(NAA)，赤霉素(GA3)， 碳源:蔗糖，山梨糖醇， 无离子水， 琼脂粉。
[0013] 本发明设计了，一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养方法，其 步骤是： 选择品种编号为'GM310 '的苹果抗寒矮化砧木为技术客体并且建立'GM310 '的离体叶 片产生不定芽的培养方法。
[0014] a、腋芽萌发启动培养:从果园种植的抗寒矮化苹果砧木'GM310'的小树上剪取当 年生半木质化枝条，剪掉叶片后把枝条带回实验室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体先用 洗衣粉水清洗，而后放自来水流水冲洗30分钟以上，把材料取出放入超净台上的无菌烧杯 内，加入次氯烟酸钠其中有效氯为5%的溶液，杀菌8分钟，期间摇动3~5次，倒出次氯烟酸钠 用无菌水洗4~6次，把芽段接种到装有腋芽萌发启动培养基:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖的培养瓶内，把培养瓶置培养室内培养实现腋芽萌发启动培养和无菌试 管苗建立的技术目的； b、 绿苗培养：启动培养基上萌发生长获得的绿苗即无菌苗，转移到绿苗增殖培养基： WPM + 0.5~1.0 mg/L BA + 0.01~0.5 mg/L IBA + 0.1~0.5mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖上进 行增殖快繁，把培养瓶置培养室内培养实现绿苗培养和试管苗增殖的技术目的； c、 不定芽培养:试管苗继代增殖培养基生长至4-5周时，取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶 片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切3-6刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个 带多个切口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，不定芽诱导培养基为:MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5mg/L NAA + 10g/L~50g/L山梨糖醇;在培养室中培养实现 不定芽培养和离体叶片不定芽诱导培养的技术目的； d、 幼苗生根培养:切取生长高度在1.5厘米以上的试管苗转移到幼苗生根培养基:改 良MS(MSl) + 0.1~2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上进行生根培养，培养条件为先连续暗培养 7天，然后转到16小时光周期培养条件下培养，在培养室中培养实现幼苗培养和试管苗生根 的技术目的。
[0015] 本发明设计了，所有培养基在灭菌前调pH值到5.8，然后在121°C，1个大气压下高 压灭菌20分钟，培养室培养温度为25 ± 2°C，光照周期为16小时/天。
[0016] 本发明设计了，MS(Murashige and
Skoog)培养基组成： 改良MS即MSI:对MS中无机成分的大量元素进行改良，其他成分不变，改良如下：
大量元素 工作浓度(mg/L) NH4N03 825 KN03 950 KH2P04 170 MgS04 · 7H20 370 CaCl2 · 2H20 440 WPM培养基组成：
植物生长调节物质:6 -苄基氨基嘌呤(BA)，噻苯隆(TDZ)，吲哚丁烟酸（IBA)，萘乙烟 酸(NAA)，赤霉素(GA3)。
[0017] 碳源:鹿糖，山梨糖醇 无离子水 琼脂粉。
[0018] 本发明设计了，苹果优良抗寒矮化砧木'GM310'的离体叶片不定芽再生。
[0019] 本发明的技术效果在于:对苹果砧木'GM310'叶片不定芽再生很困难这一问题，能 有效克服叶片不定芽不能再生和再生率低的问题，成功获得高频率叶片不定芽再生。并获 得了不定芽继代繁殖后绿苗的生根。本专利技术可用于砧木的无性繁殖、植物的细胞工程 及基因工程的遗传改良等，我们实验室在建立苹果抗寒矮化砧木'GM256'快繁技术体系的 基础上，又建立了综合性状优于'GM256'的另一苹果抗寒矮化砧木'GM310'的试管苗。在 'GM310'试管苗繁殖中，我们发现这一砧木的增殖和生根培养基都和'GM256'不同，和以前 报道的其他苹果砧木的试管苗快繁的培养基也不同，增殖和生根都比较困难。取其离体叶 片进行不定芽诱导，不定芽再生困难，表现在用已报道的苹果品种及其砧木叶片培养的培 养基都未能诱导'GM310'叶片获得再生不定芽。这一结果说明已报道的培养基中的某些成 分可能不适宜'GM310'叶片的培养。本专利的发明目的就是解决我国自选苹果优良砧木 'GM310'叶片培养不定芽再生困难的问题，建立'GM310'叶片不定芽再生技术体系，为这一 优良砧木的无性快繁提供技术基础，同时也为利用基因工程和细胞工程技术对这一砧木进 行遗传改良提供基础，叶片不定芽再生率高，为85%，有效解决了苹果矮化砧木' GM310 '难再 生的难题。
