一种快速获得大豆转基因愈伤组织的转化方法

专利名称：：一种快速获得大豆转基因愈伤组织的转化方法一种快速获得大豆转基因愈伤组织的转化方法
技术领域：
：本发明属于植物基因工程
技术领域：
，具体说是建立了一种简单、快速、高效地获得大豆转基因愈伤组织的方法，该方法在大豆生物技术相关领域包括功能蛋白的定位、启动子活性的检测、大豆基因工程、细胞工程、代谢工程以及大豆遗传转化体系的建立等方面有广泛的应用价值。
背景技术：
：:大豆(GlycinemaxL.)起源于我国，栽培历史悠久，是人类主要植物性蛋白质来源之一，又是重要的家畜饲料和许多工业的原料，在医学上也有很大价值，因而是一种非常重要的农作物。大豆的生产容易受到各种环境因素的影响，因此产量很不稳定，常规育种技术由于受到物种杂交不亲和性以及不良基因性状连锁等因素的影响，在引入其他物种优良基因的同时也带入了许多不良的基因，因而很难进一步利用。而利用大豆转基因技术可以定向培育大豆优良品种，并将对大豆产量的提高和品质的改良起到重大的推动作用。自Hinchee等(1988)和McCabe(1988)分别用两种转化方法转化大豆成功得到转基因植株以来，虽然也相继有这方面的报告，但是大豆转化一直没有突破性的进展，具体来说就是转化效率低、操作流程繁琐，并且实验结果的重复性差。目前应用于大豆遗传转化的方法主要有根癌农杆菌介导法、基因枪法、真空抽滤法和花粉管导入法等，但其中获得较为广泛应用的只有根癌农杆菌介导法和基因枪法。农杆菌介导的大豆遗传转化与其它方法比起来具有经济、操作简单、能够准确、完整地将T-DNA以单拷贝或低拷贝的形式插入到受体基因组中等优点，因此仍然是大豆遗传转化的首选方法。利用农杆菌介导大豆遗传转化选用的外植体通常是分生能力较强，能够在分生区的细胞整合外源基因到受体细胞的染色体中，如子叶节、胚尖、下胚轴、萌动的子叶等外植体，以子叶节外植体进行转化是传统的方法，这一系统由Hinchee等利用Peking无菌苗子叶节为外植体首次获得大豆转基因植株，之后Olhoft等报告在共培养阶段添加L-半胱氨酸等抗氧化剂可以使转化率有显著的提高。近年来用成熟的大豆胚尖、下胚轴和萌动的子叶做外植体进行转化也有许多成功的报告。虽然大豆的遗传转化取得了一定的进展，但是利用这些外植体进行转化存在外植体的制备比较烦琐、转化植株中嵌合体较多、后期筛选的工作量大等诸多问题一直制约着转化效率的提高。植物的愈伤组织(callus)原指植物体的局部受到创伤剌激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。在组织培养中，将植物器官或组织(如芽、茎尖、根尖、下胚轴或花药)的一部分切下来，在无菌的条件下放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成一团没有分化的薄壁细胞，叫做愈伤组织。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期启动期、分裂期和分化期。启动期指细胞准备进行分裂的时期。外源植物生长激素对诱导细胞开始分裂效果很好。分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。分裂期的愈伤组织细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。分化期是指在分裂的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。愈伤组织在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。愈伤组织在快繁技术、单倍体育种以及人工种子的制备等有广泛的应用价值。随着生物技术的发展，基因工程给人类带来了许多社会和经济效益。许多研究者通过在植物细胞中转入外源基因来调控作物的农艺生产性状，进一步达到改善作物品质和提高产量的目的。如高越峰等(2001)将高赖氨酸蛋白基因转入水稻的愈伤组织通过再生获得了赖氨酸含量大大提高的转基因水稻植株；Fernandoetal.