专利名称：一种解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法
技术领域：
本发明属于作物遗传育种技术领域，具体涉及一种解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法。
背景技术：
大豆{Glycine max L. Merrill)是属于豆科、蝶形花亚科、大豆属的二倍体(2n=40)植物。它起源于中国，后相继传入日本、欧洲、美国等地。它是人类主要植物性蛋白质来源之一，又是重要的家畜饲料和许多工业的原料，在医学上也有很大价值。因而是一种非常重要的农作物。当生物学进入分子生物学时代以后，有关大豆的科学研究也进入快速发展的时期，尤其大豆的基因工程研究工作给生产上带来了巨大的经济效益。
植物遗传转化是一种重要和先进的育种技术，利用遗传转化技术已经培育出了抗除草剂的大豆品种，在几个大豆主产国的生产上得到了大面积的推广。目前，植物遗传转化的技术已经基本成熟，而最为通常的转化是应用农杆菌介导法将外源基因导入到受体植物的细胞并整合到染色体基因组中以实现外源基因稳定的遗传。由于在遗传转化过程中同时还需要应用培养基培养诱导转化的细胞再生成为芽体，而农杆菌在完成转化后不能够从转化系统中被清除掉，因此需要在完成转化后的植物培养基中添加抗生素以抑制农杆菌的增殖，避免转化的细胞由于农杆菌的过旺增殖而腐烂死亡。然而，抗生素除了能够抑制农杆菌的增殖外，在大豆的组织培养系统中，抗生素的添加还严重地抑制了大豆芽条的生根，导致大豆在遗传转化处理后很难得到能够栽培成活的完整植株。大豆芽条在含有抗生素的培养基中难以生根成了大豆遗传转化工作效率很低的一个重要原因。目前关于大豆嫁接技术的研究仅有极少数报道，申请号为200610017107.2的发明专利“应用嫁接技术提高转基因大豆的遗传转化效率的方法”，通过农杆菌介导大豆子叶节转化系统和胚尖转化系统获得的不定芽，不定芽不经过生根、炼苗过程，直接作成接穗，采用劈接的方法嫁接到大豆实生苗砧木上。该嫁接过程属于常规嫁接(非无菌嫁接)。另外，上述嫁接切口是在砧木子叶节以上的上胚轴。嫁接切口在上胚轴，由于有两片子叶，嫁接操作麻烦；移栽田间后，砧木子叶腋芽会长出第一对侧芽，由于此处具有分化原基，去除侧芽后还会不断再长，因此需经常去侧芽，增加了工作量，并且还会影响接穗的生长和结果。
发明内容
针对现有技术中大豆转化不定芽条生根难、移栽成活率低的不足以及上述现有大豆嫁接技术中存在的缺陷和不足，本发明提供了一种大豆不定芽条的无菌嫁接方法，解决了现有技术中导致大豆在遗传转化处理后很难得到能够栽培成活的完整植株的技术难题。本发明的目的通过以下技术方案予以实现
本发明将无菌萌发的大豆幼苗的下胚轴作为嫁接用的砧木，将经过遗传转化的大豆芽条作为接穗，嫁接到砧木上，接穗芽条利用下胚轴下方的胚根而不需要重新形成根系，嫁接时在无菌条件下进行，不需要繁琐的捆绑固定接穗和砧木操作。接穗芽条经过嫁接后能够和砧木愈合成为一棵完整和能够移栽成活的植株，能够正常地生长发育、开花和结实，其嫁接苗成活率为100 %。具体地，本发明提供一种解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法，包括以下步骤
Ca)将经过常规农杆菌介导的遗传转化处理和筛选的大豆芽条从母体上分割开，作为接穗；
(b)大豆种子经常规方法灭菌后接种到培养基上，25°C黑暗培养，取31天龄小苗，在子叶下方5mm处横切，弃除上方的子叶和上 胚轴，得到带有胚根的下胚轴，作为砧木；
其中所述培养基为含有(T2mg/L BA (苄氨基腺嘌呤)的MSB5培养基，包括MS配方的无机成分+B5配方的有机成分+25 g/L鹿糖+100 mg/L肌醇+300 mg/L蛋白胨+7 g/L琼月旨，ρΗ5· 8 6. O。培养基在121 °C、0. I MPa的条件下灭菌20分钟；
