一种东方百合的繁殖方法
【专利摘要】本发明公开了一种东方百合的繁殖方法，即以东方百合的花丝为外植体，经消毒，愈伤组织诱导，不定芽的诱导，不定芽的增殖，不定芽的诱导生根，组培苗的炼苗和移栽等环节直至形成苗的过程。本法对于降低东方百合生产成本，提高百合品质具有巨大价值。本法涉及到东方百合外植体和消毒方法的选择，植物激素的选择，愈伤组织的诱导条件的优化，不定芽诱导和增殖条件的优化，生根培养条件的优化，以及炼苗和移栽等条件的优化。本法具有外植体消毒方法简单易行，外植体培养条件宽泛，培养难度低，组培苗成活率高的特点，是一种简单高效的东方百合快速繁殖方法。
【专利说明】一种东方百合的繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物【技术领域】，具体涉及到一种东方百合外植体消毒方法，组织 培养及植株再生过程即一种东方百合的繁殖方法。
【背景技术】
[0002] 百合是市场上最畅销的花卉之一，东方百合因花色丰富，香气宜人，姿态优雅，寓 意丰富，花朵保质期长而深受人们的喜爱。百合通常采用营养繁殖的方法，比如使用鳞茎及 鳞片、株芽、茎等来繁殖，然而这些方法都会导致品种的严重退化，抗病性变差。解决这一问 题最佳方法是采用植物组织培养技术，获得性状稳定的脱毒苗。
[0003] 建立无菌培养体系是植物组织培养的第一步，通常采用的方法是使用乙醇、H20 2、 NaCIO、CaCIO、HgCl2等表面消毒剂来处理外植体，然后再接种到培养基中进行培养。但是 外植体长期与外界接触，不可避免地带有微生物，尤其是对于百合而言，其生长周期较长， 消毒起来比较费力。而且百合主要通过鳞茎来繁殖，鳞茎在土壤中生长，带有的病毒和病 菌更多。在实验中，课题组发现百合鳞茎使用0. 1% HgCl2消毒15min后，污染率达80%左 右。另外，上面提及的化学消毒试剂在使用时应特别注意，重金属汞会对操作人员和环境造 成伤害，NaClO和CaClO能够产生氯气等毒性高的物质。
[0004] 外植体的选择对于植物再生体系的建立也十分关键。由外植体到植株再生一般 通过体细胞胚途径、愈伤组织和不定芽途径，只有选择合适的外植体才能够形成体细胞胚、 愈伤组织或不定芽。百合植株再生过程中常常使用鳞茎、叶片作为外植体。比如付文奇等 (NAA和2, 4-D对东方百合组织培养的影响.西北林学院学报，2008. 23 (2) :p. 83-86)使用 鳞片为外植体，建立了东方百合"蒂伯"小鳞茎培养体系。张文种等人（不同激素配比对 麝香百合鳞茎芽诱导的影响.亚热带植物科学，2002. 31 (I) :p. 21-24)也使用鳞茎成功诱 导出麝香百合小鳞茎。还有赵庆芳等（东方百合组织培养和快速繁殖研究.西北师范大 学学报（自然科学版），2003. 39(1) :p. 66-6)建立东方百合快速无性繁殖系也是通过鳞茎 诱导出不定芽实现的。还有一些文献报道，通过叶片成功建立百合再生体系。如袁芳亭等 (麝香百合的叶片离体培养及植株再生.湖北农业科学，2001 (3) :p. 50-51)取麝香百合带 芽的幼嫩叶片，在NAA LOmg I^+e-BA 0. Img I71诱导下生长出愈伤组织，再由愈伤组织诱 导不定芽。孟芮等（百合遗传转化受体系统的建立.西北农林科技大学学报（自然科学 版），2006. 34(4) :p. 32-38)在建立东方百合"索邦"再生体系时使用叶片作为外植体。这 些研究虽然都成功建立了百合再生体系，但是由于鳞片、叶片等并不能实现脱除病毒，还有 上面提及的消毒过程繁琐，一定程度上增加了技术难度。因此有研究人员提出使用生长速 度快的组织作为外植体，如茎尖和花部组织。