(2005)将crylC基因转入玉米幼胚愈伤组织获得了抗病性强的转基因玉米；邢莉萍等(2008)将小麦类甜蛋白基因转化小麦的愈伤组织获得了抗白粉病的转基因小麦植株。此外，通过转基因手段可以在愈伤组织中增强某种关键酶基因的表达水平来提高有用次生代谢产物的含量，如姜楠等(2009)通过农杆菌介导大豆子叶节细胞获得了异黄酮合成酶基因高表达的大豆转基因愈伤组织。在功能基因的研究中，利用转基因愈伤组织可以避免叶绿素自发荧光的干扰来研究目的基因编码蛋白的定位，如夏玉凤(2006)建立了一个可以利用烟草的转基因愈伤组织研究目的蛋白亚细胞定位的体系。目前，关于大豆转基因愈伤组织的转化体系的研究很少，在现有的几篇报道中都使用大豆无菌苗子叶节作外植体，外植体的制备繁琐，转化效率低，并且在转化的外植体只能诱导出一块独立的转基因愈伤组织。另外，以前的研究在外植体的取材上也仅仅限于国外几个比较容易转化的大豆品种，而利用转基因愈伤组织获得具有稳定遗传转化大豆植株的研究在国内外也属空白，因此在很大程度上制约着大豆基因工程的发展。而建立一个简单、快速、高效地获得转基因愈伤组织的转化体系，不仅对于大豆功能蛋白的定位、启动子活性的检测有重要的理论意义，而且对于大豆基因工程、细胞工程、代谢工程和高效大豆遗传转化体系的建立有重要的现实意义。
发明内容本发明目的是解决现有的获得大豆转基因愈伤组织的技术体系中，因外植体制备繁琐，转基因愈伤组织诱导效率低，外源基因难以转化大豆受体细胞以及转基因愈伤组织的纯合困难，使得转化工作强度大，实验流程长，并且获得的转化愈伤组织难以满足研究和应用的需求等问题，提供一种新的简单、快速、高效地获得大豆转基因愈伤组织的转化方法。本发明通过以下技术方案实现简单、快速、高效地获得大豆转基因愈伤组织，具体包括以下步骤第一步外植体的制备将成熟的大豆种子经过氯气熏蒸2.5-5小时后转于含有0.8-1.5mgL—16-BA的无菌水中，2『C黑暗条件下萌发10-18小时后去除种皮、子叶、原叶和胚根，剩余的下胚轴切段作为待转化的外植体。第二步农杆菌工程菌液的制备及浸染将含有外源基因的农杆菌LBA4404(农杆菌LBA4404购自中国科学研究院微生物研究所)单菌落接种于YEP液体培养基中，28t:、200rpm振荡12小时，然后以1/100的比例扩大培养，待菌液的浓度达到0D6。。=0.8时，4°C、4000rpm离心12分钟，收集菌体并重悬于液体浸染培养基中至0D6。。=0.5，将制备好的外植体浸泡于菌液中浸染30分钟。第三步外植体与农杆菌共培养外植体经过农杆菌浸染后用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，然后切口向下平铺于表面盖有无菌滤纸的半固体共培养基上，24t:黑暗条件下培养3天。第四步转基因愈伤组织的诱导将共培养3天的外植体切口向下转入转基因愈伤组织诱导培养基上，于25°C、光照强度100Em—2s—^光周期16h光/8h暗的条件下培养10天。第五步转基因愈伤组织的筛选及继代待转基因愈伤组织初步形成后，将其转入转基因愈伤组织筛选培养基上，两周后将其从外植体的两端切下，转入相同的转基因愈伤组织筛选培养基上继续筛选，以后每隔两周，便将形成的转基因愈伤组织切成2mm的小块，转入新鲜的转基因愈伤组织筛选培养基上继代培养一次来保持转基因愈伤组织的旺盛生长。在本发明中，所述的农杆菌浸染下胚轴切段使用的液体浸染培养基组分如下KN03250mgL—、CaCl22H2015mgL—、MgS047H2025mgL—、(NH4)2S0413.4mgL—工，NaH2P04H2015mgL—、KIO.075mgL—、H3B040.3mgL—、MnS044H201.OmgL—、ZnS047H200.2mgL—、Na2Mo。4*2H200.025mgL—、CoCl2*6H200.0025mgL—、CuS045H200.0025mgL—、Na2-EDTA3.73mgL—、FeS047H202.78mgL—、肌醇lOOmgL—、烟酸1.OmgL—、盐酸妣B多醇l.OmgL—、盐酸硫铵素10mgL一、蔗糖30gL—、MES0.6gL—、6-BA2.OmgL—、IBA0.2mgL-、乙酰丁香酮O.04gL—、pH5.4。