(c)在无菌条件下，将步骤(a)获得的接穗嫁接到步骤(b)获得的砧木上；
Cd)将嫁接有接穗的砧木转移到与步骤(b)相同成分的培养基上，光照培养；
(e)待接穗和砧木接口愈合，接穗芽条有明显的伸长生长后，取出嫁接苗，进行栽种。在优选的实施方式中，所述步骤(b)中培养基为无激素的MSB5培养基。在优选的实施方式中，所述步骤(b)中小苗的苗龄为5天。在优选的实施方式中，所述步骤(b)横切位置应在子叶下方5mm左右处。 在优选的实施方式中，步骤(c)所述嫁接可以采用插接法或者劈接法
(Cl)插接法在下胚轴切口中央挖一 5毫米深小孔，刮掉芽条的茎基部的表皮，然后插到小孔中完成嫁接；
(c2)劈接法在砧木形态学上端横切面的中部竖着向下切出深O. 5厘米的切口，把芽条基部切成“V”型，小心插入砧木切口中完成嫁接。本发明的有益效果是
本发明创造性地设计将无菌萌发的大豆幼苗的下胚轴作为嫁接用的砧木，将经过遗传转化的大豆芽条作为接穗，嫁接到砧木上，通过一种无菌嫁接的方法客服现有技术中大豆转化不定芽条生根难、移栽成活率低的不足。接穗芽条利用下胚轴下方的胚根而不需要重新形成根系，嫁接时在无菌条件下进行，不需要繁琐的捆绑固定接穗和砧木操作。接穗芽条经过嫁接后能够和砧木愈合成为一棵完整和能够移栽成活的植株，能够正常地生长发育、开花和结实，其嫁接苗成活率为100 %，有效解决了现有大豆转化不定芽条难以生根的技术难题，克服了嫁接成活率低的技术缺陷。
图I插接法砧木(左)和接穗(右)
图2插接法嫁接完成时的情况
图3劈接法砧木(左)和接穗(右)
图4劈接法嫁接完成时的情况 图5嫁接后开始培养的情况 图6嫁接后培养20天的情况 图7嫁接苗移栽成活的情况
具体实施例方式 下面结合附图和具体实施例以及比较实施例进一步详细说明本发明。实施例I
(a)用锋利的小刀将经过常规农杆菌介导的遗传转化处理和筛选的大豆芽条从母体上分割开O. 7cm，然后再轻轻刮去芽条的茎的基部的表皮，作为接穗，如附图I右；
(b)选取干净饱满的成熟大豆种子，经常规灭菌后接种到不含激素MSB5的培养基上，25 °C黑暗培养，分别取5天龄小苗，在子叶下方5mm处横切，弃除上方的子叶和上胚轴，得到带有胚根的下胚轴，作为砧木，如图I左。所述不含激素MSB5的培养基组成为MS配方的无机成分+B5配方的有机成分+25 g/L鹿糖+100 mg/L肌醇+300 mg/L蛋白胨+7 g/L琼脂，pH 6. O ； (c)用合适粗细的针状物(牙签、竹签、针等)垂直插入下胚轴切口中央5毫米后拔出，然后小心将上述接穗准确稳妥地插入到针状物拔出后产生的小孔中，完成嫁接，见附图2所示；
(d)用镊子夹住已经嫁接有接穗的砧木下胚轴，小心地将胚根朝下转移到不含激素的MSB5培养基上(同步骤(b))，用镊子夹住下胚轴根茎处往下轻压稍作固定，在光照时间每天12小时的组织培养室内条件下培养；
(e)待接穗和砧木接口愈合，接穗芽条有明显的伸长生长后，即可将嫁接苗取出培养瓶，洗净根上的培养基后，即可栽种到干净的细砂基质中，并在栽种的早期进行常规方法的组培苗保湿。实施例2
(a)用锋利的小刀将经过常规农杆菌介导的遗传转化处理和筛选的大豆芽条从母体上分割开O. 7cm,将芽条基部切成“V”型，作为接穗，如附图3右所示；
(b)选取干净饱满的成熟大豆种子，经常规灭菌后接种到不含激素的MSB5培养基上，25°C黑暗培养，分别取5天龄小苗，在子叶下方5mm处横切，弃除上方的子叶和上胚轴，得到带有胚根的下胚轴，作为砧木，如附图3左所示；所述不含激素MSB5的培养基组成为MS配方的无机成分+B5配方的有机成分+25 g/L鹿糖+100 mg/L肌醇+300 mg/L蛋白胨+7 g/L 琼脂，pH 6. O ；