[0020] 在本技术方案中，改良MS是指MSI。
[0021] 在本技术方案中，腋芽萌发启动培养基中MS、BA和IBA为重要技术特征，在用于果 树离体叶片的产生不定芽的培养基和培养方法的技术领域中，具有新颖性、创造性和实用 性，在本技术方案中的术语都是可以用本技术领域中的专利文献进行解释和理解。
[0022] 四、【附图说明】 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技 术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据 这些附图获得其他的附图。
[0023]图1为本发明的苹果抗寒矮化砧木'GM310'的试管苗的建立和增殖的效果图： 其中:A:腋芽萌发;B:在WPM上增殖；C :在MSI上增殖;D:在MS上增殖 图2为本发明的苹果抗寒矮化砧木'GM310'的叶片不定芽再生和试管苗生根的效果图： 其中：A:培养基MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5 mg/L NAA + 10 g/L~50 g/L 山梨 糖醇上诱导不定芽再生;B:培养基MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5 mg/L NAA + 10 g/L~ 50 g/L蔗糖上诱导不定芽再生;C:培养基MS + 3~7 mg/L BA + 0.1~0.5 mg/L NAA + 10 g/L~50 g/L鹿糖上诱导不定芽再生。
[0024] 五、【具体实施方式】 下面结合实施例，对本发明进一步描述，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明 的进一步限定。一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养方法，第一个实施 例，其步骤是： 选择品种编号为'GM310 '的苹果抗寒矮化砧木为技术客体并且建立'GM310 '的离体叶 片产生不定芽的培养方法。
[0025] a、腋芽萌发启动培养:从果园种植的苹果抗寒矮化砧木'GM310'的小树上剪取当 年生半木质化枝条，剪掉叶片后把枝条带回实验室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体先用 洗衣粉水清洗，而后放自来水流水冲洗30分钟以上，把材料取出放入超净台上的无菌烧杯 内，加入次氯烟酸钠其中有效氯为5%的溶液，杀菌8分钟，期间摇动3次，倒出次氯烟酸钠用 无菌水洗4次，把芽段接种到装有腋芽萌发启动培养基:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖的培养瓶内，把培养瓶置培养室内培养实现腋芽萌发启动培养和无菌试管苗 建立的技术目的； b、 绿苗培养：启动培养基上萌发生长获得的绿苗即无菌苗，转移到绿苗增殖培养基： WPM + 0.5 mg/L BA + 0.01 mg/L IBA + O.lmg/L GA3 + 30 g/L蔗糖上进行增殖快繁，把 培养瓶置培养室内培养实现绿苗培养和试管苗增殖的技术目的； c、 不定芽培养:试管苗继代增殖培养基生长至4周时，取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶 片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切3刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带 多个切口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，不定芽诱导培养基为:MS + 0.1 mg/L TDZ + 0.1mg/L NAA + 10 g/Lg/L山梨糖醇;在培养室中培养实现离体叶片不 定芽诱导培养的技术目的； d、 幼苗生根培养:切取生长高度在1.5厘米的试管苗转移到幼苗生根培养基:改良MS (MSI) + 0.1 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上进行生根培养，培养条件为先连续暗培养7天，然 后转到16小时光周期培养条件下培养，在培养室中培养实现幼苗培养和试管苗生根的技术 目的。