所述农杆菌与外植体共培养的半固体共培养基组分如下KN03250mgL一1，CaCl2*2H2015mgL—、MgS。4*7H2025mgL—、(NH4)2S0413.4mgL—1，NaH2P04H2015mgL—、KI0.075mgL—、H3B040.3mgL—、MnS044H201.OmgL—、ZnS047H200.2mgL—、Na2Mo042H200.025mgL—、CoCl26H200.0025mgL—、CuS045H200.0025mgL—、Na2_EDTA3.73mgL—、FeS04*7H202.78mgL—、肌醇100mgL一、烟酸l.OmgL一1，盐酸吡眵醇1.OmgL—、盐酸硫铵素10mgL—、蔗糖30gL—、MES0.6gL—、6-BA2.OmgL—、IBA0.2mgL—、L_半胱氨酸0.4gL—、DTT0.15gL-、Na2S2030.25gL-、乙酰丁香酮0.04gL—、琼脂粉5gL-、pH5.4。所述的转基因愈伤组织诱导培养基为MS基本培养基+蔗糖30gL—^2，4-D2.OmgL—丄+6-BA0.5mgL—丄+MES0.6gL—丄+潮霉素10mgL—丄+琼脂粉7gL—、pH5.8。所述的转基因愈伤组织筛选培养基为MS基本培养基+蔗糖30gL—、2，4-D2.OmgL—^6-BA0.5mgL—一MES0.6gL—一潮霉素50mgL—,琼脂粉7gL—、pH5.8。本发明同时提供了用上述方法获得的大豆转基因愈伤组织在大豆生物技术相关领域包括功能蛋白的定位、启动子活性的检测、大豆基因工程、细胞工程、代谢工程以及大豆遗传转化体系的建立中的应用。例如在检测目的基因启动子活性的应用利用一个与大豆叶片衰老相关的类受体蛋白激酶基因(GmSARK)启动子与GUS报告基因构建获得"启动子_目的基因"的融合基因，将其转化大豆下胚轴切段外植体获得了在愈伤组织中GUS基因高表达的大豆GmSARK::GUS转基因愈伤组织。本发明的优点和积极效果本发明选用国内主栽的大豆优良品种"中黄13"的下胚轴切段为外植体，利用农杆菌介导的方法可以将外源基因整合到大豆受体细胞的基因组中，通过对转化细胞进行转基因愈伤组织的诱导和筛选，从而建立了一个简单、快速、高效地获得大豆转基因愈伤组织的转化体系。该转化体系适用于我国主栽大豆优良品种，打破了目前国内外在大豆转基因愈伤组织的转化研究中仅仅使用国外几个较容易转化的大豆品种的瓶颈；该转化体系的外植体制备比较简单，不需要转化前培养大豆无菌苗制备外植体，成熟的大豆种子在无菌水中浸泡10-18小时后就可以获得下胚轴切段外植体，并且不必对外植体做精细的伤口处理，因此要比传统的大豆转基因愈伤组织转化体系中所用的子叶节外植体的制备省时省力；利用该转化系统，转基因愈伤组织的转化效率高，通过对转基因愈伤组织GUS报告基因的检测统计外源基因转化效率高达87.7%，组织化学染色同时表明GUS报告基因在下胚轴切段外植体的上下两端能同时各自独立地诱导出转基因愈伤组织。因此该大豆转基因愈伤组织的转化方法具有较广泛的适用性和高效性。图1是大豆转基因愈伤组织的转化流程。(a)大豆下胚轴切段外植体的制备过程；(b)农杆菌浸染大豆下胚轴切段后外植体与农杆菌共培养；(c)外植体共培养后转入含有10mgL—^朝霉素的转基因愈伤组织诱导培养基；(d)转基因愈伤组织初步形成后转入含有50mgL—1潮霉素的转基因愈伤组织筛选培养基上筛选2周。图2是转基因愈伤组织在含有50mgL—1潮霉素的转基因愈伤组织筛选培养基上筛选2周后GUS的染色结果，左为对照(CK)，右为转基因愈伤组织(TR)。图3是将GmSARK::GUS融合基因转化大豆下胚轴切段诱导的转基因愈伤组织在转基因愈伤组织筛选培养基上筛选4周的GUS染色结果。(a)染色前的愈伤组织，左为对照(CK)，右为转基因愈伤组织(TR);(b)对应GUS染色后的愈伤组织，左为对照(CK)，右为转基因愈伤组织(TR)。