[0005] 花部组织作为外植体的诱导在于其在环境中暴露的时间短，消毒相对简单。 许洁婷等（麝香百合花部组织离体培养与植株再生.上海交通大学学报（农业科学 版），2008. 26 (I) :p. 13-16)比较了麝香百合花部组织诱导愈伤的效果，结果说明，诱导愈 伤组织的能力由强到弱依次为花丝〉花托〉花梗〉花柱〉花瓣。但是一般认为外植体的分 化程度越高其脱分化的能力就越弱，所以，如何使花部组织脱分化，对于东方百合的快速繁 殖而言显得十分重要。植物激素，尤其是生长素和细胞分裂素的比例对于体细胞胚的形成、 愈伤和不定芽的诱导具有决定性作用，它们的使用浓度精确到mg/L，使用时必须精确添加， 否则结果将差距巨大。所以找到合适的激素及其使用浓度，是植物实现快速繁殖的关键。
[0006] 植物快速繁殖的最后一步是生根和移栽。不定芽生根后或体细胞胚发育成熟后， 就可以进行生根和移栽了。组培苗长期生长在高湿度、稳定恒定、光照柔和的环境中，需要 一个适应的过程，需要对组培苗进行驯化，培养基质配比条件进行探索。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术的上述不足，提供一种不会对人体和环境造成伤害的灭菌方 法，选用的外植体易于脱除病毒、取材方便，且经过试验优化的植物激素种类及其使用浓度 能对愈伤组织诱导，不定芽的形成以及生根等具有决定性作用的东方百合的繁殖方法。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种东方百合的繁殖方法，该 方法包括以下环节：以东方百合的花丝为外植体，经消毒，愈伤组织诱导，不定芽的诱导，不 定芽的增殖，不定芽的诱导生根，组培苗的炼苗和移栽直至形成苗。
[0009] 本发明上述以东方百合的花丝为外植体，经消毒具体为：取东方百合尚未开放的 花苞去其花苞外侧的叶片、留少许叶柄（叶柄长度不超过5mm)，先用体积浓度为70-80% 的酒精把花苞的表面擦拭2-3次，然后放在酒精灯的外焰上灼烧5-10min，灼烧时要均匀受 热，且叶柄和叶片缝隙内要着重灼烧；然后剥去花苞，露出花苞内部花药和花丝等部位，将 花丝切成〇. 5-1. 5cm长的小段备用。
[0010] 本发明上述的愈伤组织诱导，具体为：先配制愈伤组织诱导培养基并高压灭菌， 待培养基凝固后将消毒后的花丝横着接种在培养基中，于22-25°C，光照强度1000? 20001ux，持续光照时间8?12小时条件下培养6-10周的时间，花丝切口形成明显的凸起， 即愈伤组织；愈伤组织诱导培养基为：在MS培养基中添加毒莠定0. 6?5mg I71，蔗糖3% (质量百分比），琼脂0.6% (质量百分比）。
[0011] 本发明上述的不定芽的诱导，具体为：将花丝形成的愈伤组织切成〇. 3-0. 7cm直 径大小的小块（可以理解为边长为0. 3-0. 7cm的方块）接种在灭菌的添加了 I. Omg I/1的 6_苄氨基腺嘌呤（6-861^71&1^11〇?111^116,6-84)1^培养基中，其中6-84在高压灭菌前加入 ； 然后于22-25°C，光照强度1000?20001ux，光照时间8?12小时条件下培养5-7周，愈伤 组织上形成不定芽，不定芽进一步发育形成小鳞茎。