[0026]在本实施例中，所有培养基在灭菌前调pH值到5.8,然后在121°C，1个大气压下高 压灭菌20分钟，培养室培养温度为25 ± 2°C，光照周期为16小时/天。
[0027] 在本实施例中，基本培养基 MS(Murashige and Skoog)培养基组成：
改良MS即MSI:对MS中无机成分的大量元素进行改良，其他成分不变，改良如下：大量元素 工作浓度(mg/L)NH4N03 825KN03 950KH2P04 170MgS04 · 7H20 370CaCl2 · 2H20 440WPM培养基组成：
植物生长调节物质：6 -苄基氨基嘌呤(BA)，噻苯隆(TDZ)，吲哚丁烟酸（IBA)，萘乙烟 酸(NAA)，赤霉素 (GA3)。
[0028] 碳源:鹿糖，山梨糖醇 无离子水 琼脂粉。
[0029] -种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养方法，第二个实施例，其 步骤是： 选择品种编号为'GM310 '的苹果抗寒矮化砧木为技术客体并且建立'GM310 '的离体叶 片产生不定芽的培养方法。
[0030] a、腋芽萌发启动培养:从果园种植的苹果抗寒矮化砧木'GM310'的小树上剪取当 年生半木质化枝条，剪掉叶片后把枝条带回实验室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体先用 洗衣粉水清洗，而后放自来水流水冲洗30分钟以上，把材料取出放入超净台上的无菌烧杯 内，加入次氯烟酸钠其中有效氯为5%的溶液，杀菌8分钟，期间摇动5次，倒出次氯烟酸钠用 无菌水洗6次，把芽段接种到装有腋芽萌发启动培养基:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖的培养瓶内，把培养瓶置培养室内培养实现腋芽萌发启动培养和无菌试管苗 建立的技术目的； b、 绿苗培养：启动培养基上萌发生长获得的绿苗即无菌苗，转移到绿苗增殖培养基： WPM + 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L IBA +0.5mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖上进行增殖快繁，把培 养瓶置培养室内培养实现绿苗培养和试管苗增殖的技术目的； c、 不定芽培养:试管苗继代增殖培养基生长至5周时，取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶 片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切6刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带 多个切口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，不定芽诱导培养基为:MS + 4 mg/L TDZ + 0.5mg/L NAA + 10 50 g/L山梨糖醇;在培养室中培养实现离体叶片不定 芽诱导培养的技术目的； d、 幼苗生根培养:切取生长高度在1.9厘米的试管苗转移到幼苗生根培养基:改良MS (MSI) + 2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上进行生根培养，培养条件为先连续暗培养7天，然后 转到16小时光周期培养条件下培养，在培养室中培养实现幼苗培养和试管苗生根的技术目 的。
[0031] -种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养方法，第三个实施例，其 步骤是： 选择品种编号为'GM310 '的苹果抗寒矮化砧木为技术客体并且建立'GM310 '的离体叶 片产生不定芽的培养方法。