具体实施方式实施例1:大豆转基因愈伤组织的获得1、大豆下胚轴切段外植体的制备挑选健康成熟的"中黄13"大豆种子，放入含有氯气(由10mlNaC10和1ml浓HCl反应生成)的密闭容器内熏蒸2.5-5小时(此范围内的具体时间变动对结果无显著影响)后浸泡于含有lmgL—16-BA(取0.8、1.5mgL—16_BA的浓度对结果无显著影响)的无菌水中，消毒好的大豆在28t:黑暗条件下萌发10-18小时(此范围内的具体时间变动对结果无显著影响)，用io号手术刀片去除种皮和一片子叶，然后去除另外一片子叶和原叶，最后切掉胚根(图la)，将制备好的外植体收集到一个含有少量无菌水的培养皿中待浸染。2、农杆菌工程菌液的制备及浸染从YEP固体培养基(见附录1)平板上用接种环挑取含有双元表达载体pCAMBIA1301(购自CAMBIA公司)质粒的农杆菌LBA4404(购自中国科学研究院微生物研究所)单菌落接种于5mlYEP液体培养基(见附录2)中[双元表达载体pCAMBIA1301转化农杆菌LBA4404参见IKfgen和Willmitzer(1988)的方法]，在28。C环境下200rpm振荡12小时。然后以1/100的比例第二次扩大培养，待菌液的浓度达到0D6。。=0.8时，4000rpm，4t:离心12分钟，收集菌体，重悬于液体浸染培养基LIM(见附录3)，然后将制备好的外植体浸泡于农杆菌菌液中30分钟。3、外植体与农杆菌共培养外植体经过农杆菌浸染后用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，然后切口向下平铺于表面盖有无菌滤纸的半固体共培养基CCM(见附录4)上(图lb)，24t:黑暗条件下培养3天。4、转基因愈伤组织的诱导将共培养3天的外植体切口向下转于转基因愈伤组织诱导培养基CIM(见附录5)上(图lc)，25°C、100iiEm—2s—1光照强度、16h光/8h暗的光周期条件下培养10天。5、转基因愈伤组织的筛选及继代待转基因愈伤组织初步形成后，将其转入转基因愈伤组织筛选培养基CSM(见附录6)筛选两周(图ld)，两周后将其从外植体的两端切下，转入相同的转基因愈伤组织筛选培养基上继续筛选，以后每隔两周，便将形成的转基因愈伤组织切成2mm的小块，转入新鲜的转基因愈伤组织筛选培养基上继代培养一次来保持转基因愈伤组织的旺盛生长。实施例2:大豆转基因愈伤组织转化效率试验选用我国主栽的"中黄13"大豆品转化，按照实施例1中介绍的获得大豆转基因愈伤组织的方法将含有GUS报告基因的双元表达载体pCAMBIA1301(购自CAMBIA公司)质粒的农杆菌LBA4404(农杆菌LBA4404购自中国科学研究院微生物研究所)浸染大豆下胚轴切段[双元表达载体pCAMBIA1301转化农杆菌LBA4404参见H6fgen和Wfillmitzer(1988)的方法]，外植体经过共培养后在转基因愈伤组织诱导培养基CIM(见附录5)诱导10天，待转基因愈伤组织初步形成后将其转入转基因愈伤组织筛选培养基CSM(见附录6)筛选2周，通过统计GUS报告基因阳性率确定外源基因的转化效率以及在一个外植体两端同时形成转基因愈伤组织的转化效率。GUS组织化学染色参考Bl咖e和Grierson(1997)的方法，染色时间为6小时，愈伤组织中的蓝色为报告基因GUS组织化学染色，表明外源基因已经整合到受体细胞的染色体中并表达，结果见表1。表l结果显示，供试的"中黄13"大豆品种有较高的转化效率，转化效率高达87.7%，远远高于目前所报道的大豆转基因愈伤组织的转化效率。另外，目前在诱导大豆转基因愈伤组织的研究中通常使用子叶节作外植体，结果只能在子叶节处诱导出一块愈伤组织，而本发明所使用的下胚轴切段外植体能够在其两端同时形成两块独立的转基因愈伤组织(图2)，转化效率为75.8%，说明本发明在农杆菌介导大豆转基因愈伤组织转化方法的独特性和高效性。