[0012] 本发明上述的不定芽的增殖，具体为：将小鳞茎切成0. 5cmX0. 5cm大小的小片， 置于高压灭菌的添加了 〇? SmgL-1的6-BA和0? 2mg L-1的a -萘乙酸（NAA，1-naphthlcetic acid)的MS培养基中，6-BA和NAA均在高压灭菌前加入；然后于22-25°C，光照强度1000? 20001ux，光照时间8?12小时条件下培养3-5周，小鳞茎上出现丛状得不定芽的形成。
[0013] 本发明上述的不定芽的诱导生根，具体为：将诱导出的呈丛状的不定芽分割为单 株，然后转入生根培养基中，生根培养基采用低盐培养基，具体做法是将MS培养中的大量 元素减半，其它的成分不变，具体生根培养为在加入了 〇. Img Pa-萘乙酸和0. Olmg I71吲 哚丁酸（3-Indolebutyric acid，IBA)中1/2MS培养基中放置12-16天即可生根，生根率可 达90 以上，根系健壮。
[0014] 本发明上述的组培苗的炼苗和移栽直至形成苗，具体为：将装有组培苗即诱导生 根的不定芽的组培瓶打开一个缝隙，置于温室大棚中进行炼苗，并向组培瓶中倒入无菌水 以防止植株失水为限，控制湿度在75-85%，避免强光直射，炼苗6-8天；6-8天后将苗取出 (组培苗根长到I. 5-2. 5cm)，用无菌水冲掉粘在苗上的培养基后，分别移入经高压灭菌锅 灭菌的珍珠岩和蛭石体积之比为1:1的基质中，保持75%的湿度，50%的自然光照，8-12天 喷一次稀释10倍的MS营养液，培养成幼苗；移栽成活率可达90%以上。
[0015] 本发明上述的高压灭菌为121°C、103. 4kPa下，高压灭菌20min。
[0016] 上述添加到培养基中的各组分的量，均是以最终在配制好的培养基中的浓度或用 量。
[0017] 本发明的优点和有益效果：
[0018] 1.本发明首次以东方百合的花丝作为外植体具有易于诱导，取材方便的特点，并 结合酒精灼烧消毒的方法，克服了现有百合再生体系选用鳞片、叶片等脱除病毒困难、消毒 过程繁琐、技术难度大的不足，并且提高了生长速度。同时，酒精灼烧的组织灭菌方法避免 了使用NaCIO、HgCl 2、H2O2等组织培养过程中常用的外植体消毒剂对人体和环境造成的伤 害，而且操作极为简单，整个过程不超过lOmin，无菌外植体可达95%以上，灭菌简单。
[0019] 2.本发明实现了对优选外植体的培养，成功诱导出愈伤组织，这种愈伤组织的形 式是实现东方百合植株再生关键步骤；本发明严格控制了能够使这种愈伤组织诱导出不 定芽的植物激素种类及浓度，而且植物激素使用浓度较为宽泛，实践操作性强，具体配方为 MS+毒赛定0? 6?5mg L L
[0020] 3.本发明实现了对不定芽的诱导培养条件的筛选，花丝形成的愈伤组织在优选的 培养基中能够形成不定芽，成功率可达70%左右，具体培养基为MS+6-BA LOmg L'
[0021] 4.本发明实现了不定芽的增殖培养，上述愈伤组织形成不定芽后能够进一步长出 小鳞茎，小鳞茎在MS+6-BA0. emgl^+NAA 0. 2mg I71中可以诱导出不定芽，平均每个外植体 可形成4. 28个不定芽。
[0022] 5.本发明实现了对不定芽的生根培养，完成了东方百合由芽到植株的再生过程。 在生根培养基1/2MS+NAA 0. Img P+IBA 0. Olmg I/1中，不定芽的生根率可达95%。
[0023] 6.本发明实现了上述有根组培苗的移栽，将组培苗从组培瓶中移出，需要优化生 长条件才能在室外存活，使用优化的炼苗方法，优化的比例为珍珠岩和蛭石比例为1:1，，以 及合适的管理方法，成活率达90%以上。