[0032] a、腋芽萌发启动培养:从果园种植的苹果抗寒矮化砧木'GM310'的小树上剪取当 年生半木质化枝条，剪掉叶片后把枝条带回实验室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体先用 洗衣粉水清洗，而后放自来水流水冲洗30分钟以上，把材料取出放入超净台上的无菌烧杯 内，加入次氯烟酸钠其中有效氯为5%的溶液，杀菌8分钟，期间摇动3~5次，倒出次氯烟酸钠 用无菌水洗4~6次，把芽段接种到装有腋芽萌发启动培养基:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖的培养瓶内，把培养瓶置培养室内培养实现腋芽萌发启动培养和无菌试 管苗建立的技术目的； b、 绿苗培养：启动培养基上萌发生长获得的绿苗即无菌苗，转移到绿苗增殖培养基： WPM + 0.5~1.0 mg/L BA + 0.01~0.5 mg/L IBA + 0.1~0.5mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖上进 行增殖快繁，把培养瓶置培养室内培养实现绿苗培养和试管苗增殖的技术目的； c、 不定芽培养:试管苗继代增殖培养基生长至4~5周时，取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩 叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切3~6刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一 个带多个切口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，不定芽诱导培养基为： MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5mg/L NAA + 10 g/L~50 g/L山梨糖醇;在培养室中培养 实现离体叶片不定芽诱导培养的技术目的； d、 幼苗生根培养:切取生长高度在1.5厘米以上的试管苗转移到幼苗生根培养基:改 良MS(MSl) + 0.1~2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上进行生根培养，培养条件为先连续暗培养 7天，然后转到16小时光周期培养条件下培养，在培养室中培养实现幼苗培养和试管苗生根 的技术目的。
[0033] -种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养方法，第四个实施例，其 步骤是： 选择品种编号为'GM310 '的苹果抗寒矮化砧木为技术客体并且建立'GM310 '的离体叶 片产生不定芽的培养方法。
[0034] a、腋芽萌发启动培养:从果园种植的苹果抗寒矮化砧木'GM310'的小树上剪取当 年生半木质化枝条，剪掉叶片后把枝条带回实验室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体先用 洗衣粉水清洗，而后放自来水流水冲洗30分钟以上，把材料取出放入超净台上的无菌烧杯 内，加入次氯烟酸钠其中有效氯为5%的溶液，杀菌8分钟，期间摇动4次，倒出次氯烟酸钠用 无菌水洗5次，把芽段接种到装有腋芽萌发启动培养基:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖的培养瓶内，把培养瓶置培养室内培养实现腋芽萌发启动培养和无菌试管苗 建立的技术目的； b、 绿苗培养：启动培养基上萌发生长获得的绿苗即无菌苗，转移到绿苗增殖培养基： WPM + 0.75 mg/L BA + 0.25 mg/L IBA + 0.25mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖上进行增殖快繁， 把培养瓶置培养室内培养实现绿苗培养和试管苗增殖的技术目的； c、 不定芽培养:试管苗继代增殖培养基生长至5周时，取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶 片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切4刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带 多个切口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，不定芽诱导培养基为:MS + 0.28 mg/L TDZ + 0.35mg/L NAA + 30 g/L山梨糖醇;在培养室中培养实现离体叶片不定 芽诱导培养的技术目的； d、 幼苗生根培养:切取生长高度在1.7厘米的试管苗转移到幼苗生根培养基：改良MS (MSI) + 1.1 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上进行生根培养，培养条件为先连续暗培养7天，然 后转到16小时光周期培养条件下培养，在培养室中培养实现幼苗培养和试管苗生根的技术 目的。