表1大豆转基因愈伤组织的转化效率试验i纖批次浸染外植GUS阳性愈伤转化效率外植体两端的愈伤组外植体两端同时形体数组织的外植(%)织都显示GUS阳性的離基因愈伤组织体数外植体数的转化效率(%)1676191.15277.62544583.34074.13706288.65375.7平均87.775.8注(1)转化效率=GUS阳性愈伤组织的外植体数/浸染外植体数X100%;(2)外植体两端同时形成转基因愈伤组织的转化效率=外植体两端的愈伤组织都显示GUS阳性的外植体数/浸染外植体数X100%8实施例3:大豆转基因愈伤组织的获得在目的基因启动子活性检测中的应用选用我国主栽的"中黄13"大豆品种做实验材料，按照实施例1中介绍的获得大豆转基因愈伤组织的转化方法将含有"GmSARK启动子-GUS"融合基因的农杆菌LBA4404(农杆菌LBA4404购自中国科学研究院微生物研究所)浸染大豆下胚轴切段外植体[GmSARK启动子序列GeneBank登录号AY870314;"GmSARK动子-GUS"融合基因的构建参见本实验室李鹏丽等(李鹏丽，马媛媛，李小平，张丽文，王勇，王宁宁.大豆类受体蛋白激酶基因rlpk2启动子克隆及初步分析.植物生理与分子生物学学报，2006，32:315319.)的方法；rlpk2后被命名为GmSARK;"GmSARK启动子-GUS"融合基因转化农杆菌LBA4404参见H6fgen和Willmitzer(1988)的方法]，经过转基因愈伤组织的诱导和筛选，利用Blume和Grierson(1997)组织化学染色的方法，检测筛选4周后转基因愈伤组织中GmSARK启动子驱动的GUS基因是否能够表达。只有染色后呈现蓝色的愈伤组织中才有GUS报告基因的表达，也代表着GmSARK启动子在该愈伤组织中具有活性。染色时间为6小时，将材料的染色结果扫描成图片后保存。染色结果如图3:光周期16h光/8h暗条件下，在转化"GmSARK启动子-GUS报告基因"融合基因的大豆转基因愈伤组织中有很强的GUS活性，这与本实验室前期研究GmSARK启动子在微型番茄Micro-Tom的转基因愈伤组织有很高活性的结果是一致的[李鹏丽，马媛媛，李小平，张丽文，王勇，王宁宁.大豆类受体蛋白激酶基因rlpk2启动子克隆及初步分析.植物生理与分子生物学学报，2006，32:315319.(rlpk2后被命名为GmSARK)]。该实验结果也进一步验证了本发明的适用性、可靠性和高效性。该大豆转基因愈伤组织转化体系的建立，在大豆生物技术相关领域包括功能蛋白的定位、启动子活性的检测、大豆基因工程、细胞工程、代谢工程以及大豆遗传转化体系的建立提供了一条新的途径。附录1、YEP固体培养基成分蛋白胨10gL—、酵母膏10gL-、NaCl5gL—、琼脂粉15gL-、pH7.0。2、YEP液体培养基成分蛋白胨10gL—、酵母膏10gL—、NaCl5gL—、pH7.0。3、LM(液体浸染培养基)大量营养成份細3250mgL—、CaCl22H2015mgL—、MgS047H2025mgL—、(NH4)2S0413.4mgL—、NaH2P04H2015mgL—1;微量营养成份KIO.075mgL—SHsBOa0.3mgL—SMnSO**4H201.OmgL—SZnSO**7H200.2mgL—、Na2Mo042H200.025mgL—、CoCl26H200.0025mgL—、CuS045H200.0025mgL—、铁盐Na2-EDTA3.73mgL—、FeS047H202.78mgL—1;有机营养成份肌醇lOOmgL—、烟酸1.OmgL—、盐酸吡哆醇1.OmgL—、盐酸硫铵素10mgL—1;植物激素6-BA2.OmgL—、IBA0.2mgL—1;附加成份蔗糖30gL-、MES0.6gL-、乙酰丁香酮0.04gL-1;pH5.4。4、CCM(半固体共培养基)大量营养成份細3250mgL—、CaCl22H2015mgL—、MgS047H2025mgL—、(NH4)2S0413.4mgL—、NaH2P04H2015mgL—1;微量营养成份KI0.075mgL—、H3B040.3mgL—、MnS044H201.OmgL—、ZnS047H200.2mgL—、Na2Mo042H200.025mgL—、CoCl26H200.0025mgL—、CuS045H200.0025mgL—1;铁盐Na2-EDTA3.73mgL—、FeS047H202.78mgL—1;有机营养成份肌醇lOOmgL—、烟酸1.OmgL—1，盐酸吡哆醇1.OmgL—1，盐酸硫铵素lOmgL—1;植物激素6-BA2.OmgL-、IBA0.2mgL-1;附加成份:蔗糖30gL—、MES0.6gL-、0.04gL-1乙酰丁香酮，O.4gL—^-半胱氨酸，0.15gL—力TT，0.25gL—Aa^A,凝固剂琼脂粉5gL—、pH5.4。