【专利附图】
【附图说明】：
[0024] 图1花丝外植体诱导愈伤组织（早期）
[0025] 图2花丝外植体诱导愈伤组织（后期）
[0026] 图3愈伤组织诱导形成不定芽
[0027] 图4不定芽的增殖培养
[0028] 图5不定芽的生根培养
[0029] 图6不定芽移栽
【具体实施方式】：
[0030] 下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。
[0031] 实施例1外植体消毒方法
[0032] 取市售东方百合尚未开放的花苞去其叶片，留少许叶柄，先用75%的酒精把外植 体的表面擦拭两次，然后手拿叶柄部分放在酒精灯的外焰上灼烧5-10min，灼烧时要均匀受 热，且叶柄和叶片缝隙内要着重灼烧。然后剥去叶片，露出花药和花丝等部位，将花丝切成 Icm长左右的小段备用。
[0033] 实施例2花丝愈伤组织的诱导
[0034] 先配制MS培养基，具体方法如下，按照附表1的配方，将大量元素配制成20倍母 液，其它按成分配制成微量元素、铁盐、有机成分200倍母液。配成IL培养基分别取上述母 液50mL、5mL、5mL、5mL，混合后加入500mL蒸馈水和6g琼脂粉，加热充分溶解，最后加入30g 蔗糖，加水定容至1L，调pH值至6. 5左右，分装至组培瓶中。于121°C、103. 4kPa下，高压 灭菌20min(培养基配制和灭菌方法下同），冷却到50°C左右，向培养基中加入毒莠定至终 浓度2mg I71，待培养基凝固后，将花丝横着接种在培养基中，于22-25°C，光照强度1000? 20001ux，光照时间8?12小时条件下培养。诱导8周左右时间，花丝切口会形成明显的凸 起，即愈伤组织。
[0035] 实施例3愈伤组织诱导不定芽
[0036] 花丝形成愈伤组织后，将愈伤组织切成0.5cm直径大小的小块接种在灭菌的 MS+6-BA I. Omg L-1培养基中，其中6-BA在高压灭菌前加入；于22-25°C，光照强度1000? 20001UX，光照时间8?12小时条件下培养6周，可见愈伤组织上形成不定芽，不定芽可进 一步发育形成小鳞茎。
[0037] 实施例4不定芽的增殖
[0038] 将小鱗莖切成0? 5cmX0. 5cm大小的小片，置于高压灭菌的MS+6-BA 0? 6mgL i+NAA 0. 2mg L' 6-BA和NAA均在高压灭菌前加入。于22-25°C，光照强度1000?20001ux，光照 时间8?12小时条件下培养4周左右小鳞茎上可见不定芽的形成。
[0039] 实施例5不定芽的诱导生根
[0040] 诱导出的不定芽呈丛状，将丛生芽分割为单株，转入生根培养基中，生根培养采 用低盐培养基，具体做法是将MS培养中的大量元素减半，其它的成分不变。在培养基 1/2MS+NAA 0. Img P+IBA 0. Olmg I71中15d即可生根，生根率可达90%以上，根系健壮。
[0041] 实施例6组培苗的炼苗和移栽
[0042] 组培苗根长到2cm左右即可移栽。稍稍打开组培瓶，置于温室大棚中进行炼苗，并 向组培瓶中倒入少量无菌水防止植株失水，控制湿度在80%左右，避免强光直射，炼苗7d。 7d后将苗取出，用无菌水冲掉粘在苗上的培养基后，分别移入经高压灭菌锅灭菌的珍珠岩 和蛭石体积之比为1:1的基质中，保持75 %的湿度，50 %的自然光照，IOd左右喷一次稀释 10倍的MS营养液，移栽成活率可达90%以上。