[0035] -种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基。第一个实施例，按照 离体叶片的产生不定芽的不同阶段，包含有腋芽萌发启动培养基、绿苗增殖培养基、不定芽 诱导培养基和幼苗生根培养基;其中： 腋芽萌发启动培养基设置为包含有:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗 糖。
[0036] 绿苗增殖培养基设置为包含有:WPM + 0.5 mg/L BA + 0.01 mg/L IBA + O.lmg/ L GA3 + 30 g/L鹿糖。
[0037] 不定芽诱导培养基设置为包含有:MS + 0.1mg/L TDZ + 0.1mg/L NAA + 10 g/L 山梨糖醇。
[0038] 幼苗生根培养基设置为包含有:改良MS(MSl) + 0.1mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
[0039] 苹果抗寒矮化砧木'GM310'的离体叶片产生不定芽的培养的试验结果：苹果抗寒 矮化砧木' GM310 '的芽段成功获得了腋芽萌发生长的绿芽梢（图1，A)，说明培养基MS、BA和 IBA对' GM310 '的腋芽的启动培养是有效的。
[0040] 腋芽萌发获得的无菌绿苗转移到增殖培养基上继代增殖培养，结果表明在培养基 WPM、BA、IBA、GA3、蔗糖上生长最好，表现为苗既有增殖生长又有伸长生长，且叶色绿 (图1，B);但在添加相同植物生长调节物质的改良MS(MS1)上增殖较差，苗表现老化，叶色也 较黄（图1，C);在MS培养基上虽然有增殖，但苗不伸长，且表现黄化（图1，D)，也不是理想的 增殖培养基。
[0041 ]叶片产生不定芽的适宜培养基为MS、TDZ、NAA、山梨糖醇（图2，A)，不定芽再 生率为85%。而在培养基MS、TDZ、NAA、蔗糖（图2，B)和培养基MS、BA、NAA、蔗糖（图 2，C)上，不定芽再生率都在15%以下。
[0042]健康绿苗经生根诱导培养20天，生根率在85%以上（图2，D)，说明所选用生根培养 基能A:培养基MS、TDZ、NAA、山梨糖醇上诱导不定芽再生;B:培养基MS、TDZ、NAA、蔗糖 上诱导不定芽再生;C:培养基MS、BA、NAA、蔗糖上诱导不定芽再生有效诱导'GM310'试 管苗的生根。
[0043] -种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基。第二个实施例，按照 离体叶片的产生不定芽的不同阶段，包含有腋芽萌发启动培养基、绿苗增殖培养基、不定芽 诱导培养基和幼苗生根培养基;其中： 腋芽萌发启动培养基设置为包含有:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗 糖。
[0044] 绿苗增殖培养基设置为包含有:WPM + 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L IBA +0.5mg/L GA3 + 30 g/L鹿糖。
[0045] 不定芽诱导培养基设置为包含有:MS + 4 mg/L TDZ + 0.5mg/L NAA + 50 g/L 山梨糖醇。
[0046] 幼苗生根培养基设置为包含有:改良MS(MSl) + 2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
[0047] 一种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基。第三个实施例，按照 离体叶片的产生不定芽的不同阶段，包含有腋芽萌发启动培养基、绿苗增殖培养基、不定芽 诱导培养基和幼苗生根培养基;其中： 腋芽萌发启动培养基设置为包含有:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗 糖。
[0048] 绿苗增殖培养基设置为包含有:WPM + 0.5~1.0 mg/L BA + 0.01~0.5 mg/L IBA + 0.1~0.5mg/L GA3 + 30 g/L鹿糖。
[0049] 不定芽诱导培养基设置为包含有:MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5mg/L NAA + 10 g/L~50 g/L山梨糖醇。
[0050] 幼苗生根培养基设置为包含有：改良MS(MSl) + 0.1~2 mg/L IBA + 20 g/L蔗 糖。