5、CIM(转基因愈伤组织诱导培养基)MS基本培养基，蔗糖30gL—、2，4-D2.OmgL—、6-BA0.5mgL—、MES0.6gL—、潮霉素lOmgL—、头孢霉素400mgL—、琼脂粉7gL—、pH5.8。6、CSM(转基因愈伤组织筛选培养基)MS基本培养基，蔗糖30gL—、2，4-D2.OmgL—、6-BA0.5mgL—、MES0.6gL—S潮霉素50mgL—、头孢霉素400mgL—、琼脂粉7gL—、pH5.8。7、MS基本培养基成分大量营养成份NH4N031650mgL—、KN031900mgL—、CaCl22H20440mgL—、MgS047H20370mgL—、KH2P04170mgL—1;微量营养成份KIO.83mgL—^H^C^6.2mgL—、MnS。4*4H2022.3mgL—、ZnS04*7H208.6mgL—、Na2Mo042H200.25mgL—、CuS045H200.025mgL—、CoCl26H200.025mgL—1;铁盐Na2-EDTA2H2037.3mgL—、FeS047H2027.8mgL—1;有机营养成份肌醇lOOmgL—、烟酸O.5mgL—、盐酸吡哆醇O.5mgL—、盐酸硫胺素0.lmgL—、甘氨酸2mgL—、[OO78]参考文献高越峰，荆玉祥，沈世华，田世平，匡廷云，SamuelS.M.SUN.高赖氨酸蛋白基因导入水稻及可育转基因植株的获得.植物学报，2001，43:506511.黄培堂，等译.《分子克隆实验指南》(第三版)，北京科学出版社，2002.姜楠，王东，崔征，郑英秀.异黄酮合成酶基因高表达的大豆转基因愈伤组织的研究沈阳药科大学学报，2009，26:6368.李鹏丽，马媛媛，李小平，张丽文，王勇，王宁宁.大豆类受体蛋白激酶基因rlpk2启动子克隆及初步分析.植物生理与分子生物学学报，2006，32:315319.夏玉凤.用于蛋白亚细胞定位研究的烟草愈伤组织培养条件优化，河北师范大学学报，2006，30:343345.邢莉萍，王华忠，蒋正宁，倪金龙，曹爱忠，于玲，陈佩度.小麦类甜蛋白基因的转化及转基因植株的抗病性分析.作物学报，2008，34:349354.Bl咖eB，GriersonD.ExpressionofACCoxidasepromoter_gusfusionsintomatoandnicotianaplumbaginifoliaregulatedbydevelopmentalandenvironmentalstimuli.PlantJournal,1997，12:731746.FernandoH.Valicente，NewtonP.etal.TransformationofMaizeEliteLineswithcrylCaofBacillusthuringiensistoControlSpodopterafrugiperda.6thPacificRimConferenceontheBiotechnologyofBacillusthuringiensisanditsEnvironmentalImpact.2005,8183.HincheeMA，ConnorWardDV，NewellCA.etal.ProductionoftransgenicsoybeanplantsusingAgrobacterium-mediatedDNAtransfer.Bio/Technology，1988，6:915922.H6fgenR，WillmitzerL.StorageofcompetentcellsforAgrobacteriumtransformation.NucleicAcidsResearch