(c)用解剖刀在砧木形态学上端横切面的中部竖着向下切O.5厘米，再把所述接穗小心插入站'木切口中完成嫁接，如附图4所不；
Cd)用镊子夹住已经嫁接有接穗的砧木下胚轴，小心地将胚根朝下转移到不含激素的MSB5培养基上，用镊子夹住下胚轴根茎处往下轻压稍作固定，在光照时间每天12小时的组织培养室内条件下培养；
(e)待接穗和砧木接口愈合，接穗芽条有明显的伸长生长后，即可将嫁接苗取出培养瓶，洗净根上的培养基后，即可栽种到干净的细砂基质中，并在栽种的早期进行常规方法的组培苗保湿。下表I给出了实施例f 2两种方法获得的嫁接苗生长情况结果，
表I插接法和劈接法的嫁接效果比较
嫁接方法I嫁接成活率/% I苗高增加量/m I根数增加量/条I根长增加量/Cm I鲜重增加量/g插接法 IlOO|o. 80|θ8|l3. 77|θ· 5权利要求
1.一种解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法，其特征在于包括如下步骤 Ca)将经过常规遗传转化处理和筛选的大豆芽条从母体上分割开，作为接穗； (b)大豆种子经常规方法灭菌后接种到培养基上，25°C黑暗培养，取:Γ8天龄小苗，在子叶下方5mm处横切，弃除上方的子叶和上胚轴，得到带有胚根的下胚轴，作为砧木； 其中所述培养基为含有(T2mg/L BA的MSB5培养基； (c)在无菌条件下，将步骤(a)获得的接穗嫁接到步骤(b)获得的砧木上； Cd)将嫁接有接穗的砧木转移到与步骤(b)相同组成的培养基上，光照培养； (e)待接穗和砧木接口愈合，接穗芽条有明显的伸长生长后，取出嫁接苗，进行栽种。
2.如权利要求I所述的解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法，其特征在于步骤(b)所述MSB5培养基含有Omg/L的BA。
3.如权利要求I所述的解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法，其特征在于步骤(b)所述小苗的苗龄为5天。
4.如权利要求I所述的解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法，其特征在于步骤(c)所述嫁接是采用插接法，在下胚轴切口中央挖一小孔，所述小孔深5毫米；刮掉芽条的基部的表皮，然后插到小孔中完成嫁接。
5.如权利要求I所述的解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法，其特征在于步骤(c )所述嫁接是采用劈接法，在砧木形态学上端横切面的中部竖着向下切出切口，所述切口深O. 5厘米，把芽条基部切成“V”型，插入砧木切口中完成嫁接。
全文摘要
本发明公开了一种解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法。本发明以无菌萌发的大豆幼苗的下胚轴作为砧木，将经过遗传转化的大豆芽条作为接穗嫁接到砧木上，接穗芽条利用下胚轴下方的胚根而不需要重新形成根系，嫁接时在无菌条件下进行，不需要繁琐的捆绑固定接穗和砧木操作，接穗芽条经过嫁接后能够和砧木愈合成为一棵完整和能够移栽成活的植株，能够正常地生长发育、开花和结实，其嫁接苗成活率为100%，有效解决了大豆转化不定芽条难以生根的技术难题。
文档编号A01H4/00GK102870604SQ20121036858
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者杨跃生, 刘颖, 于磊, 金亚红, 郭振飞, 年海 申请人:华南农业大学