[0051] -种用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基。第四个实施例，按照 离体叶片的产生不定芽的不同阶段，包含有腋芽萌发启动培养基、绿苗增殖培养基、不定芽 诱导培养基和幼苗生根培养基;其中： 腋芽萌发启动培养基设置为包含有:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗 糖。
[0052] 绿苗增殖培养基设置为包含有:WPM + 0.75 mg/L BA + 0.21mg/L IBA + 0.3mg/ L GA3 + 30 g/L鹿糖。
[0053] 不定芽诱导培养基设置为包含有:MS + 0.21 mg/L TDZ + 0.3mg/L NAA + 30 g/ Lg/L山梨糖醇。
[0054] 幼苗生根培养基设置为包含有:改良MS(MSl) + l.lmg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
[0055] 本发明具有下特点： 1、由于设计了MS、BA和IBA，在MS、BA和IBA组成的腋芽萌发启动培养基，对果树离体 叶片的产生不定芽的效果好，因此实现了果树离体叶片的产生不定芽的育苗。
[0056] 2、由于设计了绿苗增殖培养基、不定芽诱导培养基和幼苗生根培养基实现了对萌 发启动腋芽的后续培育，提高了育苗率。
[0057] 3、由于设计了基本培养基和碳源，通过1^、1?1、13(1^1)、山梨糖醇对果树离体叶 片细胞的诱导，激发了果树离体叶片体细胞的不定芽分化能力。
[0058] 4、由于设计了对结构形状进行了数值范围的限定，使数值范围为本发明的技术方 案中的技术特征，不是通过公式计算或通过有限次试验得出的技术特征，试验表明该数值 范围的技术特征取得了很好的技术效果。
[0059] 5、由于设计了本发明的技术特征，在技术特征的单独和相互之间的集合的作用， 通过试验表明，本发明的各项性能指标为现有的各项性能指标的至少为1.7倍，通过评估具 有很好的市场价值。
[0060] 还有其它的与腋芽萌发启动培养基中MS、BA和IBA的相同或相近似的其它技术特 征都是本发明的实施例之一，并且以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为 满足专利法、专利实施细则和审查指南的要求，不再对上述实施例中的各个技术特征所有 可能的组合的实施例都进行描述。
[0061] 因此在用于苹果抗寒矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养基和培养方法技术领 域内，凡是包含有内层1设置为化学肥料与植物秸杆或植物叶体的高压形成的混合体的技 术内容都在本发明的保护范围内。
[0062] 上述实施例只是本发明所提供的用于苹果矮化砧木离体叶片产生不定芽的培养 基和培养方法的一种实现形式，根据本发明所提供的方案的其他变形，增加或者减少其中 的成份或步骤，或者将本发明用于其他的与本发明接近的技术领域，均属于本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 一种用于苹果抗寒矮化化木离体叶片产生不定芽的培养基，其特征是:包含有蔽芽 萌发启动培养基，其中：蔽芽萌发启动培养基设置为包含有:MS、BA、IBA。2. 根据权利要求1所述的用于苹果抗寒矮化化木离体叶片产生不定芽的培养基，其特 征是:按照离体叶片产生不定芽的不同阶段，还包含有绿苗增殖培养基、不定芽诱导培养基 和幼苗生根培养基， 其中：蔽芽萌发启动培养基设置为包含有:MS、BA、IBA，绿苗增殖培养基设置为包含 有:WPM、BA、IBA、GA3、薦糖，不定芽诱导培养基设置为包含有:MS、TDZ、NAA、山梨糖醇，幼 苗生根培养基设置为包含有:MS(MS1)、IBA、薦糖。3. 根据权利要求2所述的用于苹果抗寒矮化化木离体叶片产生不定芽的培养基，其特 征是:蔽芽萌发启动培养基设置为包含有:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L薦 糖， 绿苗增殖培养基设置为包含有:WPM + 0.5~1.0 mg/L BA + 0.01~0.5 mg/L IBA + 0.^ 0.5mg/L GA3 + 30 g/L薦糖 不定芽诱导培养基设置为包含有:MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5mg/L NAA + 10 g/l~50 g/L山梨糖醇； 幼苗生根培养基设置为包含有:改良MS(MSl) + 0.1~2 mg/L IBA + 20 g/L薦糖。4. 