[0043] 表I MS培养基母液的配制
[0044]
【权利要求】
1. 一种东方百合的繁殖方法，其特征在于，该方法包括：以东方百合的花丝为外植体， 经消毒，愈伤组织诱导，不定芽的诱导，不定芽的增殖，不定芽的诱导生根，组培苗的炼苗和 移栽直至形成苗。
2. 根据权利要求1所述东方百合的繁殖方法，其特征在于，所述的以东方百合的花丝 为外植体，经消毒具体为：取东方百合尚未开放的花苞去其叶片、留少许叶柄，先用体积浓 度为70-80%的酒精把花苞的表面擦拭2-3次，然后放在酒精灯的外焰上灼烧5-10min ;然 后剥去花苞露出内部的花药和花丝部位，将花丝切成0. 5-1. 5cm长的小段备用。
3. 根据权利要求2所述东方百合的繁殖方法，其特征在于，所述的愈伤组织诱导，具体 为：先配制愈伤组织诱导培养基，再对培养基进行高压灭菌，待培养基凝固后将消毒后的花 丝接种在培养基中，于22-25°C，光照强度1000?20001ux，持续光照时间8?12小时条件 下培养6-10周的时间，花丝切口形成明显的凸起即愈伤组织；愈伤组织诱导培养基为：在 MS培养基中添加毒莠定0. 6?5mg I71，蔗糖3 %，琼脂0. 6 %。
4. 根据权利要求3所述东方百合的繁殖方法，其特征在于，所述的不定芽的诱导，具体 为：将花丝形成的愈伤组织切成〇. 3-0. 7cm长度的小块接种在高压灭菌的、添加了 I. Omg P的6-苄氨基腺嘌呤的MS培养基中，其中6-苄氨基腺嘌呤在高压灭菌前加入；然后于 22-25°C，光照强度1000?20001ux，光照时间8?12小时条件下培养5-7周，愈伤组织上 形成不定芽，不定芽进一步发育形成小鳞茎。
5. 根据权利要求4所述东方百合的繁殖方法，其特征在于，所述的不定芽的增殖，具体 为：将小鳞茎切成0. 5cmX0. 5cm大小的小片，置于高压灭菌的添加了 0. emgr1的6-苄氨基 腺嘌呤和0. 2mg I71的a -萘乙酸的MS培养基中，6-苄氨基腺嘌呤和a -萘乙酸均在高压 灭菌前加入；然后于22-25°C，光照强度1000?20001uX，光照时间8?12小时条件下培养 3-5周，小鳞茎上出现呈丛状的不定芽。
6. 根据权利要求5所述东方百合的繁殖方法，其特征在于，所述的不定芽的诱导生根， 具体为：将诱导出的呈丛状的不定芽分割为单株，然后转入生根培养基中，生根培养基采用 低盐培养基即是将MS培养中的元素减半，具体生根培养为在加入了 0. Img I/1 a-萘乙酸和 0. Olmg I71吲哚丁酸中1/2MS培养基中放置12-16天即可生根。
7. 根据权利要求6所述东方百合的繁殖方法，其特征在于，所述的组培苗的炼苗和移 栽直至形成苗，具体为：将装有组培苗即诱导生根后的不定芽的组培瓶打开一个缝隙，置于 温室大棚中进行炼苗，并向组培瓶中倒入无菌水以防止植株失水，控制湿度在75-85%，避 免强光直射，炼苗6-8天；6-8天后将苗取出，用无菌水冲掉粘在苗上的培养基后，分别移入 经高压灭菌锅灭菌的珍珠岩和蛭石体积之比为1:1的基质中，保持75%的湿度，50%的自 然光照，8-12天喷一次稀释10倍的MS营养液，培养成幼苗。
【文档编号】A01H4/00GK104304030SQ201410607072
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】胡正峰, 张科锋, 靳慧霞, 张会宁, 甘慧慧, 吕慧捷, 张东霞, 陈靳曦 申请人:浙江大学宁波理工学院