，1988，16:9877.JeffersonRA.Assayingchimericgenesinplants:theGUSgenefusionsystem.PlantMolecularBiologyReporter,1987，5:387405.LiuHK，YangC，WeiZM.EfficientAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofsoybeansusinganembryonictipregenerationsystem.Planta，2004,219:10421049.LodhiMA，YeGN，WeedenNF，ReischBI.AsimpleandefficientmethodforDNAextractionfromgrapevinecultivars，VitisspeciesandAmpelopsis.PlantMolecularBiologyReporter,1994，12:6—13.LuoG.，HepburnA，WidholmJ.Asimpleprocedurefortheexpressionofgenesintransgenicsoybeancallustissue.PlantCellReports,1994，13:632636.McCabeDE，SwainWF，MartinellBJ，ChristouP.Stabletransformationofsoybean(Glycinemax)byparticleacceleration.Bio/Technology，1988，6:923926.OlthoftPM，SomerDA.L-cysteineincreasesAgrobacterium-mediatedT-DNAdeliveryintosoybeancotyledonarynodecells.PlantCellReports,2001，20:706711.OlhoftPM，FlagelLE，DonovanCM.EfficientsoybeantransformationusinghygromycinBselectioninthecotyledonary_nodemethod.Planta，2003，5:723735.TrickHN，DinkinsRD，SantarnER，DiR，SamoylovV，MeurerCA，WalkerDR，ParrottWA，FinerJJ，CollinsGB.Recentadvancesinsoybeantransformation.PlantTissueCultureandBiotechnology,1997，3:926。权利要求一种快速获得大豆转基因愈伤组织的转化方法，具体包括以下步骤第一步外植体的制备首先将成熟的大豆种子用氯气熏蒸消毒2.5-5小时，然后将种子浸泡于含有0.8-1.5mgL-16-BA的无菌水中，28℃黑暗条件下萌发10-18小时之后，去除种皮、子叶、原叶和胚根，剩余的下胚轴切段作为待转化的外植体；第二步农杆菌工程菌液的制备及浸染将含有外源基因的农杆菌LBA4404单菌落接种于YEP液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养12小时；然后以1/100的比例扩大培养；待菌液的浓度达到OD600＝0.8后，4℃、4000rpm离心12分钟收集菌体，并将菌体重悬于液体浸染培养基中至OD600＝0.5，将上步制备好的外植体浸泡于菌液中浸染30分钟；第三步外植体与农杆菌共培养将第二步经过农杆菌浸染后的外植体用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，然后切口向下平铺于表面盖有无菌滤纸的半固体共培养基上，24℃黑暗培养3天；第四步转基因愈伤组织的诱导将第三步共培养3天的外植体切口向下转于转基因愈伤组织诱导培养基上，25℃、光照强度100μEm-2s-1、16h光/8h暗的光周期条件下培养10天；第五步转基因愈伤组织的筛选及继代待转基因愈伤组织初步形成后，将其转入转基因愈伤组织筛选培养基上，两周后将其从外植体的两端切下，转入相同的转基因愈伤组织筛选培养基上继续筛选，以后每隔两周，便将形成的转基因愈伤组织切成2mm的小块，转入新鲜的转基因愈伤组织筛选培养基上继代培养一次来保持转基因愈伤组织的旺盛生长。