根据权利要求3所述的用于苹果抗寒矮化化木离体叶片产生不定芽的培养基，其特 征是:MS(Murashige and Skoog)培养基组成：5. 根据权利要求3所述的用于苹果抗寒矮化化木离体叶片产生不定芽的培养基，其特 征是:改良MS即MS1:对MS中无机成分的大量元素进行改良，其他成分不变，改良如下： 大量元素 工作浓度(mg/L) NH4N03 825 KN03 950 K 出 P04 170 MgS04 ? 7肥O 370 CaCl2 ? 2肥O 440O6. 根据权利要求3所述的用于苹果抗寒矮化化木离体叶片产生不定芽的培养基，其特 征是:WPM培养基组成：植物生长调节物质：6 -苄基氨基嚷岭(BA )，嚷苯隆（TDZ )，吗I噪下烟酸（I BA )，糞乙烟 酸(NAA)，赤霉素(GA3)， 碳源:薦糖，山梨糖醇， 无离子水， 琼脂粉。7. -种用于苹果抗寒矮化化木离体叶片产生不定芽的培养方法，其步骤是： 选择编号为'GM310'的苹果抗寒矮化化木为技术客体并且建立'GM310'的离体叶片产 生不定芽的培养方法， a、蔽芽萌发启动培养:从果园种植的苹果抗寒矮化化木'GM310'的小树上剪取当年生 半木质化枝条，剪掉叶片后把枝条带回实验室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植体先用洗衣 粉水清洗，而后放自来水流水冲洗30分钟W上，把材料取出放入超净台上的无菌烧杯内，加 入次氯烟酸钢其中有效氯为5%的溶液，杀菌8分钟，期间摇动3~5次，倒出次氯烟酸钢用无 菌水洗4~6次，把芽段接种到装有蔽芽萌发启动培养基:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L薦糖的培养瓶内，把培养瓶置培养室内培养实现蔽芽萌发启动培养和无菌试管苗 建立的技术目的； b、绿苗培养：启动培养基上萌发生长获得的绿苗即无菌苗，转移到绿苗增殖培养基： WPM + 0.5~1.0 mg/L BA + 0.01 ~0.5 mg/L IBA + 0.1 ~0.5mg/L GA3 + 30 g/L薦糖上进 行增殖快繁，把培养瓶置培养室内培养实现绿苗培养和试管苗增殖的技术目的； C、不定芽培养:试管苗继代增殖培养基生长至4~5周时，取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶 片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切3~6刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个 带多个切口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，不定芽诱导培养基为:MS + 0.^4 mg/L TDZ + 0.^0.5mg/L NAA + 10 g/l~50 g/L山梨糖醇;在培养室中培养实 现离体叶片不定芽诱导培养的技术目的； d、幼苗生根培养:切取生长高度在1.5厘米W上的试管苗转移到幼苗生根培养基：改 良MS(MSl) + 0.1~2 mg/L IBA + 20 g/L薦糖上进行生根培养，培养条件为先连续暗培养 7天，然后转到16小时光周期培养条件下培养，在培养室中培养实现幼苗培养和试管苗生根 的技术目的。8. 根据权利要求5所述的用于果树离体叶片产生不定芽的培养方法，其特征是:所有培 养基在灭菌前调抑值到5.8,然后在12rC，l个大气压下高压灭菌20分钟，培养室培养溫度 为25 ± 2°C，光照周期为16小时/天。9. 根据权利要求5所述的用于苹果抗寒矮化化木离体叶片产生不定芽的培养方法，其 据佈是：MS(Murashiee and Skooe)睹莱其纽成：改良MS即MSI:对MS中无机成分的大量元素进行改良，其他成分不变，改良如下： 大量元素 工作浓度(mg/L) NH4N03 825 KN03 950 K 出 P04 170 MgS04 ? 7肥O 370 CaCl2 ? 2肥O 440 WPM惊棠其细成.植物生长调节物质：6 -苄基氨基嘴吟（BA )，曜苯隆（TDZ )，呀噪T烟酸（I BA )，蒙己烟 酸(NAA)，赤霉素(GA3)， 碳源:薦糖，山梨糖醇， 无离子水， 琼脂粉。10.根据权利要求7所述的用于苹果抗寒矮化化木离体叶片产生不定芽的培养方法，其 特征是:苹果优良抗寒矮化化木' GM310 '。
【文档编号】A01H4/00GK105900836SQ201610252781
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】孙清荣, 孙洪雁, 陶吉寒, 辛力, 李林光
【申请人】山东省果树研究所