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第二步农杆菌浸染外植体使用的液体浸染培养基组分如下KN03250mgL—、CaCl22H2015mgL—、MgS047H2025mgL—、(NH4)2S0413.4mgL—、NaH2P04H2015mgL—、KI0.075mgL—、H3B040.3mgL—、MnS044H201.OmgL—1，ZnS047H200.2mgL—、Na2Mo042H200.025mgL—、CoCl26H200.0025mgL—、CuS045H200.0025mgL—、Na2_EDTA3.73mgL—、FeS047H202.78mgL—、肌醇lOOmgL—、烟酸1.OmgL—、盐酸吡哆醇1.OmgL—、盐酸硫铵素lOmgL—、蔗糖30gL—、MES0.6gL—、6-BA2.OmgL—、IBAO.2mgL—、0.04gL—1乙酰丁香酮，pH5.4。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第三步农杆菌与外植体共培养的半固体共培养基组分如下KN03250mgL—、CaCl22H2015mgL—、MgS047H2025mgL—、(NH4)2S0413.4mgL—、NaH2P04H2015mgL—、KI0.075mgL—、H3B040.3mgL—、MnS044H201.OmgL—1，ZnS047H200.2mgL—、Na2Mo042H200.025mgL—、CoCl26H200.0025mgL—、CuS045H200.0025mgL—、Na2_EDTA3.73mgL—、FeS047H202.78mgL—、肌醇lOOmgL—、烟酸1.OmgL—1，盐酸吡哆醇1.OmgL—1，盐酸硫铵素lOmgL—、蔗糖30gL-、MES0.6gL-、6-BA2.OmgL—1，IBAO.2mgL—、L_半胱氨酸0.4gL—、DTT0.15gL—、Na2S2030.25gL—、乙酰丁香酮0.04gL—、琼脂粉5gL—、pH5.4。4.根据权利要求l所述的方法，其特征在于，第四步所述的转基因愈伤组织诱导培养基为MS基本培养基+蔗糖30gL—、2，4-D2.OmgL—"+6-BA0.5mgL—"+MES0.6gL—^潮霉素lOmgL—^头孢霉素400mgL—^琼脂粉7gL—、pH5.8。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第五步所述的转基因愈伤组织筛选培养基为MS基本培养基+蔗糖30gL—、2，4-D2.OmgL—"+6-BA0.5mgL—"+MES0.6gL—^潮霉素50mgL—^头孢霉素400mgL—^琼脂粉7gL—、pH5.8。6.权利要求1所述方法获得的大豆转基因愈伤组织在大豆生物技术相关领域包括功能蛋白的定位、启动子活性的检测、大豆基因工程、细胞工程、代谢工程以及大豆遗传转化体系的建立中的应用。全文摘要一种快速获得大豆转基因愈伤组织的转化方法，利用该方法可以成功解决外源基因难以导入大豆的难题。本发明以大忆豆下胚轴切段为外植体，用含有外源基因的根癌农杆菌浸染后共培养，将共培养后的外植体经过转基因愈伤组织的诱导和筛选后统计转基因愈伤组织的转化效率高达87.7％。该转化方法的外植体制备简单、实验流程短、转化效率高。该大豆转基因愈伤组织转化体系的建立，在大豆生物技术相关领域包括功能蛋白的定位、启动子活性的检测、大豆基因工程、细胞工程、代谢工程以及大豆遗传转化体系的建立等方面有广泛的应用价值。文档编号C12N15/84GK101717786SQ20091022911公开日2010年6月2日申请日期2009年12月11日优先权日2009年12月11日发明者刘栋,常大松,王宁宁,石强,龚清秋申请人:南开大学